Штами S. peucetius – продуцента антрациклінів, охарактеризовані за ознаками стійкості до антибіотиків та антибіотичною активністю. Створено та охарактеризовано колекцію мутантів стійких до хлорамфеніколу (CML), даунорубіцину (DNR) та доксорубіцину (DXR).
При низкой оригинальности работы "Конструювання та селекція штаму Streptomyces peucetius subsp. caesius - продуцента даунорубіцину та доксорубіцину", Вы можете повысить уникальность этой работы до 80-100%
Висока вартість цих препаратів насамперед зумовлена відносно низькою антибіотичною активністю штамів - продуцентів та їх здатністю синтезувати складні суміші кінцевих продуктів, серед яких лише декілька становлять терапевтичну цінність. Це безпосередньо стосується і штамів Streptomyces peucetius - продуцентів даунорубіцину (DNR) та доксорубіцину (DXR)-антрациклінових антибіотиків, які широко використовуються в хіміотерапії онкологічних захворювань. Високий рівень продукції антибіотиків актиноміцетами обумовлений не лише експресією генів біосинтезу, але й залежить від генів резистентності як до власного, так і до інших антибіотиків. Відсутність достатньої бази даних у цьому напрямку обмежує можливості розробки методів підвищення біосинтезу DNR та DXR штамами - продуцентами. Для досягнення цієї мети були поставлені такі завдання: - вивчити антибіотичну активність та стійкість штамів S. peucetius ATCC 29052 та S. peucetius subsp. caesius ATCC 27952 до антибіотиків з різним механізмом дії і порівняти ознаки стійкості у цих штамів та у S. globisporus 1912 - продуцента ангуциклінового антибіотика ландоміцину Е;Визначення рівня та спектрів стійкості штамів до антибіотиків проводили на мінімальному середовищі (МС) [Hopwood et al., 1985.]. Визначення резистентності штамів до антибіотиків та відбір антибіотик резистентних мутантів проводили як описано [Настасяк и др., 1990]. Штам 27952 на вказаних середовищах утворює три типи колоній: 27952-1 - з білим (21 % клонів), 27952-2 - з сірим (48 % клонів) і 27952-3 - із світло - сірим забарвленням спор (31 % клонів). Проте, серед варіантів штаму 27952 вищою стійкістю до ACT D та DNR володіє штам 27952-1 з середнім рівнем антибіотичної активності, а серед варіантів штаму 20050-штам 29050-1 з низьким значенням антибіотичної активності. Регенерація протопластів штаму 27952-2 супроводжується збільшенням частоти клонів з низькими значеннями антибіотичної активності, що не перевищують 100 % активності вихідного штаму, а після злиття протопластів зростає кількість клонів з антибіотичною активністю, близькою до її середнього значення у вихідному штамі.Охарактеризовано ознаки стійкості до антибіотиків трьох штамів - продуцентів ароматичних полікетидів, що мають протипухлинну активність - S. peucetius ATCC 29052, S. peucetius subsp. caesius ATCC 27952 (продуценти антрациклінів) та S. globisporus 1912 (продуцент ангуциклінового антибіотика - ландоміцину Е). Штам 27952-3 характеризується найвищою середньою антибіотичною активністю, а штам 27952-2 - найвищими ступенем варіабельності рівня антибіотичної активності та часткою “плюс” - варіантів. Біосинтез антрациклінів у мутантів, стійких до інгібування їх росту підвищеною концентрацією глюкози (glr) менше підлягає глюкозній репресії, а у 17 % glr - мутантів зростає рівень синтезу антрациклінів. Встановлено, що у таких мутантів виникають зміни у стійкості до ряду антибіотиків та біосинтезі антрациклінів. Отримано мутанти цього штаму, здатні рости на повноцінних середовищах з 2-5 % глюкози (glr - мутанти), на яких не ріс вихідний штам.
План
Основний зміст
Вывод
В результаті виконаної роботи розроблено методи генетичного та генно - інженерного конструювання штамів S. peucetius - продуцентів DNR та DXR. Порівняно ознаки стійкості у цих штамів та у S. globisporus 1912- продуцента протипухлинного антибіотика ландоміцину Е. Досліджено звязок між антибіотикорезистентністю та антибіотичною активністю у штамів S. peucetius.
1. Охарактеризовано ознаки стійкості до антибіотиків трьох штамів - продуцентів ароматичних полікетидів, що мають протипухлинну активність - S. peucetius ATCC 29052, S. peucetius subsp. caesius ATCC 27952 (продуценти антрациклінів) та S. globisporus 1912 (продуцент ангуциклінового антибіотика - ландоміцину Е). Штами відрізняються чутливістю до тетрацикліну, хлорамфеніколу, аміноглікозидів, макролідів, лінкоміцину, рифампіцину, актиноміцину D, даунорубіцину та доксорубіцину. Всі штами мають вищий рівень стійкості до доксорубіцину (DXR), ніж до спорідненого антибіотика даунорубіцину (DNR).
2. Вивчено мінливість морфологічних варіантів S. peucetius ATCC 29050 (29050-1 та 29050-2) і S. peucetius subsp. caesius ATCC 27952 (27952-1, 27952-2 та 27952-3) за рівнем антибіотичної активності. Штам 27952-3 характеризується найвищою середньою антибіотичною активністю, а штам 27952-2 - найвищими ступенем варіабельності рівня антибіотичної активності та часткою “плюс” - варіантів. Лише морфологічні варіанти штаму 27952 синтезують хроматографічно тестовані DNR та DXR, але видрізняються якісним складом антрациклінових сполук та стійкістю до DNR. Штами 27952-1 та 27952-2 утворюють DXR, а 27952-3- DNR i DXR.
3. Глюкоза інгібує ріст та антибіотичну активність штаму 27952-2 за умови його культивування в повноцінних середовищах, що містять альтернативні джерела вуглецю. Біосинтез антрациклінів у мутантів, стійких до інгібування їх росту підвищеною концентрацією глюкози (glr) менше підлягає глюкозній репресії, а у 17 % glr - мутантів зростає рівень синтезу антрациклінів.
4. Отримано і вивчено колекцію мутантів штаму 27952-2, стійких до рубоміцину (DNRR), доксорубіцину (DXRR) та хлорамфеніколу (CMLR). Встановлено, що у таких мутантів виникають зміни у стійкості до ряду антибіотиків та біосинтезі антрациклінів. У геномі DNRR - мутантів виявлено хромосомні перебудови. Встановлено, що серед DNRR- та НГ- індукованих CMLR - мутантів, доцільно вести пошук штамів з підвищеною продукцією DXR, тоді як DXRR - мутанти перспективні для відбору штамів з підвищеною продукцією DNR та DXR.
5. Вперше встановлено, що ряд DNRR - мутантів штаму 27952-2 здатні утворювати DXR з доданого DNR. Подібного ефекту можна досягнути шляхом введення генів cpx та DNRI (кодують С-14-гідроксилазу та активатор транскрипції) S. griseus IMET3339 в складі висококопійної рекомбінантної плазміди PIJ486 у штам 27952-2. Такий підхід також спричинює зростання рівня сумарного синтезу антрациклінів, DNR та DXR.
6. Вперше встановлено, що одним з механізмів стійкості штаму 27952-2 до DNR є його ферментативне перетворення з утворенням менш токсичної сполуки - DXR. Таке явище дозволило створити простий спосіб отримання більш цінного антибіотика DXR з його попередника DNR.
Перелік наукових праць, опублікованих за матеріалами дисертації
1. Л. П. Дубицька, В. О. Федоренко. Характеристика мутантів Streptomyces peucetius subsp. caesius ATCC 27952, стійких до антрациклінових антибіотиків // Мікробіол. журн. -2001.- Т.63, №4. - С. 53-61.
2. Л. Дубицька, С. Заворотна, Б. Осташ, О.Громико, Л. Басілія, В. Федоренко. Характеристика ознак стійкості до антибіотиків у продуцентів протипухлинних антибіотиків Streptomyces globisporus 1912, Streptomyces peucetius ATCC 29050 та Streptomyces peucetius subsp. caesius ATCC 27952 // Вісник Львів. ун-ту. Серія біологічна. - 2000. - Вип. 25. - С.49-60.
3. Федоренко В. О., Л.І. Басілія, К. О. Панькевич, Л. П. Дубицька, Б. О. Осташ, А. М. Лужецький, О. М. Громико, Г. Крюгель. Генетичний контроль біосинтезу актиноміцетами протиракових антибіотиків - полікетидів // Бюл. ін-ту. сільгосп. мікробіол. - 200. - №8 -С. 27 - 31.
4. Дубицька Л. П., Федоренко В. О. Спосіб отримання штамів Streptomyces peucetius subsp. caesius з підвищеними синтезом доксорубіцину та здатністю до перетворення даунорубіцину в доксорубіцин // Проблеми винахідництва та раціоналізаторства в Україні. - 2001. - С. 64 - 67.
5. Дубицька Л. П., Федоренко В. О. Характеристика мутантів штаму Streptomyces peucetius subsp. caesius ATCC 27952-2, стійких до хлорамфеніколу // Вісник Львів. ун-ту. Серія біологічна. - 2002. - Вип.28. - С.105 - 113.
6. Дубицька Л. П., Федоренко В. О. Конструювання штамів Streptomyces peucetius subsp. caesius ATCC 27952-2 з підвищеною здатністю до перетворення даунорубіцину в доксорубіцин // Біополімери і клітина. - 2002. - Т18,№2. - С. 91 - 95.
7. L. P. Dubitcka The isolation and characterization of doxorubicin overproducing strains of Streptomices peucetius subsp. caesius ATCC 27952-2 // Molecular genetics, genetics of microorganisms and higher eucariotes. - 2001. - P. 88.
8. L. P. Dubitcka The creation the strains of Streptomyces peucetius with high level of doxorubicine production by the cloning of the cpx and DNRI genes of Streptomyces griseus into those strains // Conference on genetics and molecular biology. - 2000. - P.49.
9. L.P. Dubitcka. The isolation and characterization of antracycline overproducing strains of Streptomyces peucetius subspecius caesius ATCC 27952 by the rational selection aproach // 9THEMSA International Scientific Symposium. - 2000. - C. 120. антибіотик штам стійкість антрацикліни
Дубицька Л. П. Конструювання та селекція штаму Streptomyces peucetius subsp. caesius - продуцента даунорубіцину та доксорубіцину. - Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.15 - генетика.- Інститут клітинної біології і генної інженерії НАН України, Київ, 2002.
Штами S. peucetius - продуцента антрациклінів, охарактеризовані за ознаками стійкості до антибіотиків та антибіотичною активністю. Створено та охарактеризовано колекцію мутантів стійких до хлорамфеніколу (CML), даунорубіцину (DNR) та доксорубіцину (DXR). Показано доцільність пошуку штамів з підвищеною продукцією DXR серед НГ - індукованих CMLR - та DXRR - мутантів, а DNR та DXR - серед DNRR - мутантів. Отримано мутанти цього штаму, здатні рости на повноцінних середовищах з 2-5 % глюкози (glr - мутанти), на яких не ріс вихідний штам. Антибіотична активність glr- мутантів в меншій мірі, ніж у 27952-2 підлягає глюкозній репресії, а у 17 % glr - мутантів зростає рівень синтезу антрациклінів. Показано, що одним з механізмів стійкості штаму 27952-2 до DNR є його ферментативна інактивація, з утворенням менш токсичної сполуки- DXR. DNRR - мутанти штаму 27952-2 (з підвищеним синтезом DXR) та отримані трансформанти 27952-2 PIJ486 , S. lividans TK24 PIJ486 (які несуть гени cpx - С-14-гідроксилаза, що каталізує утворення DXR з DNR, та DNRI- активатор транскрипції) утворюють DXR з доданого до 48 годинних культур цих штамів DNR. У 27952-2 PIJ486 зростає також синтез антрациклінів, DNR та DXR.
Дубицкая Л. П. Конструирование и селекция штамма S. peucetius subsp. caesius продуцента даунорубицину и доксорубицину. - Руккопись.
Диссертация на соискание учоной степини кандидата биологических наук по специальности 03.00.15-генетика.- Институт клеточной биологии и генной инженерии НАН Украины, Киев, 2002.
Штаммы S. peucetius - продуцента антрациклинов, охарактеризованы по признакам устойчивости к антибиотикам и антибиотической активности. Создана и охарактеризована коллекция мутантов штамма 27952-2 устойчивых к хлорамфениколу (CML), даунорубицину (DNR) и доксорубицину (DXR). Показана перспективность поиска штаммов с повышенной продукцией DXR среди НГ- индуцированних CMLR- и DXRR - мутантов, а DNR и DXR среди DNRR-мутантов. Получены мутанты штамма 27952-2, способные расти на полноценных средах с 2 - 5 % глюкозы (glr - мутанты), на которых не растет исходный штамм. Антибиотическая активность glr - мутантов в меньшей степени, чем у штамма 27952-2 подвержена глюкозной репрессии, а у 17 % иследованих glr - матантов возрастает уровень синтеза антрациклинов. Показано, что одним из механизмов устойчивости штамма 27952-2 к DNR является его ферментативная инактивация, с образованием менее токсичного соединения - DXR. DNRR - мутанты штамма 27952-2 (с повышенным синтезом DXR) и полученные трансформанты 27952-2 PIJ486 , S. lividans TK24 PIJ486 (которые содержат гены cpx - С14-гидроксилаза, катализирующая превращени DNR в DXR и dnr - активатор транскрипции) образуют DXR из DNR, добавленного к 48-часовым культурам этих штаммов. У штаммов 27952-2 PIJ486 также возрастает суммарный синтез антрациклинов, DNR и DXR.
Dubitcka L. P. Construction and selecthion strain S. peucetius subsp. caesius production daunorubicin and doxorubicin - Manuscript.
The Candidate Thesis for a Phylosophy Degree by speciality 03.00.15 - Genetics. - Institute of cell biology and gene enginery, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2001.
The strains S. peucetius subsp. caesius ATCC 27952 anthracikline producer, was characterized by resistance to antibiotics and antibiotical activites. The collection of 27952 mutants resistant to chloramphenicol (CML), daunorubicin (DNR) and doxorubicin (DXR) was created and characterized.
Cmlr - mutants demonstrate decreased total antibiotic activity in comparison to strain 27952-2. However 92,8 % cmlr - mutants, obtained after N-metyl-N/-nitro-N-nitrozoguanidin treatment of strain 27952-2 synthesized DXR and its intermediates. Two mutants among them are characterized by increasing of DXR production level.
It has found that strain S. peucetius subsp. caesius ATCC 27952-2 is much more resistant to DXR than to DNR. The majority of DNRR - mutants (76,9 %) were characterized by resistance to DXR, while such mutants among DXRR - mutants which prossess are cross-resistance to DNR (below 30 %). The mean value of antibiotic activity was the highest among DXRR - mutants induced by NG and sampled in the medium with 30 mg/ml of DXR. The majority of the tested DNRR - and DXRR - mutants (13 of 15) synthesized 1,8 -10,9 times more of anthracycline compounds as compared with the initial strain.
All the mutants synthesized 2,6 - 28,3 and 1,6 - 20,7 times more of DNR and DXR, respectively, than the initial strain. In the result we obtained the proof that it is expedient to search for the strains with high production of DXR among DNRR - mutants, while DXRR - mutants are promising for choosing the producers of the both antibiotics.
The growth of strain 27952-2 is inhibited by presence of glucose on the complete media, containing alternative carbon sources. Number of clones with no antibiotic activity increases to 80,2 % along with elevation of glucose concentration in the corn meal medium from 0,1 to 1,0 %. S. peucetius subsp. caesius ATCC 27952-2 mutants capable of growing on the complete media with 2 % of glucose (glr - mutants) are obtained. Glr - mutants have decreased antibiotic activity in comparison to strain 27952-1. 17 % of studied glr - mutants synthesize 1,6 - 3,1 - fold quantities of anthracyclines in comparison with parental strain. Glr - mutants form large quantity of biomass, although more slowly utilize glucose then strain 27952-2.
Genes cpx and DNRI (encode citochrome P-450 enzyme that hydroxilaize DNR converting it to DXR and transcription activator, respectively) from leukaemomycin biosynthesis gene cluster of S.griseus were cloned in multicopy plasmid PIJ486 under control of strong promoter nat (from noursethricin resistance gene of S. noursei) and introduced into strains S. peucetius subsp. caesius ACC 27952-2 and S. lividans TK24 (27952-2 PIJ486 and TK24 PIJ486 ) .
48-hous old cultures of strains 27952-2 PIJ486 , TK24 and DNRR - mutants of strain 27952-2 synthesize DXR from exogenously added DNR. In strain 27952-2 PIJ486 production of antracyclines, DNR and DXR was increased. Besides, quantity of converted DNR and concentration of P-450 hydroxylase was the highest in DNRR - mutants of strain 27952-2.
Thus, resistance of DNRR - mutants to DNR depends not only on functioning of resistance gene but also on the conversion from more toxic for given strain compound (DNR) to less toxic (dxr). It allows to obtain more valuable antibiotic from its intermediate.
