Кон’югат анти-VEGF з гематопорфірином як засіб підвищення ефективності фотодинамічної терапії - Автореферат

Останніми десятиріччями в онкологічну практику увійшов малотравматичний метод лікування хворих на злоякісні новоутворення - фотодинамічна терапія (ФДТ), який відрізняється від традиційних методів лікування, таких як променева та хіміотерапія, високою вибірковістю ураження пухлинної тканини, відсутністю місцевих та системних ускладнень. Особливого зацікавлення набуває проблема застосування препаратів таргетної терапії, поєднаних з фотосенсибілізаторами, мішенями дії яких була б васкулярна система пухлин, та розробка способів цілеспрямованої доставки таких препаратів до судин, що активно формуються в пухлині (Hanahan D. et al., 2000; Folkman J. В свою чергу, антитіла до VEGF цілеспрямовано доставляють фотосенсибілізатор в зону інтенсивного неоангіогенезу, тобто в пухлину, де фотодинамічна терапія може супроводжуватися як антиваскулярною, так і антиангіогенною дією. Так, дані літератури (Rak J. et al., 1995) свідчать саме про ритмічний характер секреції пухлинами VEGF протягом доби, що відкриває можливість підвищити ефективність фотосенсибілізації пухлин за рахунок введення в організм судинотропних сенсибілізаторів у період підвищеної концентрації фактора та рецепторів до нього у пухлинній тканині. Викладене свідчить про актуальність проведення досліджень, які дозволили б не тільки оцінити ефективність таргетної антиангіогенної ФДТ із застосуванням конюгату на основі гематопорфірину та антитіл до VEGF, але й підвищити ефективність фотосенсибілізації пухлин за рахунок введення в організм судинотропного фотосенсибілізатора у період підвищення концентрації VEGF у пухлинній тканині.При дослідженні фотодинамічної активності конюгату in vivo в якості експериментальних моделей пухлин використовували вихідний штам карциноми Льюїс LLC та її модифікований варіант LLC/R-9, саркому 180 та меланому В16. Синтез конюгату проводили за допомогою лінкеру карбодііміда-HCL за наступною схемою: 20 мг гематопорфірину розчиняли в 3 мл розчинника (вода-диметилформамід, 2,5:0,5). Протипухлинну фотодинамічну активність конюгату вивчали у мишей з саркомою 180, карциномою Льюїс (вихідний високометастазуючий штам LLC та її варіант LLC/R9 - низькометастазуюча лінія, отримана в результаті селективного впливу цисплатину in vivo після 9-ти послідовних курсів хіміотерапії з його застосуванням) та меланомою В16. Враховуючи дані стосовно добових коливань вмісту VEGF та накопичення конюгату в пухлинах мишей (карцинома Льюїс та саркома 180), проводили ритмоорієнтовану ФДТ мишей з цими пухлинами за наступною схемою: конюгований з антитілами до VEGF гематопорфірин та вихідний фотосенсибілізатор вводили мишам в вищезазначених дозах внутрішньочеревинно в час максимального (о 1400) та мінімального (о 200) вмісту VEGF в пухлинах. При дослідженні рівня накопичення конюгату (через 24 год. після внутрішньочеревинного його введення) в пухлинах та тканинах організму з пухлиною (саркома 180 та карцинома Льюїс) методом флуориметрії в гомогенатах цих тканин встановлено, що флуоресценція, індукована присутністю конюгату, спостерігається в пухлинах та органах (шкіра, печінка, нирки) мишей через добу після його інєкції.Отримано активний фотосенсибілізуючий агент - конюгат гематопорфірину з антитілами до VEGF, досліджено його спектри поглинання в діапазоні хвиль 190-690 нм, фототоксичність та специфічну активність в реакції антиген-антитіло. Отриманий конюгат зберігає фізичні та біологічні властивості, притаманні окремо білковому компоненту конюгату - антитілам і хромофорній частині - гематопорфірину. Встановлено, що конюгат проявляє вищу селективність до пухлин в порівнянні з нормальними тканинами та значно більше накопичується в пухлинній тканині по відношенню до нативного гематопорфірину. Виявлено, що в хоріон-алантоїсних мембранах курячих ембріонів в період інтенсивного формування кровоносних судин (6-й день розвитку ембріонів), накопичувалося в 3,6 рази більше конюгату в порівнянні з накопиченням вихідного гематопорфірину, що дає підстави для твердження про судинотропні властивості конюгату.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Експериментальними дослідженнями в порівнянні з вихідним гематопорфірином доведена ефективність фотодинамічної терапії пухлин при використанні судинотропного фотосенсибілізатора - конюгату гематопорфірину з антитілами до фактора росту ендотеліальних клітин (VEGF).

1. Отримано активний фотосенсибілізуючий агент - конюгат гематопорфірину з антитілами до VEGF, досліджено його спектри поглинання в діапазоні хвиль 190-690 нм, фототоксичність та специфічну активність в реакції антиген-антитіло.

2. При визначенні фотоцитотоксичності отриманого імуноконюгату встановлено, що еквівалентні концентрації конюгату і вихідного фотосенсибілізатора-гематопорфірина є рівноактивними. Отриманий конюгат зберігає фізичні та біологічні властивості, притаманні окремо білковому компоненту конюгату - антитілам і хромофорній частині - гематопорфірину. Встановлено, що конюгат проявляє вищу селективність до пухлин в порівнянні з нормальними тканинами та значно більше накопичується в пухлинній тканині по відношенню до нативного гематопорфірину.

3. Виявлено, що в хоріон-алантоїсних мембранах курячих ембріонів в період інтенсивного формування кровоносних судин (6-й день розвитку ембріонів), накопичувалося в 3,6 рази більше конюгату в порівнянні з накопиченням вихідного гематопорфірину, що дає підстави для твердження про судинотропні властивості конюгату.

4. Під дією ФДТ з використанням створеного конюгату спостерігається підвищений рівень фактору v. Willebrand в сироватці крові тварин з пухлинами за рахунок його виходу у кровяне русло в результаті руйнації ендотеліальних клітин судин пухлин.

5. Встановлено, що гальмування росту перещеплених пухлин (карцинома Льюїс, саркома 180 та меланома В16) є вищим при використанні конюгованого гематопорфірину в порівнянні з вихідним фотосенсибілізатором (23 %, 22 % та 24 % відповідно). Виживаність тварин з карциномою Льюїс та саркомою 180, яким проводили ФДТ із застосуванням конюгату дорівнює 40 % по відношенню до групи тварин, які отримували вихідний гематопорфірин. ФДТ з конюгованим гематопорфірином тварин з карциномою Льюїс призводить до зменшення як загальної кількості метастазів (в 2,5 рази), так і обєму метастатичного ураження

6. (в 4 рази).

7. Виявлено, що проведення ФДТ із використанням конюгату тваринам з карциномою Льюїс та саркомою 180 о 1400 (за умов найвищого вмісту VEGF в сироватці крові) призводить до більшого гальмування росту пухлин у порівнянні з групою тварин, яких опромінювали в час доби із зниженим вмістом VEGF в сироватці крові (о 200 доби)

1. Мамчур А. А Фотоактивні біоконюгати для цілеспрямованої фотодинамічної терапії пухлин / А. А. Мамчур, І. О Лісняк, Н. Л. Новиченко // Онкология. - 2008. - Т. 10, № 2. - С. 206-212. (Особистий внесок дисертанта: проведений аналіз літературних джерел, підготовлено матеріал до друку).

2. Study of photodynamic efficiency of the hematoporphyrin conjugated with antibody to VEGF in mouse Lewis carcinoma / N. L. Novichenko, A. A. Mamchur, I. O. Lisniak, M. F. Gamaliya // Experimental Oncology. - 2008. - Vol. 30, № 4. - Р. 315-318. (Особистий внесок дисертанта: проведені досліди на тваринах по визначенню ефективності ФДТ із застосуванням конюгованого з антитілами проти фактору росту ендотеліальних клітин, статистична обробка результатів)

3. Фактор v. Willebrand у сироватці крові як показник руйнування судин пухлини під впливом цілеспрямованої антиангіогенної фотодинамічної терапії / І. О. Лісняк, А. С. Тимченко, А. А. Мамчур, Н. Л. Новиченко, М. Ф. Гамалія // Гематологія та переливання крові : зб. - 2008. - № 34. - С. 259-263. (Особистий внесок дисертанта: проведені роботи по перещепленню пухлин експериментальним тваринам, отриманню сироватки крові, підготовлено матеріал до друку).

4. Отримання та властивості фотоактивного імуноконюгату гематопорфірину з антитілами до фактору росту ендотеліальних клітин / І. О. Лісняк, Н. Л. Новиченко, А. А. Мамчур, М. Ф. Гамалія // Біополімери і клітина. - 2009. - Т. 25, № 1. - С. 56-61. (Особистий внесок дисертанта: проведено визначення фотоцитотоксичності конюгованого гематопорфірину, визначено рівень накопичення конюгату в зонах неоангіогенезу, підготовлено матеріал до друку).

5. Визначення розподілу імуноконюгату гематопорфірину в тканинах мишей та аналіз добових коливань його накопичення пухлинами / М. Ф. Гамалія, І. В. Прокопенко, І. О. Лісняк, Є. Д. Шишко, А. А. Мамчур, В. В. Холін // Фотобіологія та фотомедицина. - 2010. - T. 8, № 1-2. - С. 76-79. (Особистий внесок дисертанта: проведені роботи по перещепленню пухлин, проведенню лазерного опромінення, вилученню органів та пухлин для подальшого вивчення накопичення в них конюгату).

6. Рішення про видачу патенту на винахід. Спосіб фотодинамічної терапії злоякісних пухлин / Гамалея М. Ф., Лісняк І. О., Шишко Є. Д., Прокопенко І. В., Мамчур А. А. ; заявник та патентовласник Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України. - 201009186 ; заявл. 21.07.2010. (Особистий внесок дисертанта: проведені роботи по перещепленню пухлин експериментальним тваринам, отриманню сироватки крові, проведенню лазерного опромінення, підготовлено матеріал для оформлення патенту).

7. Лісняк І. О. Новий антитілоконюгований сенсибілізатор для фотодинамічної терапії пухлин / І. О. Лісняк, А. А. Мамчур, Н. Л. Новиченко // Материалы XXVIII междунар. науч.-практ. конф. «Применение лазеров в медицине и биологии», (Харьков, 19-22 мая 2007 г.). - Харьков, 2007. - С. 93-94.

8. Протипухлинна фотодинамічна активність гематопорфірину, конюгованого з антитілами до фактору росту ендотеліальних клітин (VEGF) / І. О. Лісняк, А. А. Мамчур, М. Ф. Гамалія, Є. Д. Шишко, Н. Л. Новиченко, І. В. Прокопенко // Материалы XXIX междунар. науч.-практ. конф. «Применение лазеров в медицине и биологии», (Харьков, 21-24 мая 2008 г.). - Харьков, 2008. - С. 122-123.

9. Мамчур А. А. Фотодинамічна активність гематопорфірину, конюгованого з антитілами до VEGF / А. А. Мамчур, І. О. Лісняк, Н. Л. Новиченко // Сучасні проблеми експериментальної і клінічної онкології : тези ІХ міжнар. конф. молодих онкологів, 23-24 квіт. 2008 р. - К., 2008. - С. 81.

10. Застосування конюгованого з антитілами проти VEGF гематопорфірину в таргетній антиангіогенній фотодинамічній терапії / А. А. Мамчур, І. О. Лісняк, Є. Д. Шишко, В. В. Холін, М. Ф. Гамалія // Применение лазеров в медицине и биологии : материалы ХХХІІ Междунар. науч.-практ. конф. IV Шахбазовские чтения, (Гурзуф, 7-10 октяб. 2009 г.).- Гурзуф, 2009. - С. 126-128.

Размещено на .ru