Количественное определение содержания белка - Реферат

Еще на ранних этапах развития биохимии и, тем более, по мере того, как исследователи научились выделять индивидуальные белки, определять их состав и структуру, выяснять, когда и как они синтезируются в клетках, устанавливать, какие белки функционируют при различных условиях, сравнивать одинаковые белки из разных организмов, а также белки из клеток организмов дикого типа и мутантов и т.д., значение количественного определения содержания белка в изучаемом образце все возрастает. Любой метод, используемый для определения белка в бесклеточных экстрактах, показывает лишь общее содержание белка в образце. Едва ли не основным требованием, предъявляемым к методу количественного определения белка, является возможность использовать выбранный метод в присутствии разнообразных внутриклеточных компонентов и нечувствительность к компонентам буферных смесей, использованных для экстракции белков из клеток. Будут рассмотрены наиболее часто и широко используемые методы определения белка: метод Lowry с соавт. Например, метод Bradford довольно чувствительный, но калибровочный график имеет линейный участок в довольно узком интервале концентраций белка.Реактив Folin-Ciocalteu.100 г вольфрамата натрия, 25 мг молибдата натрия, 700 мл воды, 50 мл 85% фосфорной кислоты и 100 мл соляной кислоты кипятить 10 ч с обратным холодильником. Добавить 150 г сульфата лития, 50 мл воды и 3-4 капли бромной воды, кипятить в течение 15 мин. Все эти растворы можно хранить при комнатной температуре. Непосредственно перед определением приготовить рабочий раствор, для чего смешать 98 мл раствора 1, 1 мл раствора 2 и 1 мл раствора 3. К 100 мкл раствора белка в 0.5 M NAOH добавить 500 мкл свежеприготовленного реактива Lowry, инкубировать 10 мин, затем добавить 100 мкл разбавленного реактива Folin-Ciocalteu (разбавить исходный реактив дистиллированной водой в соотношении 1: 1), инкубировать 1 ч в темноте.

Содержание

Аннотация

Введение

Выбор метода определения белка

Калибровочный график (кривая)

Метод LOWRY

Метод BRADFORD

Определение белка с BCA реагентом

УФ-метод

Подготовка белкового образца

Список литературы

Приложение

Аннотация

У всех живых организмов белки - главнейшие работники, отвечающие за протекающие в клетках биохимические процессы, которые могут меняться при изменениях условий окружающей среды, патологических состояниях, а также как результат проявления мутаций и при многих других ситуациях. Еще на ранних этапах развития биохимии и, тем более, по мере того, как исследователи научились выделять индивидуальные белки, определять их состав и структуру, выяснять, когда и как они синтезируются в клетках, устанавливать, какие белки функционируют при различных условиях, сравнивать одинаковые белки из разных организмов, а также белки из клеток организмов дикого типа и мутантов и т.д., значение количественного определения содержания белка в изучаемом образце все возрастает.

Любой метод, используемый для определения белка в бесклеточных экстрактах, показывает лишь общее содержание белка в образце. Чтобы получить представление о составе белков и их индивидуальных свойствах и функциях, необходимо фракционирование сложных белковых смесей путем их хроматографического или электрофоретического разделения с целью последующего анализа индивидуальных белков. Понятно, что при всех перечисленных ситуациях необходимо определять содержание белка.

Едва ли не основным требованием, предъявляемым к методу количественного определения белка, является возможность использовать выбранный метод в присутствии разнообразных внутриклеточных компонентов и нечувствительность к компонентам буферных смесей, использованных для экстракции белков из клеток. Таким образом, "золотой стандарт" - это метод, характеризующийся специфичностью, чувствительностью, воспроизводимостью, быстротой и простотой проведения, а также отсутствием влияния небелковых компонентов. Сразу оговоримся, что пока не существует какого-то одного метода определения белка, который удовлетворяет всем перечисленным требованиям. У каждого метода есть свои преимущества и недостатки.

В связи с этим наша основная цель состоит в том, чтобы помочь в выборе наиболее приемлемого метода определения белка для конкретного исследования. Очевидно, что знание точной концентрации белка абсолютно необходимо для расчета, например, ферментативной активности. Ошибки в измерении концентрации белка приводят к накоплению общих ошибок в этих расчетах. Более того, в настоящее время все чаще исследователи используют коммерческие наборы для определения содержания белков (киты), что вполне оправдано, поскольку позволяет до определенной степени стандартизировать процедуру. Но пользователи коммерческих китов, к сожалению, не всегда представляют себе лежащие в их основе химические реакции, об этом также целесообразно рассказать.

Будут рассмотрены наиболее часто и широко используемые методы определения белка: метод Lowry с соавт. [1], метод Bradford [2], метод BCA (бицинхониновая кислота, от bicinchoninic acid) [3], а также УФ-спектрофотометрия, причем в их оригинальных вариантах. Кроме того, включена информация о некоторых приемах, использование которых помогает преодолеть ограничения, вызванные либо несовместимостью буферов с выбранным методом определения белка, либо низким содержанием белка в исследуемом образце.

Выбор метода определения белка

Самые распространенные исследования, для которых требуется предварительное определение содержания белка, - это изучение свойств и функций белков, различные варианты хроматографического и электрофоретического разделения белков (нативный и "голубой нативный" электрофорез, электрофорез в денатурирующих условиях, двумерный и диагональный электрофорез и др.). Подчеркнем, что для всех перечисленных выше анализов имеет значение не только точность определения, но и возможность нормализовать нередко большое число образцов, различающихся как по составу белков, так и по составу буферов, для их корректного сравнения.

Одним из наиболее ответственных моментов при определении концентрации белка является выбор совместимого с анализируемым образцом метода. Поскольку все описанные ниже методы основаны на специфических свойствах белков, то и состав белкового образца, и состав буфера являются главными определяющими пригодности метода.

Состав белкового образца является решающим при выборе метода. Если в пробе преобладают белки, обогащенные аминокислотными остатками аргинина, то при определении по Bradford результаты будут завышены, тогда как при использовании методов Lowry или BCA получаются более точные результаты. Напротив, пробы c цистеин-богатыми белками будут давать завышенные результаты с BCA, а при использовании методов Lowry или Bradford значения будут ближе к истинным. В целом, если необходимо определить содержание белка в сложных белковых смесях, то предпочтительней использовать методы Lowry и BCA.

Состав буфера также очень важен. Метод Lowry высокочувствителен к такому часто используемому компоненту буферной смеси, как ЭДТА, которая мешает образованию хромофора. Метод BCA совместим с широким спектром детергентов, включая додецилсульфат натрия (ДДС-Na), но не допускает восстановителей, например, дитиотрейтола (ДТТ). Метод Bradford не подходит для высоких концентраций детергентов, но вполне употребим для использования в присутствии восстановителей, таких как ДТТ или 2-меркаптоэтанол. В таблице приведены наиболее распространенные соединения и их предельно допустимые концентрации, которые могут мешать определению белка тем или иным методом. Если подобрать подходящий метод для конкретной буферной системы не удалось, то необходимо избавиться от мешающих определению соединений, например, осаждением белка, после чего белок можно растворять в соответствующем буфере.

Калибровочный график (кривая)

В отличие от бытующих представлений, опыт показывает, что калибровочный график не обязательно должен быть линейным. Диапазон концентраций белка для калибровки зависит от выбранного метода. Например, метод Bradford довольно чувствительный, но калибровочный график имеет линейный участок в довольно узком интервале концентраций белка. В идеале калибровочный график нужно строить в каждом опыте, что позволяет добиться более точных результатов. Особенно это касается методов Lowry и BCA, развитие окраски в которых не терминируется. При использовании метода Bradford могут наблюдаться значительные сдвиги калибровочных кривых, поэтому рекомендуется хотя бы периодически строить калибровочные графики. Практика показывает, что при использовании коммерческих наборов и стандартизации процедуры (время, температура) воспроизводимость калибровочных графиков достаточно высока.

Как правило, для построения калибровочного графика используется один стандартный белок, и очень важно выбрать его правильно. Если стандартный белок выбран неудачно, то это может привести к значительным ошибкам (как в сторону завышения, так и занижения) в расчетах абсолютного содержания белка. Однако это не помешает проводить сравнительные исследования содержания белков в различных образцах. Наиболее распространенными стандартами являются бычий сывороточный альбумин (БСА) и овальбумин, хотя у них есть некоторые ограничения, что необходимо учитывать при проведении исследований. Если для определения используется кит, в составе которого имеется раствор стандартного белка (чаще всего, БСА) с известной концентрацией, именно его и следует использовать для построения калибровочного графика.

Метод LOWRY

Этот метод основан на двух различных реакциях. Первая реакция состоит в образовании комплекса катионов меди с амидными связями, с последующим восстановлением меди в щелочных условиях. Получаемый продукт называется биуретовым хромофором, который необходимо стабилизировать добавлением тартрата [4]. Вторая реакция - восстановление реагента Folin-Ciocalteu комплексом восстановленной меди с амидными связями, а также аминокислотными остатками тирозина и триптофана. Реагент Folin-Ciocalteu в восстановленном виде имеет синий цвет, поэтому детектируется спектрофотометрически в диапазоне длин волн 500-750 нм. Сама по себе биуретова реакция не очень чувствительна. Использование реагента Folin-Ciocalteu повышает чувствительность метода почти в 100 раз.

Метод относительно чувствительный, но требует больше времени, чем другие, и чувствителен ко многим соединениям (таблица). Корректному определению мешают: детергенты, углеводы, глицерин, трицин, ЭДТА, Трис, соли калия, сульфгидрильные соединения, дисульфиды, фенолы, гуанин, ксантин, магний и кальций. Многие из этих веществ используются в буферах для гомогенизации или подготовки белковых проб. Это является одним из основных ограничений этого метода. Помимо этого, метод мало пригоден для измерения содержания гидрофобных белков или содержания белка в мембранных фракциях. Также метод Lowry чувствителен к изменениям в содержании аминокислотных остатков тирозина и триптофана. Линейность калибровочного графика при использовании БСА в качестве стандарта наблюдается до концентрации белка в пределах 1500-2000 мкг/мл. Хотя спектр поглощения окрашенного продукта реакции приходится на 500-750 нм, обычно используют длину волны 660 нм. Другие длины волн также могут использоваться, и это позволяет уменьшить эффект от "загрязнения" пробы посторонними веществами. Например, в образцах, выделенных из растительных объектов, хлорофилл будет мешать измерению при 660 нм, но не при 750 нм. Если при 660 нм значения оптической плотности оказались низкими, то измерение поглощения при 750 нм может повысить чувствительность.

Метод BRADFORD

Это простой, быстрый, недорогой и чувствительный метод определения содержания белка, вследствие чего он является одним из наиболее популярных. Его основное достоинство - чувствительность; метод позволяет надежно определять по 10 до 100 мкг/мл белка.

Метод основан на прямом связывании Кумасси G-250 с аминокислотными остатками аргинина, триптофана, тирозина, гистидина и фенилаланина в белке, причем с аргинином связывается в восемь раз чаще, чем с другими аминокислотными остатками. Поэтому, если известно, что белок обогащен остатками аргинина (например, гистоны), то в качестве стандарта необходимо также использовать аргинин-богатый белок. Комплекс Кумасси-аргинин имеет максимум поглощения при 595 нм, тогда как сам краситель в растворе - при 470 нм.

Спектры поглощения комплекса и чистого красителя перекрываются, поэтому очень важно следить за соотношением объемов красителя и белка, так как их неконтролируемое изменение будет приводить к ошибкам измерения. Если по какой-то причине метод Bradford используется для определения белка в широком диапазоне концентраций (до 1500 мкг/мл), то очевидно, что калибровочный график не будет линейным. Однако им можно пользоваться, если "разбить" его на линейные отрезки с целью получения линейного уравнения для каждого линейного участка. Далее полученные уравнения можно будет применять при расчетах.

Другой, вероятно, наиболее важный аспект, возникающий при использовании метода - это возможное взаимодействие компонентов буфера образца с красителем (таблица). Необходимо проверять реакцию буферной смеси, в которой находится белок, на взаимодействие с красителем. В случае наличия взаимодействия, необходимо удалить взаимодействующие с красителем компоненты при помощи одного из методов, описанных ниже.

Следует отметить, что для измерения лучше использовать стеклянные кюветы, так как на стенках кварцевых и, тем более, пластиковых кювет адсорбируется значительное количество красителя.

Определение белка с BCA реагентом

Этот метод основан на взаимодействии ионов Cu2 с белками в щелочных условиях, что приводит к переходу катионов Cu2 в Cu , которые детектируются с высокой чувствительностью бицинхониновой кислотой. При этом зеленый цвет реагента меняется на пурпурный, причем интенсивность окрашивания пропорциональна концентрации белка в растворе. Долгое время считалось, что механизм, лежащий в основе это метода, похож на механизм метода Lowry, но сейчас известно, что это две разные реакции с ионами меди, уникальные для метода BCA [5]. Первая реакция протекает при низких температурах и является результатом взаимодействия меди и BCA с аминокислотными остатками цистеина, цистина, триптофана и тирозина. При повышении температуры пептидная связь также ответственна за развитие окраски. Таким образом, проведение реакции при 37°С, а не при комнатной температуре повышает чувствительность и уменьшает колебания измерений в зависимости от аминокислотного состава белков. Следует помнить, что после 37°С оптическая плотность контрольной пробы увеличивается примерно на 2% за каждые 10 мин, поэтому после охлаждения пробы до комнатной температуры следует сразу же приступать к измерению. Чувствительность этого метода можно повысить, если инкубировать пробы при 60°С.

Бицинхониновая кислота заменяет реагент Folin-Ciocalteu, используемый в методе Lowry. BCA образует комплекс с Cu , который имеет максимум поглощения при 562 нм. Преимущество этого реагента в том, что он не взаимодействует со многими компонентами буферных смесей, особенно с детергентами. Вещества, которые могут мешать определению, - это либо восстановители Cu2 (например, ДТТ), либо хелаторы (ЭДТА). Тем не менее, эти компоненты буферов не являются критическими, поэтому от них довольно легко можно избавиться.

Этот метод можно использовать для измерения белка в широком диапазоне (до 2000 мкг/мл), причем линейность калибровочного графика наблюдается практически во всем диапазоне концентраций.

Достоинство метода состоит и в том, что он нечувствителен как к ионным, так и неионным детергентам. В связи с этим, метод может успешно применяться для определения содержания мембранных и гидрофобных белков.

УФ-метод

Измерение спектра поглощения в УФ-диапазоне - наиболее быстрый и простой метод определения белка, но и наименее точный. Определение концентрации путем измерения УФ-поглощения, обычно при 280 нм, зависит от присутствия ароматических аминокислот в белках. Тирозин и триптофан поглощают при 280 нм, тогда как максимум поглощения фенилаланина - при 260 нм. Метод чувствителен к значениям РН и ионной силы, которые определяют пространственную организацию белков и их комплексов.

Если белковый образец загрязнен и неизвестен коэффициент молярной экстинкции белка, определение концентрации белка УФ-методом приведет к неправильным результатам. Этот метод рассмотрен только потому, что он может быть использован для быстрой оценки концентрации белка, предшествующей более точным измерениям, описанным выше. Для расчета приблизительной концентрации используется следующее уравнение [6]: концентрация белка (мг/мл) = 1.55А280 - 0.76А260.

Этот метод хорошо подходит для сравнения различных растворов одного белка. Если использовать раствор чистого белка с известным коэффициентом молярной экстинкции, то можно точно определить концентрацию, измерив оптическую плотность при 280 нм. Для многих индивидуальных белков коэффициенты экстинкции известны [7].

Но этот метод не подходит для измерений без предварительной очистки смеси белков от УФ-поглощающих компонентов, например, нуклеиновых кислот. Кроме того, различные белки отличаются по аминокислотному составу и поэтому имеют разные молярные коэффициенты поглощения, что следует учитывать при расчетах.

Кюветы из стекла и полистерола также поглощают УФ, поэтому для этого метода используют кварцевые кюветы. Метакрилатные пластиковые кюветы пропускают ~60% УФ 280 нм, и их также можно использовать. УФ-метод наименее чувствительный из всех, представленных выше. Но и его чувствительность может быть повышена при изменении длины волны от 210 до 225 нм [7]. Однако при этих длинах волн повышается вероятность ошибки измерения, так как в этом диапазоне поглощают практически все органические вещества. определение белок количественный метод

Подготовка белкового образца

Наиболее простой путь избавления от небелковых компонентов, мешающих определению белка, - это осаждение белка. В этом случае потребуется строить два калибровочных графика: первый - на основании разведений стандарта, осажденного таким же образом, что и опытная проба, а второй - используя те же разведения стандарта, но без осаждения, чтобы определить, сколько белка было потеряно в ходе осаждения.

Осаждение ацетоном является самым простым и совместимым с описанными выше методами определения белка. К раствору белка добавляют холодный (-20°С) 100% ацетон до конечной концентрации 80%. После инкубации не менее 1 ч при - 20°С белок осаждают центрифугированием (20 мин, 15 000 g, 4°С). Как правило, этих условий достаточно для осаждения белка, но если содержание белка в исходном растворе низкое, то могут потребоваться более высокие скорости центрифугирования. Затем следует осторожно отобрать надосадочную жидкость. После этого необходимо высушить осадок при комнатной температуре или при - 20°С. Очень важно не пересушить осадок белка, в противном случае могут появиться сложности с растворением осадка в буфере/растворе, совместимом с выбранным методом определения белка. Хотя способ осаждения белка ацетоном прост, могут потребоваться большие объемы ацетона, вследствие чего нужно проводить несколько повторных центрифугирований, что удлиняет процедуру. В этом случае можно осаждать белок трихлоруксусной кислотой (ТХУ).

При осаждении белка ТХУ нужно знать, кислота какой концентрации необходима для осаждения белков, присутствующих в исследуемом образце. Другой очень важный момент, возникающий при использовании ТХУ, - убрать избыток кислоты перед растворением белкового осадка. К белковой пробе добавляют ТХУ до выбранной конечной концентрации, тщательно перемешивают и инкубируют не менее 30 мин во льду. Затем белок осаждают центрифугированием, как описано выше. После удаления надосадочной жидкости осадок белка промывают холодным (-20°С) 80% ацетоном. Для удаления ТХУ потребуется, по крайней мере, 3-4 отмывки. Отмытый от ТХУ осадок белка высушивают при комнатной температуре или при - 20°С, не пересушивая. Затем растворяют осадок в буфере/растворе, совместимом с выбранным методом определения белка.

Кроме ацетона и ТХУ, белок можно осадить смесью хлороформа с метанолом, которые берут в разных соотношениях в зависимости от природы белков, находящихся в исследуемом препарате. При этом образуются две фазы, разделенные белком. После тщательного удаления фаз осадок белка промывают метанолом, затем высушивают и растворяют в выбранном буфере.

Чтобы снизить концентрацию веществ, мешающих использованию выбранного метода определения белка, белковый препарат можно разбавить, но этот прием подходит только для образцов с высокой концентрацией белка.

Также можно избавиться или существенно снизить концентрацию несовместимых веществ путем перевода белков в другой буфер при помощи гель-фильтрация в миниколонках, например, PD-10 или NAC-5 и NAC-10 (GE Health Care) в соответствии с прилагаемыми инструкциям. Гель-фильтрация приведет к разбавлению белкового раствора, который можно концентрировать при помощи специальных концентрирующих фильтров.

Сейчас для определения содержания белка используют коммерческие наборы реактивов. Фирмы "Sigma", "Bio-Rad", "Pierce" и многие другие продают киты, которые давно и успешно применяются. Для тех читателей, которые хотят самостоятельно готовить реагенты, используемые в описанных выше методах, в Приложении приведем их "рецепты", а также соответствующие протоколы (микроформат) для каждого из рассмотренных выше методов определения содержания белка.

Авторы выражают благодарность Российскому фонду фундаментальных исследований за финансовую поддержку (гранты №№ 11-04-01006 и 11-04-01509).

1. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. P.265-275.

2. Bradford M.M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding // Anal. Biochem. 1976. V.72. P.248-254.

3. Smith P.K., Krohn R.I., Hermanson G.T., Mallia A.K., Gartner F.H., Provenzano M.D., Fujimoto E.K., Goeke N.M., Olson B.J., Klenk D.C. Measurement of Protein Using Bicinchoninic Acid // Anal. Biochem. 1985. V.150. P.76-85.

4. Gornall A.G., Bardawill C.S., David M.M. Determination of Serum Proteins by Means of the Biuret Method // J. Biol. Chem. 1949. V.177. P.751-766.

5. Wiechelman K.J., Braun R.D., Fitzpatrick J.D. Investigation of the Bicinchoninic Acid Protein Assay: Identification of the Groups Responsible for Color Formation // Anal. Biochem. 1988. V.175. P.231-237.

6. Layne E. Spectrophotometric and Turbidimetric Methods for Measuring Proteins // Methods Enzymol. 1957. V.3. P.447-455.

7. Fasman G.D. Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology. Boca Raton: CRC, 1989.601 p.

8. Stoscheck C.M. Quantitation of Protein // Methods Enzymol. 1990. V.182. P.50-68.

Размещено на .ru