Клонування та аналіз структури і функцій гена екзополігалактуронази ендофітної бактерії Klebsiella oxytoca VN13 - Автореферат

Позитивна дія даного препарату забезпечується реалізацією природних властивостей ендофітної бактерії Klebsiella oxytoca VN13, що має здатність до фіксації атмосферного азоту, синтезу гормонів росту рослин. Займаючи унікальну екологічну нішу у внутрішніх тканинах коренів, ці бактерії конкурують із місцевою патогенною мікрофлорою і запобігають ураженню кореневої системи рослин. Але пошук біохімічних чинників та їх генетичних детермінант ускладнюється відсутністю чітких фенотипових ознак у бактерій та рослини-хазяїна, які б вказували на сам факт та інтенсивність колонізації, як це спостерігається при симбіотичній взаємодії бульбочкових рослин із представниками родини бобових. Метою нашого дослідження було встановлення звязку між ефективністю внутрішньої колонізації коренів рослин бактерією K. oxytoca VN13 та функціонуванням системи пектинолізису цієї бактерії, а також окремих її компонентів; вивчення організації одного з генів пектинолізису та зясування його ролі в процесах взаємодії з рослинами. Обєктом дослідження були молекулярно-генетичні механізми взаємодії ендофітних бактерій з рослинами, а предметом дослідження-роль екзополігалактуронази в процесах інтеграції цих бактерій у внутрішні тканини кореня рослини.У роботі використовували штами: Klebsiella oxytoca VN13, K. oxytoca ATCC 13183, K. pneumoniae ATCC 13883, K. planticola ATCC 33531, Escherichia coli JM109, E. coli DH5?, E. coli JM109 lpir, E. coli S17-1 lpir, Erwinia carotovora subsp. carotovora 8982, E. carotovora subsp. atroceptica 9027, E. chrysanthemi 8183. Нуклеотидну послідовність ДНК визначали за методом Сенгера (Sanger et al., 1977) з використанням автоматичного секвенатора ALF Express та набору для секвенування “Cy5 AUTOCYCLE” (“Pharmacia Biotech”) Для аналізу визначеної нуклеотидної послідовності та виведеної амінокислотної послідовності полігалактуронази використовували програму “Gene Runner 3.00”. Використовуючи фериціанідний метод визначення відновлювальної здатності розчинів, що дає можливість визначення концентрації вільних альдегідних груп як міри ступеня деградації ПГН, встановлено, що лізат K. oxytoca VN13 має два піки пектолітичної активності - в кислій та лужній ділянках РН (рис.1). При дослідженні властивостей Pel -клонів K. oxytoca VN13, увагу привернули три особливості цих бактерій: 1) Pel -клони мали втричі вищий рівень ПЛ-активності; 2) при обробці такими бактеріями насіння пшениці ефективність колонізації внутрішніх тканин коренів проростків була значно вищою, порівняно з диким типом; 3) Pel -клони мали більший позитивний вплив на ріст проростків (табл.1). Експресія клонованого гена в E. coli мала прояви токсичної дії продукту на цю бактерію, тому, для забезпечення стабільності наслідування, фрагмент було переклоновано в плазміду PK18, що несе ген резистентності до канаміцину, з утворенням плазміди PKS2.Встановлено позитивну кореляцію між рівнем пектолітичної активності K. oxytoca VN13, ефективністю колонізації цією бактерією коренів рослин та рівнем її впливу на ріст проростків пшениці. Виділено Pel -форми K. oxytoca VN13 з підвищеною пектолітичною активністю та ефективністю колонізації коренів пшениці. Підвищена концентрація бактерій на поверхні та всередині коренів позитивно впливає на ріст проростків пшениці, що робить перспективним використання даних форм бактерій для виготовлення біопрепаратів. Створено мутант з інактивованим PEHX-геном, який зберігав здатність до колонізації внутрішніх тканин коренів рослин, що можна пояснити екзосубстратною специфічністю відповідного ферменту та його периплазматичною локалізацією. На основі унікальності визначеної послідовності ДНК PEHX-гена, розроблено праймери та відпрацьовано методику ідентифікації K. oxytoca методом ПЛР.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

1. Встановлено позитивну кореляцію між рівнем пектолітичної активності K. oxytoca VN13, ефективністю колонізації цією бактерією коренів рослин та рівнем її впливу на ріст проростків пшениці.

2. Виділено Pel -форми K. oxytoca VN13 з підвищеною пектолітичною активністю та ефективністю колонізації коренів пшениці. Підвищена концентрація бактерій на поверхні та всередині коренів позитивно впливає на ріст проростків пшениці, що робить перспективним використання даних форм бактерій для виготовлення біопрепаратів.

3. Створено плазмідний банк генів K. oxytoca VN13 та ідентифіковано клон з екзополігалактуроназною активністю. Визначено повну нуклеотидну послідовність клонованого та прилеглих ділянок ДНК, що, в цілому, становить 2541 н. п.

4. Проаналізовано промоторну ділянку гена PEHX та визначено регуляторні елементи, які вказують на існування KDGR -регулона в K. oxytoca VN13.

5. Створено мутант з інактивованим PEHX-геном, який зберігав здатність до колонізації внутрішніх тканин коренів рослин, що можна пояснити екзосубстратною специфічністю відповідного ферменту та його периплазматичною локалізацією. Даний мутант також зберігав здатність до засвоєння полігалактуронату натрію.

6. На основі унікальності визначеної послідовності ДНК PEHX-гена, розроблено праймери та відпрацьовано методику ідентифікації K. oxytoca методом ПЛР.

Перелік наукових праць, опублікованих за темою ДИСЕРТАЦІЇ

1. Петак А.М., Ковтунович Г.Л., Козыровская Н.А., Туряница А.И., Кордюм В.А. Взаимоотношения бактерий рода Klebsiella с растением. 2. Локализация бактерий Klebsiella oxytoca и K. terrigena в тканях табака и пшеницы // Биополимеры и клетка. - 1995. - Т. 11, № 6. - C. 75-79.

2. Kozyrovska N., Kovtunovych G., Gromosova E., Kuharchuk P., Kordyum V. Novel inoculants for an environmentally-friendly crop production // Resources, Conservation and Recycling. - 1996. - Vol. 18. - P. 79-85.

3. Kovtunovych G., Lar O., Kordyum V., Kleiner D., Kozyrovska N. Enhancing the internal plant colonization rate with endophytic nitrogen-fixing bacteria // Биополимеры и клетка. - 1999. - Т. 15, № 4. - С. 300-305.

4. Kovtunovych G., Lar O., Kamalova S., Kordyum V., Kleiner D., Kozyrovska N.. Correlation between pectate lyase activity and ability of diazotrophic Klebsiella oxytoca VN13 to penetrate into Plant Tissues by // Plant and Soil. - 1999. - Vol. 215.- P. 1-6.

5. Ковтунович Г.Л., Лар О.В., Козировська Н.О. Клонування та структурний аналіз peh-гена Klebsiella oxytoca VN13 // Биополимеры и клетка. - 2000. - Т.16, № 5. - С. 356-362.

6. Kovtunovych G. L., Lar О. V.,. Kozyrovska N. О. Ecologicaly-frendly crop production with microbial inoculants. III. Molecular detection of Klebsiella oxytoca in the environment // Науковий вісник Ужгородського національного університету. Серія біологія. - 2001. - № 9. - С. 79-80.

7. Ковтунович Г.Л., Лар О.В., Козировська Н.О. Роль гена екзополігалактуронази у процесах взаємодії Klebsiella.oxytoca VN13 з коренями проростків пшениці // Біополімери і клітина. - 2002. - Т. 18, № 4. - С. 319-323.

8. Kovtunovych G., Kordyum V., Kleiner D., Kozyrovska N. Correlation between pectate lyase activity and penetration inside the plant tissue in diazotrophic klebsiellas // Third European Nitrogen Fixation Conference. - Lunteren (The Netherland). - 1998. - P. 181.

9. Kovtunovych G., Lar О., Kozyrovska N. Molecular mechanisms of diazotrofic Klebsiella oxytoca enter inside the plant tissue: the role of polygalacturonase and pectate lyase // Fourth European Nitrogen Fixation Conference. - Seville (Spain). - 2000. - P. 151.

Размещено на .ru