Количественное определение полногеномного метилирования ДНК с помощью метил-чувствительной рестрикции и IMAGEJ анализа (MSR-IA) - Статья

Аномальное метилирование ДНК может приводить к отклонениям в эмбриогенезе и развитию различных патологий во взрослом состоянии, причем, если нарушения паттерна метилирования ДНК произошли в половых клетках, то такой измененный статус метилирования может наследоваться [3-6]. Все методы анализа метилирования ДНК базируются на трех основных принципах и их комбинациях (ферментативном гидролизе ДНК метил-чувствительными рестриктазами, химической модификации метилированного цитозина (бисульфитная конверсия), взаимодействии антител или метил-специфичных белков с метилированным цитозином) в сочетании с такими техническими подходами как хроматография, электрофорез, полимеразная цепная реакция, секвенирование, иммунопреципитация, масс-спектрометрия, ДНК-микрочип технология. Цель данной работы состояла в оптимизации метода метил-чувствительной рестрикции с использованием IMAGEJ анализа электрофореграмм (Methylation Sensitive Restriction-IMAGEJ Assay, MSR-IA) для количественной оценки полногеномного метилирования ДНК в CCGG сайтах. В представленной работе в качестве стандартных образцов с известным уровнем полногеномного метилирования ДНК были использованы образцы коммерческой неметилированной и метилированной ДНК человека («Human methylated and non-methylated DNA Set», «Zymo Research»). Значения «MGV» для “MSPI-вариантов” делили на значения «MGV» для “HPAII-вариантов” так получали значение «Relative gray value» («RGV») относительного уровня полногеномного метилирования ДНК по CCGG сайтам, выраженное в условных единицах (c.u.).Полученные в данной работе данные говорят о необходимости использования стандартных образцов с известным уровнем метилирования ДНК и необходимости вычисления коэффициентов уравнения линейной регрессии для определения истинного уровня полногеномного метилирования ДНК, выраженного в процентах. Результаты исследования указывают на то, что метод MSR-IA может быть использован для определения уровня полногеномного метилирования ДНК, хотя, он имеет определенные ограничения.

Метилирование ДНК является одним из основных эпигенетических механизмов регуляции экспрессии генов, инактивации Х-хромосомы и геномного импринтинга [1-4]. Аномальное метилирование ДНК может приводить к отклонениям в эмбриогенезе и развитию различных патологий во взрослом состоянии, причем, если нарушения паттерна метилирования ДНК произошли в половых клетках, то такой измененный статус метилирования может наследоваться [3-6]. Причинами нарушений метилирования ДНК могут быть как эндогенные, так и экзогенные факторы. В связи с этим во всем мире активно проводятся исследования метилирования ДНК не только при различных заболеваниях человека, но и при воздействии вредных факторов окружающей среды [7].

Для оценки уровня полногеномного, сайт- и ген(локус)-специфического метилирования ДНК предложен широкий спектр методов, описанию которых посвящено много обзоров литературы [8-18]. Все методы анализа метилирования ДНК базируются на трех основных принципах и их комбинациях (ферментативном гидролизе ДНК метил-чувствительными рестриктазами, химической модификации метилированного цитозина (бисульфитная конверсия), взаимодействии антител или метил-специфичных белков с метилированным цитозином) в сочетании с такими техническими подходами как хроматография, электрофорез, полимеразная цепная реакция, секвенирование, иммунопреципитация, масс-спектрометрия, ДНК-микрочип технология. Каждый из используемых в настоящее время методов имеет свои ограничения и недостатки, поэтому остается актуальным разработка и оптимизация методов анализа метилирования ДНК, которые одновременно были бы достаточно просты в применении, экономичны и эффективны. Цель данной работы состояла в оптимизации метода метил-чувствительной рестрикции с использованием IMAGEJ анализа электрофореграмм (Methylation Sensitive Restriction-IMAGEJ Assay, MSR-IA) для количественной оценки полногеномного метилирования ДНК в CCGG сайтах.

Материалы и методы.

В представленной работе в качестве стандартных образцов с известным уровнем полногеномного метилирования ДНК были использованы образцы коммерческой неметилированной и метилированной ДНК человека («Human methylated and non-methylated DNA Set», «Zymo Research»). Неметилированная форма ДНК получена из клеточной линии HCT116 DKO, которая является генетическим нокаутом по двум ДНК метилтрансферазам (DNMT1 и DNMT3b). ДНК этих клеток имеет низкий уровень метилирования (< 5% CPG) и поэтому часто используется как негативный контроль при анализе метилирования CPG динуклеотидов. Метилированная форма ДНК (100% CPG) этой же клеточной линии получена фирмой-производителем in vitro с помощью CPG-метилазы и служит в качестве позитивного контроля при анализе метилирования CPG динуклеотидов. На основе неметилированной и метилированной ДНК был сделан стандартный образец, моделирующий 50% уровень метилирования ДНК.

В качестве образца для анализа была использована ДНК с неизвестным уровнем метилирования, которая была выделена методом безфенольной хлороформной экстракции из лейкоцитов периферической венозной крови женщины 38 лет. Забор крови проводили в коммерческие вакуумные пробирки с K-ЭДТА (можно с Li-гепарином, как показывает наш опыт, на качество получаемой ДНК это не влияет). Цельную кровь инкубировали при 370С в течение 30-60 мин. Плазму с лейкоцитами переносили в 2 мл пробирки. Лейкоциты осаждали центрифугированием при 1000g в течение 10 мин. Если в осадке лейкоцитов присутствовала примесь эритроцитов, то проводили дополнительную инкубацию клеток в 1 мл раствора 5ММ ЭДТА при комнатной температуре в течение 20-30 минут. Затем полученный осадок лейкоцитов инкубировали в течение ночи при 550С в буфере для выделения ДНК (50 MM TRISHCL PH 8.0; 10 MM ЭДТА PH 8.0; 100 MM NACL, 1% SDS, 1 мкг/мкл протеинкиназа К). Экстракцию ДНК проводили с помощью смеси хлороформ:изоамиловый спирт (24:1) (без стадии с фенолом и повторяли 3 раза). Центрифугирование проводили при 1000g в течение 10 мин. ДНК осаждали этанолом. Высушенный осадок ДНК растворяли в бидистиллированной воде. Концентрацию полученной ДНК определяли спектрофотометрически.

Ферментативный гидролиз ДНК проводили с помощью метил-чувствительных эндонуклеаз рестрикции MSPI и HPAII, следуя рекомендациям фирмы-производителя ферментов («Thermo Scientific»). Рестрикционная смесь объемом 15 мкл содержала 33 ММ Трис-ацетат (PH 7.9), 10 ММ ацетат магния, 66 ММ ацетат калия, 0.1 мг/мл BSA, ферменты MSPI либо HPAII по 10 ед. на 350 нг геномной ДНК. Смесь инкубировали при 370С в течение 5.5 часов. Для одного и того же исследуемого образца ДНК в опыт брали три варианта: с MSPI, с HPAII и без добавления ферментов. Последний вариант служил контролем сохранности ДНК в реакционном буфере.

В качестве дополнительного контроля эффективности ферментативного гидролиза использовали плазмидную ДНК PUC19 (GENBANK accession number L09137) («СИБЭНЗИМ»). PUC19 (2686 пн) имеет G C состав 50.6%, содержит 173 CPG динуклеотидов (6.4%), 13 из которых находятся в сайте узнавания CCGG для MSPI (HPAII) (0.5%). Для сравнения геномная ДНК человека имеет G C состав 41-42%, частота CPG только около 1% [19, 20]. Теоретические расчеты показывают, что вероятность встречаемости CCGG составляет 44, т.е. через каждые 256 нуклеотидов, следовательно, в диплоидной клетке человека (5.8х109пн) может содержаться около 2.2х107 CCGG сайтов (0.4%). Поскольку 1 пг ДНК это 0.965?109 пн [21], то в 100 нг геномной ДНК человека (17.2х103 клеток) теоретически должно быть примерно 3.8х1011 CCGG сайтов, а в 100 нг PUC19 (35.9х109 молекул) около 4.7х1011 CCGG. Поэтому эффективность ферментативного гидролиза плазмидной ДНК PUC19, взятой в реакцию в большем количестве (500 нг), чем геномная ДНК (350 нг), может служить адекватным показателем полноты рестрикции исследуемой геномной ДНК человека.

После ферментативного гидролиза ДНК проводили электрофорез в 1% агарозном геле на 0.5ХТВЕ (50 минут, 40 МА). В лунки наносили весь объем рестрикционной смеси, к которому было добавлено по 2 мкл буфера для нанесения (0.01% бромфеноловый синий, 30% глицерин). ДНК визуализировали окрашиванием бромистым этидием (1мкг/мл) в течение 15 минут. Гель фотографировали (рис.1).

Рис. 1. Электрофореграмма ДНК человека и плазмиды PUC19 после рестрикции MSPI и HPAII (1% агарозный гель). Пунктирным прямоугольником приведен пример области измерения в IMAGEJ интенсивности флюоресценции ДНК, окрашенной бромистым этидием. электрофореграмма полногеномный image

Для оценки относительного уровня полногеномного метилирования ДНК изображения электрофореграмм в формате jpg обрабатывались программным комплексом IMAGEJ [22]. Для одного и того же исследуемого образца измеряли интенсивность флюоресценции Mean gray value («MGV») шлейфа фрагментированной ДНК на дорожках после рестрикции MSPI и HPAII. Площадь измерений для MSPI и HPAII дорожек была одинаковая и включала в себя всю ширину дорожки, начиная с зоны фрагментации геномной ДНК до области нахождения краски для нанесения бромфенолового синего (рис. 1). Значения «MGV» для “MSPI-вариантов” делили на значения «MGV» для “HPAII-вариантов” так получали значение «Relative gray value» («RGV») относительного уровня полногеномного метилирования ДНК по CCGG сайтам, выраженное в условных единицах (c.u.). Стандартная ошибка среднего вычислялась по формуле SD/vN, где SD-стандарное отклонение, N - количество пикселей в области измерений.

На основании значений «RGV», полученных для стандартных образцов ДНК с известным уровнем метилирования, в программе Excel вычисляли коэффициенты уравнения линейной регрессии и строили стандартную прямую зависимости уровня флюоресценции ДНК от уровня метилирования ДНК. Затем для образца с неизвестным уровнем метилирования ДНК устанавливали относительный уровень полногеномного метилирования CCGG сайтов, выраженный в %, используя полученные коэффициенты уравнения линейной регрессии (y=a BX). Стандартная ошибка вычислялась по формуле ? /vN, где N - количество образцов, использованных при построении уравнения линейной регрессии; ?-погрешность предсказания формулы. Значения ? вычислялись по формуле ? = ?yv(1-R2), где ?y2 - оценка дисперсии случайной величины Y (т.е. в нашем случае % CCMEGG); R - коэффициент корреляции [23].

Результаты и обсуждение.

Рассматриваемый в работе метод основан на классическом подходе с использованием метил-чувствительных эндонуклеаз-изошизомеров MSPI и HPAII [24]. Оба фермента распознают сайт 5’-CCGG-3’, но не активны, если был метилирован внешний цитозин. В тоже время при наличии метилирования внутреннего цитозина 5’-CCMEGG-3’ рестриктаза HPAII не распознает сайт, но все же может его разрезать в случае гемиметилированного состояния, но с меньшей эффективностью. Тогда как MSPI разрезает этот сайт независимо от состояния метилирования внутреннего цитозина [25, 26].

В данной работе, используя коммерческие образцы с известным уровнем метилирования ДНК (линии HCT116 DKO человека), была проверена эффективность применения нескольких формул, описанных в публикациях [8, 26, 27], для определения относительного уровня полногеномного метилирования CCGG сайтов в сравнении с вариантом вычислений, предлагаемых нами (см. «Материалы и методы», Таблица 1). Вычисления проводились по следующим формулам: Формула № 1 [8]: , Формула № 2 [26]: , Формула № 3 [27]: , где MSPI и HPAII - флюоресценция образца после рестрикции соответствующей рестриктазой.

Таблица 1. Относительный уровень полногеномнгого метилирования CCGG сайтов в коммерческих образцах с известным уровнем метилирования ДНК (линия HCT116 DKO человека), вычисленный по формулам, описанным в работах [8, 26, 27].

Примечание: * - уровень флюоресценции ДНК в агарозмом геле по результатам измерений в IMAGEJ; MGV-mean gray value; SD-standard deviation; c.u.- conventional units

Как видно из таблицы, получаемые значения относительного уровня полногеномного метилирования ДНК с использованием вышеописанных формул не дают точную информацию об истинном уровне метилирования ДНК, поэтому нами был использован другой вариант вычислений, как описано в разделе «Материалы и методы». Значения коэффициентов уравнения линейной регрессии y=423.668x-401.206 были получены с помощью регрессионного анализа в программе Excel и online-версии «Математическая статистика. Ковариация. Корреляция. Линейная регрессии» [23]. Коэффициент корреляции R=0.998, уровень значимости р=0.042, погрешность уравнения ?y/x=2.702, стандартная ошибка=1.560. В нашем случае Х (ось ОХ) - это значения «Relative gray value» («RGV») для стандартных образцов с известным уровнем метилирования ДНК; Y (ось OY) - это значения относительного уровня метилирования ДНК, выраженные в % (рис. 2). Результаты, представленные в таблице 2, показывают, что вычисленные таким способом значения уровня полногеномного метилирования ДНК, выраженные в %, более соответствуют действительности, чем при вычислении по формулам из публикаций [9, 26, 27].

Рис. 2. Графическое изображение уравнения линейной регрессии, полученного для стандартных образцов ДНК клеточной линии человека HCT116 DKO c известным уровнем метилирования ДНК. График отражает прямую линейную зависимость между полученными в IMAGEJ значениями «Relative Gray Value» и уровнем полногеномного метилирования ДНК в CCGG сайтах.

Таблица 2. Относительный уровень полногеномного метилирования CCGG сайтов в коммерческих образцах с известным уровнем метилирования ДНК (линия HCT116 DKO человека) по результатам измерений в IMAGEJ и использованием коэффициентов уравнения линейной регрессии, вычисленных в Excel.

Примечание: RGV-relative gray value (MSPI/HPAII); SE-standard error; c.u.- conventional units

Следует отметить, что для некоторых направлений научных исследований, где не требуется установления точного уровня метилирования ДНК (например, при изучении влияния ксенобиотиков на эпигеном), достаточно вычислить значения «RGV». В этом случае, чем больше будет значения «RGV» (выраженное в условных единицах), тем более метилированной является ДНК (таблица 2).

По аналогичной схеме был проведен анализ полногеномного метилирования ДНК человека с неизвестным уровнем метилирования (женщина, 38 лет) (рис.1, 3). Для данного образца ферментативный гидролиз проводили с разными концентрациями ДНК (400, 200, 100 нг), каждый вариант был в трех экземплярах для доказательства воспроизводимости результатов.

Рис. 3. Уровень полногеномного метилирования CCGG сайтов в ДНК лейкоцитов женщины. Представлены количественные оценки метилирования ДНК, выраженные в условных единицах (А) и процентах (В). На примере образцов ДНК разных концентраций (каждый вариант был сделан в трех экземплярах).

Показано, что вычисленные значения относительного уровня метилирования ДНК не зависят от концентрации исходной ДНК, взятой в анализ (Таблица 3). Необходимо подчеркнуть, что при использовании метода MSR-IA не следует брать в ферментативный гидролиз низкие концентрации ДНК (менее 150 нг), т.к. в этом случае повышается вероятность ошибочного установления относительного уровня метилирования ДНК, выраженного в процентах (Таблица 3).

Таблица 3. Относительный уровень полногеномного метилирвания CCGG сайтов в ДНК лейкоцитов человека. Полученные значения представлены в условных единицах и в процентах.

Примечание: * - средние значения по 3 экземплярам-дублям для каждого варианта концентраций ДНК; RGV-relative gray value; SE-standard error; c.u.- conventional units

Следует отметить, что по одним данным доля метилированного цитозина в геноме человека в норме составляет 80-90 % [9], по другим - 70-80% [13], но эти значения достаточно усредненные и не учитывают возможные индивидуальные различия, а также дифференциальный ткане/клетка-специфичный и локус-специфичный характер метилирования ДНК, поэтому полученный нами уровень полногеномного метилирования CCGG в лейкоцитах женщины 38 лет вписывается в эти рамки условной нормы.

Полученные в данной работе данные говорят о необходимости использования стандартных образцов с известным уровнем метилирования ДНК и необходимости вычисления коэффициентов уравнения линейной регрессии для определения истинного уровня полногеномного метилирования ДНК, выраженного в процентах. Результаты исследования указывают на то, что метод MSR-IA может быть использован для определения уровня полногеномного метилирования ДНК, хотя, он имеет определенные ограничения. К недостаткам метода относится то, что полногеномное метилирование анализируется только по сайтам узнавания метил-чувствительных рестриктаз и для исследования одного образца требуется порядка 1 мкг ДНК. Кроме того, всегда существует вероятность неполного гидролиза ДНК или различий в активности ферментов, чувствительных и нечувствительных к метилированию. Для исключения этого в эксперимент рекомендуется брать контрольный образец плазмидной ДНК (например, PUC19, PBR322, PBLUESCRIPT) в концентрациях, превышающих концентрации геномную ДНК человека, взятой в анализ. Важным преимуществом метода MSR-IA является методическая простота, меньшая трудоемкость и достаточная дешевизна по сравнению с методами, требующими использования антител, метил-специфичных белков, бисульфитной обработки, ПЦР, секвенирования и т.д. Предлагаемый методический подход может быть использован для выявления эпигеномных нарушений, вызванных вредными факторами окружающей среды, а также в диагностических целях в клинической медицине.

1. Patkin, E.L. Epigenetic mechanisms for primary differentiation in mammalian embryos // Rev. Cytology. - 2002. - Vol. 216. - P.81-130.

2. Lim, D.H.K., Maher, E.R. DNA methylation: a form of epigenetic control of gene expression // Obstetrician and Gynaecologist. - 2010. - Vol. 12. - P. 37-42.

3. Smith, Z.D., Meissner, A. DNA methylation: roles in mammalian development // Rev. Genetics. - 2013. - Vol. 14. - P. 204-220.

4. Patkin, E.L. Epigenetical mechanisms of human common diseases. - St.Petersburg: Nestor-Story, - 200 p. (Паткин Е.Л. Эпигенетические механизмы распространенных заболеваний человека. - Санкт-Петербург: Нестор-История, 2008. - 200 с.)

5. Patkin, E.L., Quinn, J. Epigenetical mechanisms of susceptibility to complex human diseases // J. Genetics: Applied Res. - 2011. - Vol. 1 (5). -P. 436-447.

6. Patkin, E.L., Sofronov, G.A. Population epigenetics. ecotoxicology. and human diseases // J. Genetics: Applied Res. - 2013. - Vol. 3 (5). - P. 338-351.

7. Filina, Yu.V., Gabdulkhakova, A.G.. Arleyevskaya, M.I. The methods of analysis of DNA methylation // Rus. Clinical laboratory diagnostics. - - №8. - P. 15-18. (Филина Ю.В., Габдулхакова А.Г., Арлеевская М.И. Методы анализа метилирования ДНК // Клиническая лабораторная диагностика. - 2012. - № 8. - P. 15-18.)

8. Skryabin, N.A., Kashevarova, A.A., Denisov, E.V., Lebedev, I.N. Methods of DNA methylation analysis: possibilities and limitations of their application in oncology // Siberian oncological journal. - - № 6 (60). P. 64-69. (Скрябин Н.А., Кашеварова А.А., Денисов Е.В., Лебедев И.Н. Методы исследования метилирования ДНК: возможности и перспективы использования в онкологии // Сибирский онкологический журнал. - 2013. - № 6 (60). - P. 64-69.)

9. Oakeley, E.J. DNA methylation analysis: a review of current methodologies // Pharmacology and Therapeutics. - 1999. - Vol. 84. - P. 389-400.

10. Zuo, T., Tycko, B., Liu, T-M., Lin, H-J.L., Huang, T.H-M. Methods in DNA methylation profiling // - 2009. - Vol. 1(2). - P. 331-345.

11. Shen, L. A., Waterland, R.A. Methods of DNA methylation analysis // Cur. Opin. Clin. Nutrition and Metabolic Care. - 2007. - Vol. 10. - P. 576-581.

12. Zilberman, D., Henikoff, S. Genome-wide analysis of DNA methylation patterns // Development. - 2007. - Vol. 134. - P. 3959-3965.

13. Gupta, R., Nagarajan, A., Wajapeyee, N. Advances in genome-wide DNA methylation analysis // Biotechniques. - - Vol. 49(4).- P. iii-xi.

14. Laird, P.W. Principles and challenges of genome-wide DNA methylation analysis // Nat. Rev. - 2010. - Vol. 11. - P. 191-203.

15. Rauch, T.A., Pfeifer, G.P. Methods for assessing genome-wide DNA methylation. - Handbook of epigenetics: The new molecular and medical genetics. - Elsevier Inc. - - Chapter 9. - P. 135-147.

16. Dhingra, T., Mittal, K., Sarma, G.S. Analytical Techniques for DNA Methylation - An Overview // Pharm. Analysis. - 2014. - Vol. 10. - P. 71-85.

17. Wang, S., Lv, J., Zhang, L., Dou, J., et al. METHYLRAD: a simple and scalable method for genome-wide DNA methylation profiling using methylation-dependent restriction enzymes // Open Biology. - 2015. - Vol. 5. - P. 150130.

18. Scarano, E., Iaccarino, M., Grippo, P., Parisi, E. The heterogeneity of thymine methyl group origin in DNA pyrimidine isostichs of developing sea urchin embryos // Natl. Acad. Sci. USA. - 1967. - Vol. 57 (5). - P. 1394-1400.

19. Kryukov, K. Genome Composition Database. List of species. Saitou lab. National Institute of Genetics. (2006-2010) [Electronic resource] URL: http://esper.lab.nig.ac.jp/study/genome/?page=genome_composition_database_species_list (Accessed 25.03.2016.)

20. Lewin, B. Genes. J. Wiley and Sons. New York. Chichester. Brisbane. Toronto. Singapure. (Льюин Б. Гены. Пер с англ. - М.: Мир, 1987. - 544 с.)

21. Rasband, W.S. IMAGEJ. U.S. National Institutes of Health. Bethesda. Maryland. USA. (1997-2015). [Electronic resource] URL: http://imagej.nih.gov/ij/ (Accessed 01.09.2014.)

22. ONLINE-higher mathematics services. Math statistics. Covariance, correlation, linear regression. [Electronic resource] URL: http://www.math-pr.com/stst_3v_1.php (Accessed 12.03.2016.)

23. Waalwijk, C., Flavell, R.A. MSPI an isoschizomer of HPAII which cleaves both unmethylated and methylated HPAII sites // Acids Res. - 1978. - Vol. 5. - P. 3231-3236.

24. New England Biolabs Catalog and Technical Reference. New England Biolabs. Ipswich. MA. 2005-2006. - P. 266-267.

25. Wentzel, J.F., Gouws, C., Huysamen, C., van Dyk, E., Koekemoer G., Pretorius P.J. Assessing the DNA methylation status of single cells with the comet assay // Analytical Biochemistry. - 2010. - Vol. 400. - P. 190-194.

26. Errante, P.R., Perazzio, S.F., Rodrigues, F.S.M., Ferraz, R.R.N., Caricati-Neto, A. Global DNA methylation pattern and correlation with complement system proteins in Brazilian patients with systemic lupus erythematosus // CONSCIENTIAE Saude. - 2014. - Vol. 13(4). - P. 516-523.

Размещено на .ru