Отработка методики оценки NK-активности, процентного содержания NK-клеток среди мононуклеарных клеток, содержания литических гранул и внутриклеточного перфорина в NK-клетках, их дегрануляции по экстернализации CD107a с помощью проточной цитометрии.
При низкой оригинальности работы "Комплекс методов исследования nk-клеток в норме и при патологии", Вы можете повысить уникальность этой работы до 80-100%
В то же время NK-активность определяется целым рядом параметров: процентным содержанием NK-клеток среди МНК, содержанием в литических гранулах NK-клеток перфорина и гранзимов, способность NK-клеток дегранулировать (т.е. высвобождать перфорин и гранзимы из гранул). Отработать методики оценки NK-активности, процентного содержания NK-клеток среди МНК, содержания литических гранул и внутриклеточного перфорина в NK-клетках, дегрануляции NK-клеток по экстернализации CD107a с помощью проточной цитометрии. Так, впервые прямо показан дефект дегрануляции NK-клеток у детей с первичным иммунодефицитом - синдромом Вискотта-Олдрича, что сопровождается снижением NK-активности при нормальном внутриклеточном содержании CD107a и перфорина в NK-клетках. Методы, входящие в комплекс, дают возможность установить причину нарушения функции NK-клеток (снижение процентного содержания NK-клеток среди мононуклеаров, снижение способности NK-клеток к дегрануляции, снижение экспрессии цитотоксических белков NK-клетками). В качестве индукторов дегрануляции NK-клеток использовали рецептор-зависимый стимул - клетки K562 (5?105 клеток на лунку, соотношение эффектор:мишень = 1:1), а также рецептор-независимый стимул - форбол-12-миристат-13-ацетат иономицин (ФМА ИОН; конечные концентрации 100 нг/мл и 0,5 мкг/мл соответственно; оба Sigma).Разработан комплекс методов, позволяющий оценивать основные показатели NK-клеток: процентное содержание NK-клеток среди МНК, субпопуляционный состав NK-клеток, NK-активность МНК, дегрануляцию NK-клеток и их субпопуляций по экстернализации CD107a при рецепторной и нерецепторной стимуляции, определение внутриклеточного содержания CD107а и перфорина в NK-клетках. У здоровых доноров в возрасте до 50 лет NK-активность МНК коррелирует с процентным содержанием NK-клеток среди МНК и с процентом NK-клеток, дегранулирующих при взаимодействии с клетками K562. NK-активность МНК не коррелирует с внутриклеточным содержанием перфорина в NK-клетках и с количеством гранул, выбрасываемых в среднем одной NK-клеткой при взаимодействии с клетками K562. У лиц пожилого возраста (старше 65 лет) снижена дегрануляция NK-клеток в ответ на различные виды стимуляции при неизмененной NK-активности МНК; нарушена корреляция между NK-активностью и процентом NK-клеток, дегранулирующих при взаимодействии с K562. При синдроме Вискотта-Олдрича резко снижена дегрануляция NK-клеток в ответ на рецепторный стимул (K562), в меньшей степени на нерецепторные стимулы, что сопровождается резким снижением NK-активности у этих больных; корреляция между показателями дегрануляции NK-клеток и NK-активностью МНК отсутствует.
Вывод
1. Разработан комплекс методов, позволяющий оценивать основные показатели NK-клеток: процентное содержание NK-клеток среди МНК, субпопуляционный состав NK-клеток, NK-активность МНК, дегрануляцию NK-клеток и их субпопуляций по экстернализации CD107a при рецепторной и нерецепторной стимуляции, определение внутриклеточного содержания CD107а и перфорина в NK-клетках. Методологической основой комплекса является проточная цитометрия.
2. Подтверждено значение CD107a как маркера дегрануляции NK-клеток.
3. CD107a является более чувствительным и специфичным маркером дегрануляции NK-клеток, чем CD63.
4. Лишь небольшая часть циркулирующих NK-клеток и их CD56dim субпопуляции дегранулирует при взаимодействии с NK-чувствительными клетками-мишенями K562. При этом значительная часть NK-клеток активируется, но не дегранулирует.
5. Более высокий процент дегранулирующих клеток наблюдается в субпопуляциях CD56dim NK-клеток, экспрессирующих CD159a (CD159a ), высокий уровень CD94 (CD94bright) и низкий уровень CD335 (CD335dim).
6. У здоровых доноров в возрасте до 50 лет NK-активность МНК коррелирует с процентным содержанием NK-клеток среди МНК и с процентом NK-клеток, дегранулирующих при взаимодействии с клетками K562. NK-активность МНК не коррелирует с внутриклеточным содержанием перфорина в NK-клетках и с количеством гранул, выбрасываемых в среднем одной NK-клеткой при взаимодействии с клетками K562.
7. У лиц пожилого возраста (старше 65 лет) снижена дегрануляция NK-клеток в ответ на различные виды стимуляции при неизмененной NK-активности МНК; нарушена корреляция между NK-активностью и процентом NK-клеток, дегранулирующих при взаимодействии с K562.
8. При синдроме Вискотта-Олдрича резко снижена дегрануляция NK-клеток в ответ на рецепторный стимул (K562), в меньшей степени на нерецепторные стимулы, что сопровождается резким снижением NK-активности у этих больных; корреляция между показателями дегрануляции NK-клеток и NK-активностью МНК отсутствует.
9. При хронической гранулематозной болезни функциональные показатели NK-клеток существенно не изменены.
10. У пациентов с часто рецидивирующим герпесом как в стадии обострения, так и в стадии ремиссии умеренно снижена дегрануляция NK-клеток в ответ как на рецепторную, так и на нерецепторную стимуляцию. Достоверное снижение NK-активности имеется только в стадии ремиссии. В стадию обострения, но не в стадию ремиссии, нарушена корреляция между NK-активностью и процентом NK-клеток, дегранулирующих при взаимодействии с K562.
Список литературы
1. Муругин В.В., Муругина Н.Е., Продеус А.П., Зимин С.Б., Кондратенко И.В., Пинегин Б.В., Пащенков М.В. Дегрануляция NK-клеток у больных синдромом Вискотта-Олдрича и хронической гранулематозной болезнью. Иммунология, 2009, т.30(6), стр.376-382.
9. Муругин В.В., Муругина Н.Е., Пащенков М.В., Пинегин Б.В. Дегрануляция Т- и NK-клеток у лиц пожилого возраста. Российский Аллергологический Журнал, 2011, т.4, стр.246-247.
10. Пащенков М.В., Муругин В.В., Пинегин Б.В. Применение мультипараметрической проточной цитометрии для одновременной оценки функции и фенотипа NK-клеток. Российский Аллергологический Журнал, 2011, т.4, стр.283-284.
Размещено на .ru
Вы можете ЗАГРУЗИТЬ и ПОВЫСИТЬ уникальность своей работы
