Одержання високоефективних ферментних препаратів колагенази і кератинази. Умови біосинтезу, фізико-хімічні властивості і субстратна специфічність. Вплив індукторів різної природи на синтез та активність ферментів. Розробка методів виділення і очистки.
Так, за гідроліз таких важкорозчинних білків, як колаген і кератин, відповідають колагенази і кератинази, унікальна субстратна специфічність яких дозволяє використовувати дані ферменти як в науково-теоретичній роботі - для встановлення структури колагенів і кератинів, так і в практиці - в медицині, в косметології, в шкіряній промисловості, для утилізації відходів деяких виробництв. Мікробні джерела виділення цих ферментів, в порівнянні з протеазами тваринного і рослинного походження, мають такі переваги: більш доступні і дешеві, мають різні фізико-хімічні властивості і субстратну специфічність, що дозволяє використовувати в різних галузях і при різних умовах. В цілому, різноманіття властивостей колагеназ і кератиназ і можливості їх використання вивчені недостатньо, а в Україні, незважаючи на значні досягнення в області вивчення протеаз, потреби народного господарства в препаратах з різною специфічністю задовольняються тільки за рахунок ферментів закордонного виробництва. Метою досліджень було одержання високоефективних препаратів колагенази і кератинази, вивчення фізико-хімічних властивостей і субстратної специфічності для розробки основ їх практичного застосування. Відповідно до поставленої мети задачами наших досліджень були: пошук серед представників різних таксономічних груп мікроорганізмів високоефективних продуцентів колагенази і кератинази;Культивування стрептоміцетів здійснювали періодичним способом в умовах качалок (n=220 об/хв) при температурі 26-28ОС протягом 4 діб на середовищі такого складу (г/л): мальтоза - 40,0; індуктор (шерсть, міздря) - 20,0; KH2PO4 - 0,5; NACL - 0,5; ZNSO4x7H2O - 0,02; CACL2 - 0,01; MNCL2x4H2O - 0,01; РН 7,2-7,4 (Валагурова и др., 1988). Казеїнолітичну (загальну протеолітичну) активність визначали за методом Ансона в модифікації Петрової (1960). Активність виражали в одиницях, які відповідали кількості мікромолей тирозину, що вивільнився з казеїну при ферментативному гідролізі в умовах досліду. Колагеназну активність визначали за поглинанням в УФ світлі при 280 нм продуктів гідролізу колагенвмісної сировини (Бондарчук и др., 1982) і в реакції з нінгідриновим реактивом продуктів розщеплення колагену (Moore et al., 1948). Кератиназну активність визначали за поглинанням в УФ світлі при 280 нм продуктів гідролізу шерсті або пера (Noval et al., 1959) та колориметрично (?=590) - за зростанням вільних аміногруп в реакції з нінгідрином (Moore et al., 1948).В результаті скринінгу, який проводився серед 364 штамів мікроорганізмів різних таксономічних груп (176 штамів 24 родів мікроміцетів, 43 штама 2 родів дріжжів, 40 штамів бацил і 105 штамів стрептоміцетів), встановлено, що найбільша кількість активних штамів зустрічається серед представників стрептоміцетів (10,5%) (табл.1). 1382, рівень синтезу якими, відповідно, колагенази і кератинази був найвищим і досягав 2 Е/мл культуральної рідини. Дослідження специфічності дії культуральних рідин відібраних штамів показало, що вони проявляють ряд протеолітичних активностей, але найвищий рівень активності спостерігався по відношенню до колагену і кератину. Показано, що комплексний ферментний препарат Streptomyces sp. 1349, отриманий шляхом осадження сульфатом амонія 90% насичення, має два оптимуми колагеназної активності при РН 6,0 і 9,0 та при температурі 37-40 і 50-600С, що можна пояснити або наявністю кількох ізоформ колагенази, або кількох активних центрів на одній молекулі.Широкий спектр протеаз, які синтезуються стрептоміцетами, дозволяє отримувати з цього природнього джерела велику кількість різноманітних за своїми властивостями та специфічністю дії ферментів, а також їх ізоформ. Виходячи з цього існує реальна можливість регуляції їх біосинтетичної активності фізіологічними факторами. Для збільшення біосинтетичних властивостей штамів-продуцентів існує декілька шляхів, одним з яких є відбір в популяції штаму морфологічних варіантів з різною активністю досліджуваних ферментів. 1), встановлено, що варіанти I-го типу мають підвищений на 35,7% рівень активності, в той час як активність варіантів II-го і III-го типів знижена на 19,1 і 16,7% відповідно, а IV-го залишається на тому ж рівні, порівнюючи з активністю дикого типу (табл. Серед представників І (основного) типу було знайдено варіанти з рівнем активності, який перевищує активність вихідної популяції на 100-131%.Було показано, що всі досліджені джерела вуглецю і азоту (в тій чи в іншій мірі) позитивно впливали на ріст культур, але лише соєве борошно в комбінації з хлоридом амонію (рис. 1349, а нативний кератин курячого піря або овечої шерсті (як єдине джерело вуглецю і азоту) був оптимальним компонентом середовища для синтеза кератинази культурою Streptomyces sp. Таким, чином нами був визначений склад поживного середовища (в г/л): соєве борошно-5,0; NH4Cl - 10,0; KH2PO4 - 0,5; NACL - 0,5; ZNSO4x7H2O - 0,02; CACL2 - 0,01; MNCL2x4H2O - 0,01; РН 6,0-7,0, при культивуванні на якому активність колагенази у культуральній рідині Streptomyces sp. Для вивчення фізико-хімічних властивостей ко
Вы можете ЗАГРУЗИТЬ и ПОВЫСИТЬ уникальность своей работы
