Комплексное биохимическое исследование токсикологических и фармакологических свойств препарата из биомассы культуры ткани полисциаса папоротниколистного - Автореферат

Провести оценку возможных проявлений различных видов токсичности препарата из биомассы культуры ткани полисцаса папоротниколистного в зависимости от пути его введения, дозы, длительности назначения и функционального состояния организма подопытных животных. Исследовать биохимические и гистологические характеристики наличия и выраженности гепатопротекторного эффекта препарата из биомассы культуры ткани полисциаса папоротниколистного при назначении животным с экспериментальным тетрахлорметановым гепатитом, а также его антиоксидантные свойства при данной свободно-радикальной патологии. Провести комплексное биохимическое, массаметрическое, функциональное и гистологическое исследование эффективности применения препарата из биомассы культуры ткани полисциаса папоротниколистного при экспериментальных эндокринопатиях - посткастрационном гипогонадизме, аллоксановом диабете, тироксиновом гипертиреозе, мерказолиловом гипотиреозе. Использованный комплекс регистрируемых хронометрических параметров и их производных величин при выполнении подопытными животными различных модификаций плавательного теста убедительно свидетельствует о выраженных актопротекторных свойствах препарата из биомассы культуры ткани полисциаса папоротниколистного, не уступающих по значениям большинства показателей соответствующим характеристикам данного действия препарата из биомассы женьшеня. Биохимический анализ состояния перекисного окисления липидов в печеночной ткани крыс при моделировании тетрахлорметанового гепатита подтверждает наличие антиоксидантного эффекта у препарата из биомассы культуры ткани полисциаса папоротниколистного, превосходящего по выраженности таковой у препарата из биомассы женьшеня.

По теме диссертации опубликованы 95 печатных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 328 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, данных собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 303 отечественных и 147 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 50 рисунками и 70 таблицами, включенными в Приложение.

Материалы и методы исследования

Технология приготовления препаратов, назначаемых лабораторным животным, состояла из нескольких этапов. Первоначально из биомассы культуры ткани полисциаса папоротниколистного и женьшеня методом перколяции получали настойки при соотношении сырье: экстрагент 1: 10 на 40% -ом этаноле. Перед непосредственным применением их деалкоголизировали упариванием на роторном испарителе до каломельного состояния, после чего в колбу добавляли дистиллированную воду для получения необходимой концентрации препарата, которая была различной при оценке безопасности и фармакологической активности.

Для выполнения программы запланированных исследований были использованы лабораторные животные различных видов. Выбор вида и количества животных определялся спецификой и объемами выполняемых экспериментов, обеспечивающими условия для корректного сравнительного анализа оцениваемых свойств испытуемого и "эталонного" препаратов. Итоговые количества включенных в опыты животных составили: мыши - 160, морские свинки - 240, кролики - 50, крысы-самки - 42, крысы-самцы - 950.

Объектом проведенных исследований служили: биохимических: цельная кровь, эритроциты, сыворотка крови, моча, семенная жидкость, гомогенаты печени, сердца, мозга, скелетной мышцы, селезенки, тонкой кишки, стенки аорты, поджелудочной железы;

гематологических: цельная кровь;

массаметрических: печень, почки, легкие, сердце, селезенка, надпочечники, щитовидная железа, семенники, семенные пузырьки, предстательная железа;

гистологических: желудок, тонкая кишка, печень, почки, сердце; цитологических и морфометрических - семенники и семенные пузырьки.

Все манипуляции по взятию биологических субстратов проводились только после обязательного наркотизирования подопытных животных эфиром или тиопенталом натрия.

Оценка безопасности исследуемого препарата включала определение количественных параметров его острой токсичности, возможных проявлений хронической токсичности, аллергизирующего действия, эмбриотоксичности и мутагенности.

Анализ наличия и выраженности фармакодинамических характеристик препарата из биомассы полисциаса папоротниколистного по сравнению с соответствующими свойствами препарата женьшеня аналогичной биотехнологии проводился по результатам их назначения животным с различными экспериментальными патологиями и состояниями. Комплекс последних включал: предельные плавательные нагрузки, острую гипоксическую гипоксию, тетрахлорметановый гепатит, перекисную модель атеросклероза, радиационную патологию, аллоксановый диабет, посткастрационный гипогонадизм, тироксиновый гипертиреоз, мерказолиловый гипотиреоз.

Методы исследования

Физиологические. При изучении возможных проявлений хронической токсичности препарата из биомассы полисциаса папоротниколистного у подопытных животных определялся комплекс параметров, отражающих функциональное состояние центральной нервной системы: суммационно-пороговый показатель и количественные характеристики поведенческих реакций (норкового рефлекса, двигательной активности, эмоциональной реакции) и ряд общих физиологических показателей: частоту сердечных сокращений, частоту дыхательных движений, ректальную температуру. При анализе актопротекторного эффекта оценивался комплекс параметров, непосредственно характеризующих состояние физической работоспособности и проводился расчет их производных.

Электрокардиографические. Основным учитываемым показателем являлась частота сердечных сокращений, оценка которой для достижения максимальной точности осуществлялась путем регистрации пролонгированной (не менее 25-30 секунд, т.е. не менее 100-130 комплексов) электрокардиограммы на электрокардиографе ЭК1Т-03М. Значения продолжительности интервалов R-R в 100 последовательных комплексах служили исходными данными для расчета т. н. "показателя напряжения", отражающего состояние неспецифических адаптационных механизмов организма (Лапкин М. М., 1994).

Биохимические. Гормоны. При различных моделируемых экспериментальных эндокринных патологиях в сыворотке крови подопытных животных регистрировалась концентрация тироксина, трийодтиронина, инсулина, тестостерона и кортизола. Данные исследования проводились в радиоизотопной лаборатории ЦНИЛ РГМУ радиоиммунными методами с использованием стандартных наборов реактивов. Концентрацию фруктозы, характеризующую уровнь тестостеронпродуцирующей активности семенников и андрогенной насыщенности организма, определяли в содержимом семенных пузырьков (Бурмистрова Л.А., 1999).

Параметры кислотно-щелочного равновесия и газового состава крови. Количественной оценке на цифровом анализаторе ОР-215 фирмы "Radelkis" (Венгрия) подлежали значения РН, парциального давления кислорода и двуокиси углерода, концентрации гидрокарбонатного аниона.

Показатели интенсивности перекисного окисления липидов. Спектрофотометрическим методом определялось содержание малонового диальдегида (Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г., 1977) в различных биосубстратах. Активность ферментативного (НАДФ-Н-зависимого) и неферментативного (аскорбат-зависимого) ПОЛ оценивали по скорости накопления малонового диальдегида в гомогенатах тканей (Арчаков А.И., Девический В.М., Карузина И.И., 1968; Панченко Л.Ф., Арчаков А.И., Александрова Т.А., 1969). Концентрацию SH-групп в гемолизатах эритроцитов и гомогенатах печеночной ткани определяли по их реакции с дитис-бис-нитробензойной кислотой (Beutler E., 1975). Показатель перекисного гемолиза эритроцитов рассчитывали как отношение их гемолиза в специальном буферном растворе к полному гемолизу данных клеток крови в дистиллированной воде (Артемьева Г.Б., 1990) ].

Общелабораторные биохимические показатели крови. Используя стандартные наборы реактивов, по общепринятым методикам проводили определение: а) активности ферментов - аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, щелочной фосфатазы, гамма-глутамилтранспептидазы, амилазы; б) содержания метаболитов белкового, углеводного, липидного обменов - общего белка, составляющих белковой фракции (альбуминов, a1-, a2-, b-, g-глобулинов), мочевины, креатинина, глюкозы, общих липидов, общего холестерина, триглицеридов, a-, b-липопротеидов, индекса атерогенности; в) концентрации электролитов - натрия, калия, кальция, хлора.

Показатели углеводного обмена в тканях. Содержание пирувата регистрировали колориметрическим методом, используя стандартных наборов фирмы "Lachema" (Чехия), по количеству восстанавливающегося из него лактата в присутствии НАДН под действием лактатдегидрогеназы. Уровень гликогена в тканях определяли глюкозозксидазным методом по количеству образовавшейся в пробе глюкозы при гидролизе гликогена в щелочной среде (Хныкина И.В., 1999).

Показатели интенсивности гликолиза и мембранного транспорта эритроцитов. Активность Na , K -зависимой АТФ-азы в гемолизатах эритроцитов определяли по методу В.К. Лишко, М.К. Малышевой, Т.И. Чревазирской (1974). Концентрацию неорганического фосфора фиксировали по методу K. Lohman, Р. Langen (1956) после добавления в пробы молибдата аммония и амидола. Активность пируваткиназы определяли по методу К.А. Кожевниковой (1973). Концентрацию 2,3-ДФГ в эритроцитах после осаждения белков и адсорбции из них нуклеотидов рассчитывали по разнице между концентрациями общего и неорганического фосфора (Исаков С.А., 2002).

Гематологические. При проведении оценки хронической токсичности, возможной аллергенности препарата из биомассы полисциаса папоротниколистного и его эффективности при экспериментальной лучевой патологии проводилось определение количества основных форменных элементов крови: эритроцитов, тромбоцитов, а также лейкоцитов с расчетом их составляющих (палочкоядерные, сегментоядерные, эозинофилы, моноциты, лимфоциты). В гемолизатах крови и эритроцитов определяли концентрацию гемоглобина унифицированным фотоэлектроколориметрическим гемоглобин-цианидным методом (Меньшиков В.В. и др., 1987).

Массаметрические. При решении ряда поставленных задач проводился динамический анализ массаметрических показателей, включающих массу тела лабораторных животных, их внутренних органов (печени, почек, легких, сердца, селезенки, надпочечников, семенных пузырьков, семенников, предстательной железы, щитовидной железы) и весовых коэффициентов, рассчитываемых как отношение массы органа к 1: 100-1: 1000 массы тела. Взвешивание животных проводили на весах ВЛКТ, внутренних органов - на торсионных весах.

Гистологические. Для проведения общего гистологического анализа кусочки внутренних органов (печени, желудка, тонкой кишки, почки, сердца) подопытных животных фиксировали в 12% -ом растворе нейтрального формалина. Далее они отмывались и обезвоживались в растворах этилового спирта возрастающих концентраций и заливались в парафин. Срезы толщиной 6-7 мкм окрашивали гематоксилин-эозином. Непосредственная оценка готовых препаратов проводилась на светооптическом уровне с помощью бинокулярного микроскопа. Цитологическое и морфометрическое исследование при оценке гонадотропного эффекта оцениваемого препарата проводилось после аналогичного по технологии приготовления препаратов из семенников и семенных пузырьков.

Математико-статистические. Все первичные экспериментальные данные были подвергнуты математико-статистической обработке на персональном компьютере "Pentium 4" с использованием офисного пакета "Microsoft Office Professional" с расчетом средней, ее ошибки, значений критерия Стьюдента и достоверности фиксируемых изменений между контрольными и опытными сериями.

Результаты исследования и их обсуждение

Основой, определяющей схему проведения опытов по изучению безопасности препарата из биомассы культуры ткани полисциаса папоротниколистного (б. к. т. ПП), явились результаты соответствующих исследований препарата женьшеня, полученного по аналогичной биотехнологии (Высоцкая Р.И., 1978; Крендаль Ф.П. и др., 1982). Они позволили определить виды токсикологических анализов, диапазоны доз вводимых животным препаратов при их выполнении и провести достаточно корректный итоговый сравнительный анализ.

Комплексное изучение возможных токсикологических характеристик препарата из б. к. т. ПП включало оценку острой, хронической токсичности, риска развития аллергенного, эмбриотоксического и мутагеноого эффектов.

Сравнительный анализ острой токсичности проведен на мышах путем определения средней летальной дозы (LD50) после однократных внутрижелудочных и внутрибрюшинных введений препаратов из биомассы фитоадаптогенов. Полученные результаты значений оцениваемого параметра свидетельствуют о том, что препарат из б. к. т. ПП при внутрибрюшинном введении (LD50 = 2,20 ± 0,13 мл/20 г массы тела) не отличается по токсичности от препарата из биомассы культуры ткани женьшеня (LD50 = 1,83 ± 0,13 мл/20 г), а при внутрижелудочном введении он характеризуется большей степенью безопасности (LD50 = 10,08 ± 0,72 мл/20 г и 7,46 ± 0,73 мл/20 г соответственно).

В настоящей работе использован широкий комплекс методик, позволяющий провести многостороннюю и надежную оценку возможных проявлений хронической токсичности оцениваемого препарата. Он включал функциональные, массаметрические, биохимические, гематологические и гистологические исследования, выполненные по истечению 2, 4 и 6 месяцев постоянного ежедневного его введения в дозах 0,5 и 5 мл/кг. Эти дозы по экстрапалятивной оценке значительно превышают средние суточные эффективные дозы для человека "эталонного" препарата - настойки из биомассы женьшеня (Крендаль Ф.П. и др., 1982). Они, с учетом сопоставимости параметров острой токсичности в препаратных сериях, были выбраны и для исследуемого средства. Все количественные значения фиксируемых параметров, отражающих функционально-метаболическое состояние подопытных животных, в целом характеризовались стабильностью, что является важнейшим свидетельством безопасности препарата из б. к. т. ПП в условиях его длительного применения в относительно высоких дозах.

Проведенный на морских свинках комплексный анализ аллергенности препарата из б. к. т. ПП, включал оценку анафилактической активности, реакций гипечувствительности замедленного типа и иммунных комплексов, применение метода накожных аппликаций и коньюктивальной пробы. Полученные результаты свидетельствуют о том, что он, подобно препарату из биомассы культуры ткани женьшеня (б. к. т. ЖШ), характеризуется отсутствием аллергенных свойств. Не было отмечено у животных препаратных серий каких-либо проявлений мутагенного и эмбриотоксического эффектов.

Итак, исследования по экспериментальной оценке различных токсикологических свойств препарата из б. к. т. ПП позволяют констатировать безопасность его использования в широком диапазоне доз и длительности назначения. Данное заключение базируется на комплексности использованных токсикологических характеристик (острая, хроническая токсичность, аллергенность, мутагенность, эмбриотоксичность) и методов регистрации их проявлений (функциональные, биохимические, массаметрические, гематологические, гистологические, математико-статистические). Представленные результаты являются подтверждением безусловно важнейшего свойства исследуемого препарата - высокой степени безопасности.

Для сопоставления актопротекторных свойств препаратов из биомассы фитоадаптогенов использовано несколько методик плавательных тестов лабораторных животных, позволяющих фиксировать как прямые параметры физической работоспособности, так и ряд производных характеристик, что значительно увеличивает информативность исследования (Макарова В.Г. и др., 1996; Киселева В.А., 1998; Бурмистрова Л.А., 1999).

На первом этапе изучена зависимость длительности плавания крыс после однократного применения различных доз препаратов из б. к. т. ПП и б. к. т. ЖШ. Это позволило установить дозы сравниваемых препаратов, вызывающие максимальный по выраженности эффект. Они оказались равными 2,5-5 мл/кг в случае назначения препарата из б. к. т. ПП и 5-10 мл/кг - при применении препарата из б. к. т. ЖШ. Таким образом, доза 5 мл/кг, судя по полученным результатам, является "общей" для обоих препаратов, обеспечивающей максимальное и близкое по выраженности увеличение времени плавания "до предела", т.е. до наступления физического истощения. Учитывая то, что влияние на физическую работоспособность является одним из важнейших фармакодинамических свойств фитоадаптогенов, данная доза была использована и в дальнейших исследованиях для корректного сравнительного анализа дополнительных проявлений актопротекторного действия, а также для изучения других соответствующих характеристик данных препаратов.

При проведении экспериментов в варианте одного двойного плавательного теста с часовым интервалом, выполняемого животными с дополнительным стандартным отягощением, установлено, что как однократное, так и, особенно, курсовое 7-дневное применение сравниваемых препаратов вызывает увеличение времени максимального продолжительности плавания и производных от него показателей. В целом результаты использованного варианта плавательного теста свидетельствуют о том, что при назначении в стандартной дозе 5 мл/кг выраженность актопротекторного эффекта препарата из б. к. т. ПП не уступает влиянию на физическую работоспособность препарата из б. к. т. ЖШ.

На завершающего этапа для обеспечения максимального проявления актопротекторного действия и оптимизации его сравнения в препаратных сериях осуществлена оценка переносимости лабораторными животными многократных (каждые 5 дней) повторных (с часовым интервалом) физических нагрузок на фоне курсового 20-дневного применения препаратов из б. к. т. ЖШ и б. к. т. ПП.

Ежедневное назначение препаратов из б. к. т. ПП и ЖШ подопытным животным, подвергающихся моделируемым нагрузкам, сопровождалось увеличением и абсолютных (продолжительность первичного и повторного плаваний), и относительных (суммарный показатель двойного плавания, показатель восстановления работоспособности) параметров физической работоспособности. При наращивании массы дополнительного груза, фиксируемого к телу плавающих животных, препараты ускоряют наступление адаптации к более интенсивному режиму нагрузки. Данные сравнительного статистического анализа свидетельствуют о том, что количественные значения определяемых и рассчитываемых показателей физической работоспособности в "полисциасовой" серии на всех этапах статистически не отличались от таковых у животных, получавших препарат из б. к. т. ЖШ. Но при этом выявлено и одно принципиальное различие: на каждом этапе проводимого исследования способность животных к восстановлению физической активности за время одночасового интервала между первичным и повторным плаваниями под воздействием препарата из б. к. т. ПП была более стабильной, о чем свидетельствуют минимальные колебания значений показателя восстановления работоспособности. При введении препарата из б. к. т. ЖШ соответствующий эффект развивался постепенно. Это можно рассматривать в качестве маркера более раннего проявления данной компоненты актопротекторного действия у животных, получавших препарат из б. к. т. ПП.

Изучение гепатопротекторного действия проведено на модели токсического гепатита, возникающего после курсового введения подопытным животным тетрахлорметана, часто используемой в экспериментальной фармакологии при скрининговых исследованиях. Ее высокая информативность при сравнительной оценке близких по своим свойствам препаратов подтверждена в ряде исследований последних лет, проведенных на кафедре фармакологии РЯЗГМУ им. акад. И.П. Павлова (Макарова В.Г. и др., 1995; Лизунова А.С., 1999).

Помимо непосредственной регистрации гепатопротекторного эффекта у апробируемых средств в отношении данного гепатотоксина эта модель позволяет экстраполировать возможность проявления защитного эффекта к воздействию достаточно широкого ряда ксенобиотиков, включая некоторые часто назначаемые в клинической практике лекарственные средства, обладающие сходным с четыреххлористым углеродом механизмом поражения печени (Лукьянчук В.Д., 1993; Посохова Е.А., 1996). Кроме того, принципиальное значение имеет базисное патогенетическое звено развития этой патологии - активация перекисного окисления липидов (ПОЛ), индуцируемая метаболитами тетрахлорметана и составляющая основу повреждения печеночной паренхемы (Панченко Л.Ф., Арчаков А.И., Александрова Т.А., 1969; Арчаков А.И., 1983). Данные об антиоксидантном действии препаратов женьшеня, включая "Биоженьшень" (Давыдов В.В., Молоковский Д.С., Лимаренко А.Ю., 1990), во многом предопределили выбор настоящей модели для оценки гепатопротекторных и антиоксидантных свойств препарата из б. к. т. ПП.

Схема эксперимента предусматривала проведение двух этапов исследования. На первом патологический процесс в печени и его сравнительную динамику на фоне применения препаратов из биомассы фитоадаптогенов оценивали по значениям комплекса ферментных и метаболических показателей крови и данным гистологического анализа - классическим индикаторам печеночной патологии. Полученные результаты свидетельствуют о том, что по выраженности гепатопротекторного действия препарат из б. к. т. ПП не уступает (по гистологическим данным) и даже несколько превосходит (по количественным значениям динамики биохимических параметров сыворотки крови) соответствующий эффект препарата из б. к. т. ЖШ. Принципиально важным дополнительным итогом этих экспериментов явилось подтверждение того, что доза 5 мл/кг каждого из сравниваемых препаратов входит в диапазон, обеспечивающий их максимальную активность.

На втором этапе в препаратных сериях проводился анализ непосредственного "места события" данной патологии, т.е. печеночной ткани, в которой определяли уровень интенсивности перекисного окисления липидов - основного патогенетического звена тетрахлорметанового гепатита. Зафиксированные показатели содержания малонового диальдегида (МДА), активности НАДФ-Н - и аскорбат-зависимого ПОЛ в исследуемом биосубстрате подтвердили наличие антиоксидантного эффекта у препарата из б. к. т. ПП, превосходящего таковой у препарата из б. к. т. ПП. Именно этот механизм, вероятнее всего, предопределил и другие проявления гепатопротекторного действия, зафиксированные на первом этапе данного исследования и степень их выраженности.

Выявленное свойство препарата из б. к. т. ПП является достаточно важной фармакодинамической характеристикой, которая позволяет прогнозировать возможность его использования в качестве гепатопротектора в условиях повышенного риска гепатотоксического эффекта различных лекарственных средств, производственных токсинов, обладающих сходным с четыреххлористым углеродом механизмом деструктивного влияния на печень. Кроме того, антиоксидантные свойства, четко проявившиеся на использованной модели экспериментального тетрахлорметанового гепатита, предопределяют целесообразность апробации его эффективности и при других патологиях, в происхождении которых ключевое значение принадлежит активации свободно-радикального окисления.

Для изучения антигипоксического эффекта классических препаратов из корня и листьев женьшеня, а также из биомассы культуры его ткани применяли модель гипобарической ("высотной") гипоксии (Кудрин А.Н. и др., 1982; Крендаль Ф.П., Левина Л.П., Виннер Б.И., 1991; Минина С.А., Шигарова Л.В., Вайнштейн В.А., 1998). В настоящем исследовании был использован вариант острой гипоксической гипоксии, вызываемой шестичасовой экспозицией подопытных животных в барокамере с остаточным давлением соответствующим подъему на высоту 8000 м. Он характеризуется большим диапазоном изменений количественных значений биохимических показателей крови и параметров ПОЛ тканей (Макарова В.Г. и др., 1996; Takahashi H., 1991; Lyapkov B. G., 1994).

Сравнительной оценке подлежали четыре группы маркеров: показатели газового состава и кислотно-щелочного равновесия крови; сывороточные биохимические параметры; показатели функционально-метаболического статуса эритроцитов и активности перекисного окисления липидов в некоторых "кислородоемких" биосубстратах, таких как печень, мозг, миокард.

Препараты из биомассы из б. к. т. ЖШ и б. к. т. ПП, назначаемые семидневным курсом, вызывали повышение устойчивости организма подопытных животных к воздействию гипоксических факторов. Антигипоксический эффект проявился в минимальных изменениях по сравнению с контролем параметров газового состава и кислотно-щелочного равновесия крови. Это могло быть связано как с общеадаптационным действием, усиливающим активность основных функциональных систем животных в период шестичасового пребывания в барокамере, так и более быстрым восстановлением фиксируемых характеристик после "спуска" крыс препаратных групп по сравнению с серией "гипоксия". Дополнительным подтверждением проявлений возросшей переносимости гипоксического воздействия явились результаты изменений комплекса биохимических показателей сыворотки крови, изменения которых характерны при развитии острой гипоксической гипоксии: активности аминотрансфераз, гамма-глутамилтранспептидазы, щелочной фосфатазы, амилазы; концентраций общего белка, общего холестерина, глюкозы, мочевины, калия, натрия (Лукьянчук В.Д., Савченкова Л.В., 1993; Макарова В.Г. и др., 1996). Судя по ним, степень анализируемого действия оказалась неодинаковой: более значимой в серии, где применяли препарат из б. к. т. ПП.

По данным динамики ферментных и метаболических показателей эритроцитов сравниваемые препараты в условиях воздействия гипоксических факторов способствовали интенсификации гликолиза, как ранних, так и завершающих его стадий. Причем, это действие (судя по абсолютным значениям и активности пируваткиназы, и содержания 2,3-дифосфоглицерата) также оказалось более выраженным у препарата из б. к. т. ПП. Вполне вероятно, что выявленный метаболический сдвиг является одним из решающих в механизме антигипоксического действия вводимых препаратов на эритроцитарном уровне. Кроме того, значительное возрастание содержания 2,3-дифосфоглицерата предопределяет снижение сродства гемоглобина к кислороду, что, в свою очередь, способствует сохранению необходимого уровня оксигенации тканей. Косвенным подтверждением данных предположений может рассматриваться и тот факт, что у животных, получавших препарат из б. к. т. ЖШ, активность АТФ-азы оказалась гораздо более низкой, чем у крыс серии "гипоксия", хотя осталась достоверно превышающей контрольный параметр. А после введения препарата из б. к. т. ПП активность данного фермента практически не отличалась от показателя у интактных животных. Это свидетельствует о функциональной стабильности клеточных мембран эритроцитов крыс данной серии даже в условиях воздействия гипоксических факторов.

Необходимость обязательного включения сравнительного анализа динамики уровня липопероксидации в биосубстратах при данной модели обоснована тем, что гипоксия является одним из индукторов ПОЛ биологических мембран с последующим повреждением тканей (Медведев Ю.В., Толстой А.Д., 2000; Yasaka T., Ocudaira K., Fulito H., 1986; Meerson F. Z., 1993). Препараты из биомассы фитоадаптогенов в условиях воздействия гипоксических факторов оказали четкое антиоксидантное действие, проявившееся меньшей степенью активации ПОЛ в ткани печени, миокарде и его отсутствием - в мозговой ткани. Статистический анализ итоговых результатов свидетельствует о большей выраженности данного эффекта в серии, где животным перед помещением в гипобарическую камеру вводили препарат из б. к. т. ПП.

Таким образом, установленные проявления и возможные механизмы антигипоксического действия препарата из б. к. т. ПП характеризуются достаточной выраженностью, обеспечивающей высокую устойчивость организма в условиях остро развившейся кислородной недостаточности. Данная характеристика безусловно важна и может способствовать расширению диапазона практического использования оцениваемого препарата.

Оценка сравнительной выраженности радиопротекторных свойств у исследуемых фитоадаптогенов проведена на взрослых нелинейных крысах-самцах, подвергаемых однократному общему воздействию гамма-облучением в дозе 7,5 Гр. Данная модель, характеризующаяся приблизительно 50% -й летальностью облученных животных в течение первого месяца, достаточно широко используется в экспериментальных исследованиях при исследованиях влияния фитопрепаратов на показатели течения радиационного поражения (Бураева Л.Б. и др., 1998; Вымятина З.К. и др., 2000).

Динамика проявлений радиационной патологии и ее модификация препаратами из б. к. т. ЖШ и б. к. т. ПП изучалась путем регистрации гематологических и биохимических параметров в опытных сериях на 1, 3, 5, 10 и 30-й дни после облучения. Сравниваемые препараты способствовали сохранению практически на всех этапах регистрации более высокого уровня, чем в серии "радиация", числа лейкоцитов, тромбоцитов, эритроцитов и концентрации гемоглобина. Детальный анализ полученных результатов свидетельствует о достаточно близкой в целом выраженности этого проявления радиопротекторного действия в обеих группах.

У животных, подвергнутых облучению на фоне введения препаратов из б. к. т. ЖШ и б. к. т. ПП, выявлена достоверно меньшая степень изменений показателей, отражающих функционально-метаболическое состояние эритроцитов (содержания 2,3-дифосфоглицерата, активности АТФ-азы, пируваткиназы,) на каждом этапе эксперимента по сравнению с серией "радиация". Вполне вероятно, что эти данные являются одним из проявлений влияния оцениваемых препаратов, обеспечивающего повышенную устойчивость организма подопытных лабораторных животных, в частности их эритроцитов, к радиационному воздействию.

В обеих препаратных группах было установлено достаточно отчетливое и близкое по выраженности антиоксидантное действие в условиях использованной экспериментальной модели лучевой патологии, которое оценивалось по динамики некоторых параметров свободно-радикального процесса в гомогенатах селезенки и тонкой кишки.

Данные проведенного исследования позволяют констатировать наличие у препаратов из б. к. т. ЖШ и б. к. т. ПП равновыраженного защитного эффекта к радиационному воздействию. Он проявился практически на всех этапах 30-дневного контролируемого пострадиационного периода достоверно меньшими изменениями регистрируемых показателей по сравнению с серией, в которой животные не получали препараты из биомассы фитоадаптогенов. При этом протекторное действие, отмеченное через сутки после облучения, можно, вероятнее всего, расценить как проявление повышенной устойчивости к радиации, вызванной 10-дневным превентивным курсовым назначением оцениваемых препаратов, а меньшую степень изменений регистрируемых параметров по сравнению с "чисто" облученными животными, на последующих этапах - как реализацию их терапевтического эффекта в условиях лучевой патологии. На 30-й день практически все определяемые гематологические и биохимические показатели в препаратных группах, в отличие от серии "радиация", полностью соответствовали значениям контрольной группы животных. При анализе поэтапной выраженности оцениваемого действия следует отметить достаточно жесткое соотношение между характером изменений показателей интенсивности ПОЛ, с одной стороны, и динамикой гематологических и эритроцитарных параметров, с другой. Это, по-видимому, отражает значимость антиоксиданой активности препаратов из биомассы фитоадаптогенов в реализации других проявлений их радиопротекторного эффекта.

С учетом данных, свидетельствующих о важной роли в этиологии и патогенезе атеросклероза интенсификации свободно-радикального окисления (Ланкин В.З., Вихерт А. М., 1989; Артемьева Г.Б., 1990; Tsai A. C., Thie G. M., Law C. R., 1977; Goto J., 1982), с одной стороны, и достаточно выраженной антиоксидантной активностив фитоадаптогенов семейства аралиевых (Давыдов В.В. и др., 1990; Трилис Я.Г., 1996), с другой, в настоящей работе для проведения сравнительного изучения антиатеросклеротических свойств препаратов из б. к. т. ЖШ и б. к. т. ПП была использована перекисная модель атеросклероза (Воскресенский О.Н., Бобырев В.И., 1971). Она воспроизводилась у подопытных кроликов путем их тридцатидневного содержания на безантиоксидантном рационе, включающим жир с низким уровнем токоферола. Индивидуальные пищевые брикеты готовились по стандартной рецептуре. Дополнительным фактором, усиливающим и ускоряющим развитие атеросклероза, была иммобилизационная гиподинамия: животные весь опытный период находились в состоянии практически полной обездвиженности, так как размеры индивидуальных вольеров были подобраны в максимальном соответствии с длинной туловища кролика. В таких условиях, как подтверждено экспериментальными исследованиями (Артемьева Г.Б., 1990), у подопытных животных ускоренно развивается гиперлипидемия, синдром липопероксидации в различных тканях, включая сосудистую стенку, и специфические изменения в артериях: липидная инфильтрация, деструкция эластики, фиброз, кальциноз.

Настоящие эксперименты выполнены в вариантах профилактического и лечебного применения сравниваемых препаратов. В первом случае они назначались в течение всего срока воздействия атерогенных факторов, во втором - две недели сразу же после перевода кроликов на обычную диету и в просторные вольеры. В качестве биохимических критериев оценки моделируемой патологии и ее модификации при применении препаратов из биомассы фитоадаптогенов использовали показатели липидного спектра сыворотки крови (концентрация общих липидов, триглицеридов, общего холестерина, b-липопротеидов, а-липопротеидов и значения индекса атерогенности), а также параметры, характеризующие активность липопероксидации в гомогенате ткани аорты (концентрация МДА, активность НАДФ-Н-зависимого и аскорбат-зависимого ПОЛ).

Сравнительный анализ полученных данных свидетельствует о том что препараты из б. к. т. ЖШ и б. к. т. ПП вызывают достаточно выраженный профилактический эффект при воздействии факторов, индуцирующих атерогенез. Причем, по значениям всех определяемых параметров это действие оказалось достаточно близким по выраженности в обеих препаратных сериях. Через две недели после прекращения воздействия атерогенных факторов, в течение которых препараты из биомассы сравниваемых фитоадаптогенов назначались как лечебные средства, терапевтическая эффективность препарата из б. к. т. ПП, оцениваемая как по значениям динамики показателей липидного спектра сыворотки крови, так и параметров интенсивности перекисного окисления липидов в гомогенате стенки аорты оказалась более выраженной.

Изученное свойство препарата из б. к. т. ПП, учитывая чрезвычайно широкую распространенность атеросклероза и отсутствие радикальных средств для его лечения, должно рассматриваться как достаточно важная характеристика, расширяющая перспективы его клинического применения. При этом следует дополнительно отметить, что исследуемый препарат соответствует большинству принципиальных требований, предъявляемых к ангиопротекторам: способен влиять на ряд патогенетических факторов атеросклероза (уменьшает гиперлипидемию, увеличивает уровень антиатерогенных липопротеидов, тормозит активность перекисного окисления липидов); обладает высокой степенью безопасности, не кумулирует, что позволяет использовать его продолжительными курсами.

Для реализации гонадотропного действия женьшеня и его аналогов необходимо, чтобы половая функция была не только измененной, т.е. сниженной, но и способной к восстановлению (Гинзбург Я.З., 1959; Брехман И.И., Дардымов И.В., Добряков Ю.И., 1966; Дардымов И.В., 1976). Данные условиях проявления стимулирующего эффекта фитоадаптогенов на функцию половых желез предопределили выбор в настоящем исследовании для сравнительного анализа гонадотропной активности препаратов из б. к. т. ЖШ и б. к. т. ПП экспериментальной модели односторонней кастрации половозрелых крыс.

Учитывая особенности динамики течения посткастрационного периода у крыс при использовании этой модели (Чугунова Л.Г. и др., 1997; Бурмистрова Л.А., 1999), сравнительную оценку гонадотропных свойств осуществляли в течение двух недель после тестэктомии: на 3, 6, 9 и 14-й дни. По завершении каждого этапа в биосубстратах крыс сравниваемых серий проводили три вида сравнительного анализа - биохимический, массаметрический и гистологический.

Из биохимических показателей регистрировали концентрации тестостерона в крови и фруктозы в семенной жидкости. В рамках массаметрического исследования определяли комплекс показателей прямого взвешивания (массу тела, семенников, семенных пузырьков, предстательной железы) и рассчитывали значения весовых коэффициентов для половых органов. Гистологическое исследование проводилось в вариантах цитологического (семенники) и морфометрического (семенные пузырьки) анализов. Параметрами первого были количества пахитенных сперматоцитов, ранних и поздних сперматид, второго - высота этителия и высота складок.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что препарат из б. к. т. ПП обладает достаточно выраженным гонадотропным эффектом. Это проявляется тем, что он уступает "эталонному" препарату из б. к. т. ЖШ только более медленным, отсроченным развитием анализируемого действия, а на заключительном этапе контролируемого двухнедельного периода практически по всем параметрам оцениваемого комплекса эффекты в препаратных сериях оказались полностью сопоставимыми.

Эксперименты по оценке антидиабетического эффекта препарата из б. к. т. ПП проведены на нелинейных крысах-самцах, инсулинозависимый диабет у которых вызвали однократной внутрибрюшин