Колонизация ризопланы корней огурцов микроорганизмами, входящими в состав микробного препарата "Эмбико" - Доклад

Поверхность корня (ризоплана) и зона почвы, непосредственно соприкасающаяся с корнями (ризосфера), являются постоянным местом обитания разнообразных микробных ассоциаций (Shaposhnikov, 2011; Galkin, 2012; Lobakova, 2005; Davey, 2000; Costerton, 1995). Микроорганизмы ризопланы выполняют много жизненно важных для растений функций: стимулируют рост и развитие растительных организмов за счет способности к фиксации азота (Maudinas, 1981; Kundu, 1984; Mantelin, 2004), продуцирования фитогормонов (Dragovoz, 2012; Zakry Fitri Abdul Aziz, 2012), мобилизации питательных элементов из почвы (Rai, 1988; Han, 2006), повышения устойчивости растений к стрессовым факторам (Zacharchenko, 2012; Pigoleva, 2012). Использование метода выращивания проростков растений в полужидком агаре, инокулированном микроорганизмами, позволяет за относительно короткий период времени сравнить способность исследуемых бактерий колонизировать поверхность корня и размножаться в ризосфере. На 3-и сутки культивирования растений облако колоний вокруг всех зон корня имело диаметр 1-2 мм (рис. Так, в зоне корневого чехлика диаметр облака колоний в среднем составил 1 мм, в зоне делящихся клеток - 2 мм, в зоне корневых волосков - 5 мм, в проводящей зоне - 3 мм.Штаммы молочнокислых бактерий Lactobacillus plantarum 20 и L. casei 6, а также дрожжей Saccharomycescerevisiae 75, входящие в состав микробиологического консорциума «Эмбико®», способны колонизировать прикорневое пространство огурцов сортов «Конкурент» и «Феникс плюс». При инокуляции корней микроорганизмами, ассоциированными в препарате «Эмбико®», колонизация корней происходит более активно, что свидетельствует о формировании синергических взаимоотношений между лактобациллами и сахаромицетами при совместном их культивировании.

Поверхность корня (ризоплана) и зона почвы, непосредственно соприкасающаяся с корнями (ризосфера), являются постоянным местом обитания разнообразных микробных ассоциаций (Shaposhnikov, 2011; Galkin, 2012; Lobakova, 2005; Davey, 2000; Costerton, 1995). Микроорганизмы ризопланы выполняют много жизненно важных для растений функций: стимулируют рост и развитие растительных организмов за счет способности к фиксации азота (Maudinas, 1981; Kundu, 1984; Mantelin, 2004), продуцирования фитогормонов (Dragovoz, 2012; Zakry Fitri Abdul Aziz, 2012), мобилизации питательных элементов из почвы (Rai, 1988; Han, 2006), повышения устойчивости растений к стрессовым факторам (Zacharchenko, 2012; Pigoleva, 2012). Отдельные виды обладают способностью к детоксикации чужеродных химических соединений в окружающей среде (Loktushov, 2011). Таким образом, устанавливая симбиотические отношения с растением, микроорганизмы ризопланы существенным образом модифицируют обмен веществ растения-хозяина.

Ведущую роль в формировании специфических ризоплановых и ризосферных микробных сообществ, отличающихся от почвенного микробоценоза, играют корневые выделения растений (Kravchenko, 2011; Kravchenko L. V., 2003; Vancura, 1972; Fellix, 2002; Folman, 2001). Для успешной колонизации корней важна способность бактерий утилизировать основные компоненты корневых выделений, в особенности низкомолекулярные органические кислоты (Kravchenko, 2011; Vancura, 1972; Folman, 2001), а также их способность синтезировать аминокислоты и витамины группы В (Shaposhnikov, 2011).

Одной из функций ризоплановой и ризосферной микрофлоры является защита растений от фитопатогенных микроорганизмов (Zacharchenko, 2012; Kravchenko, 2002; Rzevskaya, 2013; Boronin, 1998; Morgun, 2009), которая может быть как механической за счет перекрытия сайтов адгезии на поверхности корней, так и активной за счет продуцирования широкого спектра антибиотических веществ (Galkin, 2012). Поиск эффективных микробных антагонистов фитопатогенных бактерий целесообразно проводить среди микроорганизмов, которые, с одной стороны, способны продуцировать биологически активные метаболиты, а с другой, интегрируясь в уже состоявшиеся микробные ценозы, активно колонизировать корни растений, (Shaposhnikov, 2011; Kulrich, 2009; Sheludko, 2010; Kurakov, 1997), проявляя тем самым протекторные свойства. Наиболее перспективной группой микроорганизмов, отвечающих этим требованиям, являются бактерии рода Lactobacillus, в основе высокой антагонистической активности которых лежит генетически детерминированная способность к продукции веществ с антибиотической активностью (Kvasnikov, 1975).

Весьма перспективным направлением в биотехнологических исследованиях является создание инокулятов, состоящих из бактериальных ассоциаций молочнокислых бактерий, обладающих синергическим эффектом и повышающих устойчивость растительно-бактериальной системы. Эффективность использования таких микробных препаратов в значительной степени определяется свойством применяемых бактерий колонизировать поверхность корня (Shaposhnikov, 2011). В связи с этим, целью настоящего исследования является сравнительный анализ способности микроорганизмов, входящих в состав микробиологического препарата «Эмбико®», к колонизации ризопланы и ризосферы растений.

Материалы и методы исследований

Объектами исследования служили чистые культуры молочнокислых гомоферментативных стрептобактерий рода Lactobacillus: L. plantarum 20 и L. casei 6, молочнокислых гомоферментативных стрептококков Lactococcus lactis 4/6, дрожжей Saccharomyces cerevisiae 75, а также микробиологический консорциум «Эмбико®», включающий указанные микроорганизмы. Все штаммы, входящие в состав микробиологического консорциума, депонированы и находятся на хранении в Депозитарии Института микробиологии и вирусологии НАН Украины.

Способность бактерий колонизировать поверхность корней исследовали на растениях огурцов (Cucumis sativus L.) сортов «Конкурент» и «Феникс плюс». Простерилизованные перекисью водорода семена огурцов проращивали в чашках Петри на фильтровальной бумаге, смоченной стерильной водопроводной водой, в темноте при 280С в течение 2-х суток. Пророщенные семена асептически помещали в биологические пробирки, заполненные 7-10 мл 0, 6% голодного агара, в которые предварительно вносили суспензии микроорганизмов и микробиологический консорциум (в 1 мл инокулята - 107 КОЕ). Контролем служили пробирки с голодным агаром и высаженными в них растениями огурца. Лактобактерии выращивали на среде MRS, молочнокислые стрептококки - на среде S (Kvasnikov, 1975), дрожжи - на среде Сабуро в течение 2-х суток. Пробирки с проростками размещали на свету при температуре 250С и освещении 1 тыс. люкс. Способность бактерий колонизировать прикорневую зону растений оценивали по образованию микроколоний бактерий у поверхности корня на 3-14-е сутки выращивания проростков. На 15-е сутки у сеянцев отделяли корневую систему и исследовали наличие на ней бактерий в давленых микропрепаратах, окрашенных метиленовым синим. Содержание микроорганизмов из каждого изучаемого штамма анализировали в корневом чехлике, зоне клеточных делений, зоне растяжения, и зоне всасывания и в проводящей зоне. Эксперименты проводили в 20-и кратной биологической повторности.

Результаты и их обсуждение

Использование метода выращивания проростков растений в полужидком агаре, инокулированном микроорганизмами, позволяет за относительно короткий период времени сравнить способность исследуемых бактерий колонизировать поверхность корня и размножаться в ризосфере. В контрольном варианте (семена высажены в голодный агар без внесения микроорганизмов) в толще агара рост колоний не наблюдался, все зоны корня просматривались отчетливо (рис. 1).

а б

Рис. 1. Корень (зона корневых волосков) Cucumis sativus L. сорта «Феникс плюс» выращенного в стерильных условиях (а - х 8; б - х 98)

В опытном варианте при внесении в питательную среду штамма S. cerevisiae на 2-е сутки вокруг корней растений образовывалось видимое облако колоний (рис. 2 а - г). Штамм S. cerevisiae колонизировал толщу агара по всей длине корня, начиная с его базальной части: проводящую зону, зону всасывания (зону корневых волосков), зону растяжения. В апикальной части корня колонизация проявлялась менее активно. На 3-и сутки культивирования растений облако колоний вокруг всех зон корня имело диаметр 1-2 мм (рис. 2 а, б). С увеличением времени культивирования до 14-и суток интенсивность колонизации прикорневой зоны микроорганизмами возрастала - колонии становились крупнее. В различных зонах корня диаметр облака колоний отличался по размеру (рис. 2 в, г). Так, в зоне корневого чехлика диаметр облака колоний в среднем составил 1 мм, в зоне делящихся клеток - 2 мм, в зоне корневых волосков - 5 мм, в проводящей зоне - 3 мм. Изза высокой плотности облака колоний микроорганизмов вокруг корней, корневые волоски не просматривались. Микроскопирование давленых препаратов корня показало наличие клеток S. cerevisiae в разных его зонах (рис. 2 д). Отличий в колонизации корней огурцов у сортов «Конкурент» и «Феникс плюс» не обнаружено.

а б в г д

Рис. 2. Колонизация прикорневого пространства огурцов сорта «Конкурент» штаммом S. cerevisiae 75: а - 3 сутки культивирования (х 8), б - 3 сутки культивирования (х 98), в - 10 сутки культивирования, г - 10 сутки культивирования (х 98), д - давленый препарат на 14 сутки культивирования (х 10)

Результаты проведенных ранее исследований показали, что штаммы L. casei 6 и L. plantarum 20 оказывают стимулирующее действие на рост проростков огурцов (Rzevskaya, 2013), проявляя высокую антагонистическую активностью в отношении широкого спектра фитопатогенных микроорганизмов. При внесении в голодный агар как штамма L. casei 6, так и штамма L. plantarum 20 вокруг корней огурцов обоих испытанных сортов на 3-и сутки появлялось облако мелких колоний (рис. 3, 4).

Штамм L. casei 6 колонизировал поверхность корня по всей его длине (рис. 3-а). Высокая плотность облака бактериальных колоний вокруг корня не позволяла рассмотреть корневые волоски. На 3-и сутки культивирования L. casei 6 сформировал облако колоний диаметром 2-3 мм, размеры которого оставались неизменным до 14-го дня исследований (рис. 3-б). Бактериальное облако, образуемое штаммом L. plantarum 20 на всей поверхности корня, имело размеры 1-2 мм (рис. 4-а), в зоне корневых волосков его диаметр достигал 4 мм. Плотность облака низкая, корневые волоски просматривались (рис. 4-б). Оба исследуемого штамма (и L. casei 6, и L. plantarum 20) колонизировали как корневой чехлик (рис. 3-в), так и все зоны корня (рис. 3-г, 4-в).

а б в г

Рис. 3. Колонизация прикорневого пространства огурцов сорта «Феникс плюс» штаммом L. casei 6: а - 3 сутки культивирования, б - 3 сутки культивирования (х 8), в - 14 сутки культивирования (х 98), г - давленый препарат на 14 сутки культивирования (х 20)

Исследуемый ранее штамм L. lactis 4/6 увеличивал энергию прорастания и всхожесть семян огурцов, проявляя высокую антагонистическую активность в отношении фитопатогенных грибов и бактерий (Rzevskaya, 2013). Установлено, что данный штамм не образовывал колоний в толще голодного агара и не колонизировал поверхность корня огурцов сортов «Конкурент» и «Феникс плюс».

При инокуляции корней микробиологическим консорциумом «Эмбико®», включающим вышеописанные штаммы, происходила колонизация корня по всей его длине. На 3-и сутки культивирования растений облако колоний вокруг корня имело диаметр 2 - 3 мм, постепенно сужаясь в апикальной зоне. При инокуляции чистой культурой изолированных штаммов облако состояло из одного вида колоний и на всем колонизируемом пространстве выглядело однородно. При инокуляции микробиологическим консорциумом облако колоний выглядело неоднородным, четко просматривались колонии разного размера и цвета (рис. 5 а, б). При микроскопировании препаратов корней, инокулированных микробиологическим консорциумом «Эмбико®», обнаружены как дрожжевые клетки, так и клетки молочнокислых бактерий (рис. 5 в-е).

а б в

Рис. 4. Колонизация прикорневого пространства огурцов сорта «Конкурент» штаммом L. plantarum 20: а - 14 сутки культивирования (х 9, 8), б - давленый препарат на 14 сутки культивирования (х10)

Таким образом, представленные данные свидетельствуют о том, что исследуемые штаммы молочнокислых бактерий и дрожжей характеризуются выраженной способностью колонизировать поверхность корней огурцов. Колонии штаммов микроорганизмов образуют облако вокруг корней, различное по мутности и размерам. В толще агара, на расстоянии более 5 мм от поверхности корня рост микроорганизмов не наблюдался, т. к. голодный агар является «бедной» питательной средой, а потому не подходит для развития молочнокислых бактерий, обладающих слабыми биосинтетическими способностями. У исследованных штаммов облако колоний отличалось по плотности ?? почти прозрачное у штамма L. plantarum и очень плотное у S. cerevisiae. Диаметр облака колоний (1 - 5 мм) на различных участках корня также отличался. Наименьшая интенсивность роста микроорганизмов наблюдалась на верхушке корня, наибольшая ?? в зоне корневых волосков. Согласно Куракову А. В. (Kurakov, 1997), низкая заселенность микроорганизмами корневого кончика и зоны растяжения обусловлена тем, что удлинение корня происходит со скоростью более 1000 мкм/ч, превышающей линейную скорость грибов и бактерий, и микроорганизмы не успевают колонизировать их с более старых участков. Замедление роста корня ведет к увеличению количества микроорганизмов в апикальной зоне корня. Это предположение подтверждают и результаты наших исследований ?? на 2-е сутки на кончике корня облако колоний имело меньший диаметр, чем на 14-е сутки.

Очевидно, именно корневые выделения растений являются для инокулированных бактерий основным источником углерода и энергии (Vancura, 2002; Fellix, 2002). Известно, что различные части корня отличаются по составу и интенсивности секреции экзометаболитов а б в г д е

Рис. 5. Колонизация прикорневого пространства огурцов микробиологическим консорциумом «Эмбико®»: а - корневой чехлик (х 98), б - средняя часть корня (х 98), в - зона корневых волосков (х 10), г - е - зона корневых волосков (х 20)

Согласно литературным данным, экссудаты корней растений состоят из сложной смеси органических веществ: анионов кислот, сахаров (Vancura, 2002; Fellix, 2002; Folman, 2001), аминокислот (Fellix, 2002; Folman, 2001), витаминов, пуринов, нуклеозидов, неорганических ионов, газообразных соединений, ферментов, фенольных соединений (Fellix, 2002). По-видимому, штаммовые отличия в трофических потребностях исследованных микроорганизмов, их способность потреблять те или другие компоненты корневого экссудата являются причиной их неравномерного распределения по поверхности корней. Следовательно, при инокуляции бактерий в корневую зону растений именно корневые экзометаболиты и будут в значительной степени определять интеграцию микроорганизмов с растением и дальнейшее совместное их функционирование.

1. Штаммы молочнокислых бактерий Lactobacillus plantarum 20 и L. casei 6, а также дрожжей Saccharomycescerevisiae 75, входящие в состав микробиологического консорциума «Эмбико®», способны колонизировать прикорневое пространство огурцов сортов «Конкурент» и «Феникс плюс». Штамм молочнокислого стрептококка Lactococcus lactis 4/6 такой характеристикой не обладает.

2. При инокуляции корней микроорганизмами, ассоциированными в препарате «Эмбико®», колонизация корней происходит более активно, что свидетельствует о формировании синергических взаимоотношений между лактобациллами и сахаромицетами при совместном их культивировании.

3. Активная микробная колонизация всех зон корней огурцов связана с потреблением исследуемыми микроорганизмами корневых экзометаболитов в качестве источников энергии и углерода.

4. В различных зонах корней интенсивность их колонизации неодинакова: наименьшая скорость образования колоний отмечена на верхушке корня, наибольшая ?? в зоне корневых волосков.

5. Сортовая специфика огурцов не оказывает существенного влияния на ход процесса колонизации корней.

Boronin A. M., 1998. Rhizosphere bacteria of the genus Pseudomonas, contributing to the growth and development of plants [Rizosphernii bakterii roda Pseudomonas, sposobstvuchie rostu i razvitiu rasteniy]. Sorosovskiy obrazovatelniy jurnal, (10), 25 - 31 (in Russian.).

Costerton J. W. 1995. Overviev of microbial biofilms. J. Ind. Microbia, (15), 137-140.

Davey M. E., OTOOLE G. A. 2000. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics. Microbialogy and molecular biology reviews, 64 (4), 847 - 867.

Dragovoz I. V., Leonova N. O., Avdeeva L. V., 2012. Synthesis of outcell phytohormones strains bakteria genus Bacillus, isolated with different ecological niches [Synthesis pozaklitinnih fitogormoniv strains bakteriy genus Bacillus, vidilenimi s riznih ekologichnih nish]. Mikrobnie biotechnologii: aktualne I maibutne - Radostim-2012: Materiali mejdunarodnoy nauchno-prakticheskoy konferencii. Kiyv, 2012, 111-112 (in Ukrainian.).

Fellix D. Dacora & Donald A. Phillips. 2002. Root exudates as mediators of mineral acquisition in low-nutrient environments. Plant and soil, (245), 35-47.

Folman L. B., Postma J., Van Veen J. A. 2001. Ecophysiological characterization of rhizosphere bacterial communities at different root locations and plant developmental stages of cucumber grown on rockwool. Microbiol. Ecol, (42), 586-597.

Galkin N. B., Ivanica V. A., 2012. Biofilm formation by bacteria of the genus Lactobacillus on plant roots. Mikrobnie biotechnologii: aktualne I maibutne - Radostim-2012: Materiali mejdunarodnoy nauchno-prakticheskoy konferencii. Kiyv, 2012, 82-83 (in Russian).

Han H. S., Supanjani, Lee K. D. 2006. Effect of co-inoculation with phosphate and potassium solubilizing bacteria on mineral uptake and growth of pepper and cucumber. Plant soil environ, 52 (3), 130-136.

Kravchenko L. V., Azarova T. S., Leonova-Erko E. I., 2003. Tomato root exudates and their impact on growth and antifungal activity of strains Pseudomonas [Kornevie videlenia tomato i ich vliyayie na rost i antifungalnuu ktivnost shtamov Pseudomonas]. Mikrobiologia, 72 (1), 48-53 (in Russian.).

Kravchenko L. V., Makarova N. M., Azarova T. S., Provorov N. A., Tichonovich I. A., 2002. Isolation and phenotypic characteristics of growth-promoting bacteria (PGPR) that combine high activity of root colonization and inhibition of pathogenic fungi

[Vidilenie i fenotipicheskaya charakteristika rostostimuliruuchich bakteriy (PGPR) cochetauchich visokuu aktivnost kolonizaciikornei i ingibirovania fitopatogenich gribov]. Mikrobiologia, 71 (4), 521-525 (in Russian.).

Kravchenko L. V., Shaposhnikov N. M., Makarova N. M., 2011. Specific features of root exudates of plants and its changes in rhizosphere under the influence soil microflora [Vidovie osobennosti sostava kornevich videleniy rasteniy i ego izmenenie v rizosphere pod vliyzniem pochvennoy mikroflori]. Selscochozaystvennaya biologia, (3), 71-75 (in Russian.).

Kulrich I. K., Bulavenko L. V., Direnko D. I., Klimchuk D. A., 2009. Colonization of the rhizosphere of cucumber fosfatmobiliziruyuschimi bacteria of the genus Bacillus [Kolonizacia rizospheri ogurcov phosphatmobilizuuchimi bakteriami roda Bacillus]. Mikrobiologichniy jurnal, 71 (6), 14-21 (in Russian.).

Kundu B. S., Gaur A. C. 1984. Rice response to inoculation with N2-fixing and P-solubilizing microorganisms. Plant and Soil, 79, 227-234.

Kurakov A. V., Kostina N. V., 1997. Microbial colonization of the root surface in the early stages of plant development [Mikrobnaya kolonizacia poverchnosti korney na ranich stadiyach razvitiya rasteniy]. Microbiologia, 66 (3), 394 - 401 (in Russian.).

Kvasnikov E. I., Nesternko O. A., 1975. Lactic acid bacteria and ways to use them [Molochnokislii bakterii i puti ich ispolzovania]. Moskwa, Nauka (in Russian.).

Limanska N., Basiul O., Choiset Y., Zlatogurska M., Rabesona H., Maslovska N., Chobert Jean-Marc, Ivanytsia V., Haertle T. Effect of Lactobacillus plantarum ONU 12 on initial stages of growth of tomatoes. // Mikrobnie biotechnologii: aktualne I maibutne - Radostim-2012: Materiali mejdunarodnoy nauchno-prakticheskoy konferencii. Kiyv, 2012, 176-177.

Lobakova E. S., 2005. Associative microorganisms plant symbioses [Associativnii mikroorganizmi rastitelnich simbiosov]. Dissertacia…doktora biol. nauk. Moscow (in Russian).

Loktushov E. V., 2011. Resilience colonized plants to xenobiotics [Ustoychivost kolonizirovanich rasteniy k ksenobiotikm]. III Obcherossiyskaya studencheskaya elektronnaya nauchnaya konferencia «Studencheskiy forum».

Mantelin S., Touraine B. 2004. Plant growth-promoting bacteria and nitrate availability: impacts on root development and nitrate uptake. J. Exp. Bot, 55, 27-34.

Maudinas B., Chemardin M., Yovanovich E. et. al. 1981. Gnotobiotic cultures of rice plants up to ear stage in the absence of combined nitrogen source but in the presence of free living nitrogen fixing bacteria Azotobacter vinelandii and Rhodopseudomonas capsulate. Plant and Soil, 60, 85-97.

Morgun V. V., Kotz Y. Y., Kirichenko E. V., 2009. Growth-promoting rhizobacteria and their practical application [Roststimuliruuchie rizobakterii i ich prakticheskoie primenenie]. Fiziologia i biochimia kulturnich rasteniy, 41 (3), 187-207 (in Russian.).

Pigoleva S. V., Zacharchenko N. S., Yarmoshin A. A., 2011. Positive impact of colonization of sugar beet methylotrophic bacteria on the antioxidant defense system [Polojitelnoe vliyanie kolonizacii sacharnoi svekli metilotrophnimi bakteriyami na sistemy antioksidantnoy zachiti]. Izvestiya Tulskogo gosudarstvennogo universiteta, 3, 210-219 (in Russian.).

Rai S. N., Gaur A. C. 1988. Characterization of Azotobacter spp. and effect of Azotobacter and Azospirillum as inoculant on the yield and N-uptake of wheat crop. Plant and Soil, 109, 131-134.

Rzevskaya V. S. 2013. Application of lactic acid bacteria to stimulate seed germination of cucumber [Primenenie molochnokislich bakteriy dla stimulacii prorastania semyan ogurca]. Vserosiyskaya nauchnaya konferencia s mejdunarodnim uchastiem «Inovacionnie napravlenia sovremennoy fiziologii rasteniy». Moskwa, 84 (in Russian.).

Shaposhnikov A. I., Belimov A. A., Kravchenko L. V., Vivanko D. M., 2011. Interaction of rhizosphere bacteria with plants: mechanisms of formation and factors of associative symbioses efficiency (review) [Vzaimodeystvie rizosphernich baktery s rasteniami: mechanizmi obrazovania i faktori effektivnosti associativnich simbiosov]. Selscochozaystvennaya biologia, (3), 16-22 (in Russian.).

Sheludko A. V., Shirokov A. A., Sokolova M. K., 2010. Colonization of wheat roots by bacteria Azospirillum brasilebse with different mobility [Kolonizacia korney pshenici bakteriyami Azospirillum brasilebse s razlichnoy podvijnostu]. Microbiologia, 79 (5), 696 - 704 (in Russian.).

Vancura V., Hanzlikova A. 1972. Root exudates of plants. IV. Differences in chemical composition of seed and seedlings exudates. Plant and Soil, 36, 271-282.

Zacharchenko N. S., Pigoleva S. V., Kochetkov V. V., Chepurnov M. A., 2012. Impact associated pseudomonads and methylobacteria on growth and resistance of plants to pathogens and xenobiotics [Vliyanie associativnich pseudomonad i metilobakteriy na rost i ustoychivost rasteniy k phitopotogenam i ksenobiotikam]. Phiziologia rasteniy, 59 (1), 89-98 (in Russian.).

Zakry Fitri Abdul Aziz, Halimi Mohd Saud, Khairuddin Abdul Rahim, Osumanu Haruna Ahmed. 2012. Variable responses on early development of shallot (Allium ascalonicum) and mustard (Brassica juncea) plants to Bacillus cereus inoculation. Malaysian Journal of Microbiology, 8 (1), 47-50.

Размещено на .ru