Исследование состояния системы глутатиона в плазме и в эритроцитах крови у больных с острой и хронической церебральной ишемией. Анализ фармакодинамического влияния нейропротекторных препаратов разных фармакологических групп на уровень глутатиона.
При низкой оригинальности работы "Клинико-фармакологический анализ состояния системы глутатиона при церебральной ишемии", Вы можете повысить уникальность этой работы до 80-100%
Фунционирование системы глутатиона влияет на реализацию целого ряда важнейших физиологических процессов: детоксикации и антиоксидантной защиты; в биохимических превращениях витаминов C, E, липоевой кислоты и убихинона; в регуляции тиолдисульфидного равновесия и синтеза нуклеиновых кислот; в сохранении оптимального состояния и функций биологических мембран; в обмене ряда эйкозаноидов - простагландинов и лейкотриенов. Глутатион выступает и в качестве резерва цистеина в клетке; оказывает регулирующее влияние на синтез белков теплового шока; принимает участие в реализации механизмов программируемой клеточной гибели (Кулинский В.И., 2006; Liu H., et al,. Изучение терапевтического потенциала глутатиона представляется особенно важным у лиц старшей возрастной группы, так как с возрастом снижается эффективность модуляции антиоксидантной защиты (Ланкин В.З. и соавт., 2001; Городецкая Е.А. и соавт., 2004; Wunder C. et al., 2003; Werner E., 2004). Цель исследования: Разработать клинико-фармакологические подходы к оптимизации методов рационального использования лекарственных препаратов на основе анализа глутатионового антиоксидантного статуса в организме при ишемических нарушениях мозгового кровообращения у больных старших возрастных групп. Изучить действие 2-этил-6-метил-3-оксипиридина сукцината и фенилацетилролилглицина на показатели метаболизма системы глутатиона при хронической церебральной ишемии у пациентов пожилого и старческого возраста в зависимости от преморбидного фона и тяжести клинического состояния.
Список литературы
Материалы диссертации опубликованы в 40 печатных работах, изданных в отечественной и зарубежной печати.
Конкретное личное участие автора в получении результатов
Автором лично проведено планирование работы, поиск и анализ литературы по проблеме диссертации, набор больных, организация обследования пациентов, формирование базы данных и их статистическая обработка, анализ результатов, оформление работы, написание статей и диссертации.
Апробация материалов диссертации
Материалы диссертации представлены и обсуждены на Всероссийской конференции «Человек и здоровье» (Иркутск, 2004); на научно-практических конференциях с международным участием «Клиническая фармакология в России: достижения и перспективы» (Москва, 2004, 2005); на областной научно-практической конференции неврологов (Иркутск, 2005); на Российской научной конференции с международным участием «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии» (Курск, 2006); на I съезде клинических фармакологов Сибирского федерального округа (Барнаул, 2006); на научно-практической конференции «Медицинские и социальные проблемы геронтологии и гериатрии» (Иркутск, 2006); на первых международных курсах последипломного образования Европейской ассоциации по изучению сахарного диабета (Санкт-Петербург, 2007), на республиканских конференциях терапевтов и геронтологов (Бурятия: Улан-Удэ, 2007, 2008); на заседаниях Ассоциации неврологов Иркутской области (Иркутск, 2008), на заседаниях Ассоциации клинических фармакологов Иркутской области (Иркутск, 2007, 2008).
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 210 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, характеристики материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов и практических рекомендаций. Список литературы включает 319 источников. Работа иллюстрирована 40 рисунками и 31 таблицей.
Всем коллегам автор приносит благодарность за участие в совместных работах.
Содержание работы
1. Материалы и методы исследования
Работа выполнена на базе кафедры клинической фармакологии ГОУ ДПО «Иркутский государственный институт усовершенствования врачей» (ректор: профессор В.В.Шпрах) и на кафедрах биохимии и органической и бионеорганической химии ГОУ ВПО «Иркутский государственный медицинский университет» (ректор: профессор И.В.Малов). Объект исследования составили 238 пациентов с ЦИ (75 больных ИИ и 163 больных ДЭ), находившихся на стационарном лечении в Иркутском госпитале ветеранов войн (главный врач - А.В.Корякина) и в неврологическом отделении городской клинической больницы №8 города Иркутска (главный врач - к.м.н. Ж.В.Есева). Средний возраст пациентов - 71 ± 8,5 лет. Группы клинического сравнения включали 40 человек сопоставимого возраста без признаков цереброваскулярной патологии.
При выполнении клинического раздела работы анализировали анамнез заболевания, медицинскую документацию догоспитального этапа, данные объективного исследования при поступлении в лечебное учреждение и в динамике, результаты общеклинического обследования (анализы крови, мочи, биохимическое исследование крови, ЭКГ), при необходимости использовали дополнительные методы диагностики: КТ, МРТ, ультразвуковую доплерографию, РЭГ, ЭЭГ. Больные были проконсультированы неврологом, кардиологом, офтальмологом. В работе использованы стандарты диагностики ИИ и ДЭ, Международная классификация болезней Х пересмотра и классификация сосудистых поражений головного мозга Е.В. Шмидта (1985).
Группы клинического сравнения состояли из 15 и 25 человек аналогичного возраста без признаков цереброваскулярной патологии.
Больные с ДЭ (163 человека) состояли из пациентов, имеющих вторую (средняя степень тяжести) и третью (тяжелая степень) стадии хронической ишемии мозга; 41 человек имел в качестве сопутствующего заболевания сахарный диабет 2 типа. У больных с дисциркуляторной энцефалопатией в качестве средств фармакологической коррекции использовали 2-этил-6-метил-3-оксипиридина сукцинат и фенилацетилпролилглицин. Первый препарат применяли по 200 мг внутривенно капельно 10 дней, затем по 125 мг 3 раза в день до трех недель; второй - по 10 мг 2 раза в день на протяжении трех недель.
По степени тяжести заболевания из группы больных ишемическим инсультом было выделено три подгруппы пациентов. Для количественного определения степени утраты неврологических функций использовали Шкалу инсульта Национального института здоровья США (NIHSS) (Brott., et al., 1989) с дополнениями J. Biller et al., (1990). В контрольной группе оценка неврологического дефекта по шкале NIHSS составила - 0 баллов.
Первую подгруппу составили 9 больных с инсультом легкой степени (ИИ-I), неврологический дефект по шкале NIHSS у этих больных составил - 4,6±0,5 балла. Во вторую подгруппу вошли 32 пациента с инсультом средней степени тяжести (ИИ-II), неврологический дефект - 8,9±0,7 баллов, в третью подгруппу включены 34 больных с инсультом тяжелой степени (ИИ-III), неврологический дефект - 15,4±1,6 баллов.
Для изучения состояния системы глутатиона в зависимости от периода заболевания в подгруппе больных ИИ-II были определены пациенты, поступившие в стационар в сроки до 3 суток от начала заболевания (19 человек). Также выделены больные (13 человек), поступившие в стационар в сроки более 3 суток от развития ишемического инсульта.
Фармакотерапия, которая проводилась больным ишемическим инсультом средней и тяжелой степени, была разделена на два вида: стандартная (рекомендованная формулярными схемами) и с дополнительным использованием липоевой кислоты. Альфа-липоевую кислоту (АЛК) назначали больным внутривенно капельно в течение 10 дней по 600 мг в сутки, затем в течение 10 дней продолжался прием препарата в таблетированной форме по 600 мг в сутки. Анализ состояния системы глутатиона проведен у 26 больных ишемическим инсультом после фармакологической коррекции с использованим АЛК, в том числе у 13 больных ИИ средней и у 13 больных ИИ тяжелой степени.
Для определения концентрации восстановленного GSH и активности глутатионзависимых ферментов (ГПО, ГТ, ГР) дважды исследовалась кровь: при поступлении больных в стационар (до начала лечения) и при выписке из больницы (после лечения). Забор венозной крови проводился строго утром натощак.
В центрифужную пробирку помещали кровь с гепарином в количестве 6,5-7,5 мл. Центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 минут в холодильнике. Отделяли плазму, эритроциты дважды промывали холодным физиологическим раствором, затем гемолизировали холодной дистиллированной водой в соотношении 1:3.
Концентрацию GSH в плазме и эритроцитах определяли по методу Anderson M.E.(1989) c реактивом Элмана.
Активность ферментов исследовали на спектрофотометре СФ-26. Определяли активность трех ферментов: ГПО, ГР, ГТ.
Активность ГПО определяли по методу Stults F.N. et al. (1977), используя в качестве субстратов восстановленный глутатион и третбутилгидропероксид. Активность ГР вычисляли по методу Racker E. (1955). При определении активности ГР использовали трис-буфер, как и при определении активности ГПО.
Реакция, катализируемая ГР, выражается следующим уравнением: GSSG НАДФН Н > 2 GSH НАДФ
Уровень активности ГТ высчитывали по методу Habig N.H. et al. (1974), используя в качестве субстратов GSSG (1 ММ) и 2,4-динитрохлорбензол (1 ММ). Для определения активности ГТ использовали 0,1 М фосфатный буфер, содержащий 1 ММ ЭДТА, PH=6,5.
Активность ГПО и ГР оценивали по снижению экстинкции за 1 мин при ?=340 нм, что соответствовало снижению концентрации НАДФН.
Об активность ГТ судили по увеличению экстинкции за 1 минуту при ?=345 нм, что соответствовало накоплению конъюгата.
Активность всех ферментов пересчитывали на концентрацию белка в пробе (Б). Концентрацию белка оценивали на фотометре КФК-3 при ?=600 нм по методу Lowry O.H. et al. (1951) в модификации Ohnishi S.T., Barr G.R., (1978). В предварительно разведенные пробы супернатанта добавляли по 4 мл реактива BS-7 и 200 мкл реактива Фолина.
Расчет активности фермента производился по формуле: нмоль/мин на 1мг белка
Где: ?Е - изменение экстинкции за 1 минуту;
V - объем кюветы (2 мл для ГР и ГТ, 1 мл для ГПО);
Б - концентрация белка в пробе;
М - коэффициент молярной экстинкции (М= для ГПО, ГР; М= для ГТ).
Систематизированный материал в виде контрольных групп и групп исследуемых больных был подвергнут статистической обработке и представлен в виде таблиц и графических изображений. В качестве характеристик выборок количественных признаков рассчитывали среднее значение (M), стандартную ошибку (m) и стандартное отклонение (?). Средние значения в работе представлены в виде М ± m.
Для оценки статистической значимости различий количественных различий признаков в группах были использованы параметрический критерий признаков t Стьюдента и непараметрический - U-критерий Манна-Уитни.
Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимался равным 0,05.
Помимо описательной статистики и сравнительных критериев был использован многомерный метод - дискриминантный анализ (Юнкеров В.И. и соавт., 2005).
Полученные результаты обрабатывались с расчетом абсолютных и относительных величин. Обработка материала производилась с помощью современных статистических пакетов на персональном компьютере.
2. Результаты исследования и их обсуждение
Исследование состояния системы GSH проведено у 278 человек. В наблюдение было включено 238 больных с ИГМ, в том числе: 163 - с дисциркуляторной энцефалопатией (ДЭ) и 75 - с ишемическим инсультом (ИИ); 15 человек составили первую группу клинического контроля (для больных с ДЭ), 25 - вторую (для пациентов с ИИ).
О состоянии системы глутатиона при хронической церебральной ишемии данные разноречивы и скудны. В работах Signorelli S.S. (2001) и Hamanishi T. (2004) описывается активность ГПО при стенозе сонной артерии, при этом не указана степень поражения нервной системы. Важная роль глутатиона и ферментов его метаболизма в защите от ишемических повреждений головного мозга подтверждена рядом исследований (Медведева Л.В. и соавт., 2002; Меньшикова Е.Б. и соавт., 2008; Nagel.E. et al., 1997; Shaw C.A., 1997; Juurlink B.H. et al., 1998; Anderson M.F., 2002; Bains J.S. et al., 2003; Salim S. et al., 2003). Но использованный при этом подход не включал комплексной оценки изменений всех показателей системы глутатиона при различных стадиях церебральной ишемии. Накопленный клинический материал лишь позволяет выделить данную систему как компонент антиоксидантной защиты в организме и фактор влияния на формирование защитных приспособительных реакций, включающихся при церебральной ишемии (Tool J., 1995; Sacco R.L. et al. 2001). Не сформировано единого мнения о конкретных механизмах реализации нейропротекторного эффекта ряда фармакологических агентов. Нет оценки действия часто назначаемых лекарств при выраженном полиморбидном фоне у пациентов старших возрастных групп.
В нашем исследовании концентрация GSH определялась до начала лечения и после курса терапии в эритроцитах и плазме крови больных с хронической ишемией мозга. В первую группу вошли 22 пациента с ДЭ средней степени тяжести (ДЭ II), вторую группу составили 16 больных с ДЭ тяжелой степени (ДЭ III). В таблице 1 представлены показатели концентрации GSH и активности ферментов его метаболизма у больных с разными стадиями ХЦИ.
При поступлении в стационар до лечения изменения в системе глутатиона были выявлены в обеих группах исследуемых больных. Эти изменения носили в плазме и в эритроцитах разнонаправленный характер: уровень GSH в плазме повышался: при ДЭ II - на 51%; при ДЭ III - на 27% относительно значений контрольной группы, а в эритроцитах концентрация GSH снижалась: на 14% - при ДЭ II и на 20% - при ДЭ III, (р < 0,05; р < 0,01). Следует отметить, что установленное накопление глутатиона в плазме может косвенно отражать нарастающую при хронической церебральной ишемии неспособность тканей утилизировать данный биохимический субстрат. Таким образом, у больных с хронической ИМ концентрация восстановленного глутатиона в плазме возрастала (существенней при ДЭ II, меньше - при ДЭ III), тогда как в эритроцитах наблюдалось уменьшение накопления глутатиона (значимое при обеих стадиях).
При изучении уровня функциональной активности основных энзимов системы глутатиона установлено повышение активности в эритроцитах ГПО при ДЭ II; ГТ и ГР при ДЭ III; в плазме же усиливалось только функционирование ГТ (при сравнении с контролем). Между собой группы пациентов с разными стадиями хронической церебральной ишемии отличались только значениями ГТ в эритроцитах (р<0,05). Выявленные акценты в особенностях аккумулировании GSH, ГПО, ГТ и ГР в эритроцитах относительно показателей плазмы свидетельствует о том, что система глутатиона относится к внутриклеточным компонентам с высокой функциональной активностью. В свою очередь, концентрация глутатиона в плазме может косвенно отражать процессы, протекающие в тканях при патологических состояниях.
Нужно отметить, что при ДЭ III в спектре изменений ферментов глутатиона выявлено превалирование повышения активности ГТ на фоне разнонаправленных сдвигов концентрации GSH в плазме и в эритроцитах. С учетом данных о способности изучаемой системы к саморегуляции (Кулинский В.И., 1990; Mannervik B., 1997), можно предположить, что при тяжелой форме ХЦИ происходит ее «истощение». У больных ДЭ изолированная глутатионтрансферазная активация также может быть признаком запуска механизмов патоморфологических изменений, протекающих при хронической форме церебральной ишемии.
Уровень глутатиона и активность ферментов метаболизма GSH также исследовались у пациентов с ишемией головного мозга и сахарным диабетом 2 типа (с различными формами и разной степенью тяжести заболевания). В структуре сочетанной патологии сахарный диабет (СД) занимает лидирующее положение. Это частый «сопутствующий» фон у пациентов с цереброваскулярной патологией. Вследствие быстрого роста заболеваемости, высокой смертности, значительного процента инвалидизации, снижения качества жизни, СД представляет важную не только медицинскую, но и серьезную социальную проблему (Дедов И.И. и соавт., 2003; Klein R., 1995; Zimmet P., 1999). Причины усиления свободнорадикального окисления при сахарном диабете 2 типа многочисленны, важнейшими из них являются гипергликемия, гликирование белков и активация сорбитолового пути. Островки Лангерганса характеризуются низким содержанием антиоксидантных ферментов, поэтому легко подвергаются воздействию кислородных радикалов.
Таблица 1. Показатели системы глутатиона в эритроцитах и в плазме больных с хронической церебральной ишемией
Примечание: активность ферментов метаболизма GSH - в нмоль/мин на 1 мг белка; значимость различий с группой сравнения: * - р < 0,05, ** - р < 0,01, *** - р < 0,001; значимость различий между группами: а - р < 0,05, аа - р < 0,01, ааа - р < 0,001
При СД оксидативный стресс развивается вследствие гипергликемии, которая способствует увеличению интенсивности образования свободных радикалов (Чистяков Д.А. и соавт., 2000; Wentzel P. et al., 1999; Vantyghem M.C. et al., 2000; Esposito K. et al., 2002). В свою очередь свободные радикалы сами могут способствовать развитию гипергликемии (West I.C., 2000).
Неферментативное гликирование вследствие аутоокисления глюкозы также способствует развитию оксидативного стресса, так как гликированные белки являются источниками радикалов (Ceriello A., 1999; Oomen P.H.N. et al., 2004). Известна роль активных форм кислорода и активации ПОЛ в патогенезе СД и его осложнений (Занозина О.В. и соавт., 2004; Brownlee M., 2001). Показано, что при СД 2 типа снижается антиоксидантная защита (Zoric L., 2003).
Группа больных с этим патологическим фоном состояла из 41 человека. В первую подгруппу вошли 19 больных с ДЭ II и сахарным диабетом 2 типа средней степени тяжести, во вторую - 22 пациентов с ДЭ III с аналогичным клиническим статусом. Показатели активности ферментов метаболизма GSH в группе больных с ИГМ и СД 2 типа представлены в таблице 2.
Анализы этих пациентов отличало снижение уровня глутатиона в плазме и в эритроцитах при ДЭ II, при ДЭ III отмечалось уменьшение концентрации данного тиола только в эритроцитах. Активность ГПО возрастала в плазме и в эритроцитах при ДЭІІ, ГР в плазме - при ДЭІІІ, уменьшался уровень функционирования ГТ в плазме и в эритроцитах при ДЭ III, только в эритроцитах - при ДЭ II и снижалась активность ГР в эритроцитах у больных с ДЭ III (табл.2).
Таким образом, изменения в уровне глутатиона и функционировании ферментов его метаболизма у пациентов с сопутствующим сахарным диабетом 2 типа были многочисленны и разнообразны. Вероятно, это связано с уровнем интенсивности генерации АФК и накоплением продуктов пероксидации, более выраженной при сопутствующем сахарном диабете и конкретными сдвигами метаболических процессов при этой патологии (необходим учет наличия гипергликемии, степени компенсации сахарного диабета).
Таблица 2. Активность ферментов метаболизма глутатиона в эритроцитах и плазме крови больных с ишемией головного мозга и сахарным диабетом 2 типа
Показатель Субстрат Значение
Контроль I (n=15) ДЭ II и СД (n=19) ДЭ III и СД (n=22)
Примечание: Активность ферментов метаболизма GSH - в нмоль/мин на 1 мг белка; Значимость различий с группой сравнения: * - р < 0,05, ** - р < 0,01, ** * - р < 0,001; значимость различий между группами: а - р < 0,05, аа - р < 0,01, ааа - р < 0,001
Больные с ХИМ, у которых исследовалось состояние системы глутатиона при проведении фармакологической коррекции состояли из пациентов, имеющих среднюю степень тяжести дисциркуляторной энцефалопатии; 19 человек имели в качестве сопутствующего заболевания сахарный диабет второго типа. Использовали следующие препараты: 2-этил-6-метил-3-оксипиридина сукцинат и фенилацетилпролилглицин. Первый применяли по 200 мг внутривенно капельно 10 дней, затем по 125 мг 3 раза вдень до трех недель; второй по 10 мг 2 раза в день на протяжении трех недель.
Концентрация GHS в эритроцитах больных дисциркуляторной энцефалопатией средней степени тяжести после лечения 2-этил-6-метил-3-оксипиридина сукцинатом увеличилась на 13% (близка к уровню контрольной группе). Уровень активности ГПО возрос на 92%, функционирование ГТ увеличилось на 28%, ГР понизилось на 23%. Статистически значимыми были изменения ГПО в плазме и эритроцитах, ГТ и ГР в эритроцитах при сравнении с показателями до лечения (табл.3).
Таблица 3. Показатели концентрации глутатиона и активности ферментов его метаболизма в плазме и эритроцитах крови у больных дисциркуляторной энцефалопатией средней степени тяжести при фармакологической коррекции
Показатель Субстрат Контроль ДЭІІ до лечения (n=22) Лечение 1 (n=19) Лечение 2 (n=16)
Примечание: Концентрация глутатиона в эритроцитах - в мкмоль/мл. Активность ферментов метаболизма глутатиона - в нмоль/мин на 1 мг белка; Значимость различий с группой сравнения: * - р < 0,05, ** - р < 0,01, ** * - р < 0,001. Значимость различий между группами: а - р < 0,05, аа - р < 0,01, ааа - р < 0,001. Пл - плазма; эр - эритроциты; ДЭ II - дисциркуляторная энцефалопатия средней степени тяжести.
Лечение 1 - использование 2-этил-6-метил-3-оксипиридина сукцината; лечение 2 - использование фенилацетилпролилглицина.
При назначении фенилацетил-L-пролилглицина концентрация GHS в плазме больных дисциркуляторной энцефалопатией средней степени тяжести увеличилась на 45% (выше уровня контрольной группе). Уровень активности ГПО уменьшился на 21%, функционирование ГТ и ГР возросло на 18 и 11% соответственно. За исключением показателей ГР, изменения были статистически значимыми.
Концентрация GHS в эритроцитах больных дисциркуляторной энцефалопатией II и сахарным диабетом 2 типа после лечения 2-этил-6-метил-3-оксипиридина сукцинатом увеличилась на 10%. Уровень активности ГПО понизился на 38%, функционирование ГТ упало на 36%, ГР увеличилось на 12%. Статистически значимыми были изменения ГПО и ГТ при сравнении с показателями до лечения.
При назначении фенилацетил-L-пролилглицина концентрация GHS в плазме больных дисциркуляторной энцефалопатией II стадии и сахарным диабетом 2 типа понижается на 25%, Уровень активности ГПО в эритроцитах снижается на 12% (относительно показателей до лечения, р <0,05). Значения активности ГТ и ГР практически не изменяются.
Таким образом, у больных геронтологического возраста, страдающих хронической ишемией мозга и сопутствующим сахарным диабетом, выявлены многочисленные и разнообразные изменения в системе глутатиона. При дисциркуляторной энцефалопатии средней степени тяжести установлено уменьшение уровня глутатиона в плазме и эритроцитах, усиление функционирования глутатионпероксидазы в плазме и эритроцитах и снижение активности глутатионтрансферазы в эритроцитах; при дисциркуляторной энцефалопатии тяжелой степени тяжести - уменьшение накопления глутатиона в эритроцитах, снижение активности глутатионтрансферазы в плазме и в эритроцитах, глутатионредуктазы - в эритроцитах, и повышение функционирования глутатионредуктазы в плазме. Фармакологическая коррекция изменений системы глутатиона при дисциркуляторной энцефалопатии средней степени тяжести использованием 3-окси-6-метил-2-этилпиридина сукцината дает значимый клинический результат и нормализацию показателей антиоксидантного глутатионового статуса.
При отсутствии преморбидного фона назначение фенилацетил-L-пролилглицина способствует накоплению концентрации GHS в плазме больных дисциркуляторной энцефалопатией средней степени тяжести, нормализации функциональной активности ГПО и ГТ в эритроцитах.
При проведении клинико-фармакологического анализа состояния системы глутатиона при острой церебральной ишемии по степени тяжести заболевания из группы больных ишемическим инсультом было выделено три подгруппы пациентов. Для количественного определения степени утраты неврологических функций использовали Шкалу инсульта Национального института здоровья США (NIHSS) (Brott., et al., 1989) с дополнениями J. Biller et al., (1990). В контрольной группе оценка неврологического дефекта по шкале NIHSS составила - 0 баллов.
Первую подгруппу составили 9 больных с инсультом легкой степени (ИИ-I), неврологический дефект по шкале NIHSS у этих больных составил - 4,6±0,5 балла. Во вторую подгруппу вошли 32 пациента с инсультом средней степени тяжести (ИИ-II), неврологический дефект - 8,9±0,7 баллов, в третью подгруппу включены 34 больных с инсультом тяжелой степени (ИИ-III), неврологический дефект - 15,4±1,6 баллов.
Изменения активности ферментов глутатиона у больных ишемическим инсультом (ИИ) были обнаружены во всех трех группах исследуемых: ИИ-I, ИИ-II и ИИ-III. Причем качественные и количественные сдвиги коррелировали со степенью тяжести ИГМ. Так, если при ИИ-I отмечалось лишь повышение активности ГПО в плазме на 156 % (р<0,01), то при более тяжелых формах ИИ - средней и тяжелой степеней, была достоверно повышена активность ГТ и ГПО. У больных ИИ-II наблюдалось аккумулирование ГТ в эритроцитах на 57% (р<0,02), в плазме повышение концентрации GSH на 47% (р<0,05), активности ГПО на 67% (р<0,05), активности ГТ на 44% (р<0,05); а у больных ИИ-III возрастал уровень функционирования ГПО и в эритроцитах на 61% (р<0,05) и в плазме на 259% (р<0,005), в эритроцитах была повышена концентрация GSH на 22,5% (р<0,05) и активность ГР на 42% (р<0,05).
Известно, что ГПО играет значительную роль в защите клеток от СРО, входя в состав АОС, являясь одной из ее важных составляющих (Cohen G., 1985; Flohe L., 1989; Nair S. et al., 1990). Факт положительного влияния ГПО при ИГМ подтверждают опыты с трансгенными мышами со сверхэкспрессией ГПО, у которых возрастала устойчивость к ишемии (Dawson D.A. et al., 1995; Weisbrot-Leftkowitz M. et al., 1998; Furling D. et al., 2000; Crack P.J. et al., 2001; 2003; Ishibashi N. et al., 2002). Увеличение функционирования ГПО в эритроцитах в остром периоде ИИ, наиболее выраженное у больных с тяжелыми его формами, характеризует как активность АОС, так и тяжесть ИИ.
Прирост значений ГПО в плазме также свидетельствует о тяжести заболевания. Уровень функционирования ферментов метаболизма глутатиона в этой биосреде, по-видимому, отражает процессы, протекающие в тканях. В случаях ИИ тяжелой степени, сопровождающихся массивным повреждением ткани головного мозга, отеком, расширением периваскулярного пространства, возникает дефект гематоэнцефалического барьера (Kuroiwa T. et al., 1985; Pousset F., 1993), результатом которого и является повышение активности ГПО в плазме. В нашем исследовании у пациентов с более выраженной степенью поражения головного мозга - ИИ-III, мы наблюдали значительное увеличение активности ГПО как в эритроцитах крови (р < 0,005), так и в плазме (р < 0,05), (табл.4).
Таблица 4. Показатели системы глутатиона у больных ишемическим инсультом
Группы n Субстрат GSH ГПО ГТ ГР
Контроль 25 Эр 2,27±0,20 27,4±3,52 4,44±0,44 2,76±0,30
Пл 21,7±3,2 2,64±0,33 1,02±0,11 0,38±0,03
ИИ-I 9 Эр 2,08±0,19 36,2±6,13 4,95±0,64 3,09±0,59
Пл 25,1±3,0 6,77±1,31 ^*** 0,84±0,25 0,32±0,03
ИИ-II 32 Эр 2,47±0,22 35,2±3,11 6,99±0,77 ^** 2,37±0,19
Пл 31,9±3,8 4,40±0,68 ^* 1,47±0,19 ^* 0,45±0,04
ИИ-III 34 Эр 2,78±0,02 ^* 44,2±5,50 ^* 5,79±0,55 2,65±0,24
Пл 31,6±4,9 9,49±1,67 ^*** 1,16±0,18 0,54±0,06 ^*
Примечание: концентрация глутатиона в эритроцитах в ммоль/л; концентрация глутатиона в плазме - в мкмоль/л; активность ферментов - в нмоль/мин на 1мг белка. Значимость различий с группой сравнения: * - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001; ^ - увеличение показателя; эр - эритроциты, пл - плазма
ГТ также играет существенную роль в защите организма от активных форм кислорода, инактивирует ксенобиотики, участвует в метаболизме эйкозаноидов (Laughlin L.T. et al., 1998; Whalen R. et al., 1998; Cotton S.C. et al, 2000; Strange R.C. et al., 2000). В нашем исследовании выявлена повышенная активность ГТ в эритроцитах больных ИИ-II (р<0,02), но в плазме отмечена лишь аналогичная тенденция. Возрастание активности ГТ у больных ИИ вполне закономерно, а то, что при тяжелой форме ИИ этого не произошло, вероятно, связано с истощением данного фермента.
Формирование большей части инфаркта мозга, его сердцевины (cor), происходит в течение 3-6 часов от начала заболевания, в то время как изменения в периинфарктной зоне (penumbra) продолжаются 24-72 часа. Все это время свободнорадикальные процессы протекают, локализуясь, в основном, в зоне пенумбры. Прогноз ишемического инсульта во многом предопределен исходом данного процесса, от этого зависит не только степень поражения головного мозга и утраты его функций, но и сама жизнь больного.
Поэтому было важно определить активность АОС в зависимости от срока начала заболевания. Сведения о концентрации глутатиона и активности его ферментов в ранний период ИИ разноречивы. Zimmerman C. (2004), в своих исследованиях указывает на повышение концентрации глутатиона в первые часы заболевания, в работе Demirkaya S. et al. (2001) говорится о снижении активности ГПО в первые часы ИИ. О степени тяжести исследуемых больных и показателях остальных глутатионзависимых ферментов авторы не высказываются.
Среди больных ИИ-II мы выделили две группы пациентов с разными периодами поступления в стационар: до трех (ранний период) и после трех суток (поздний период) от дебюта заболевания.
У больных ИИ-II, поступивших в ранние сроки от развития инсульта, регистрировалось повышение активности ГПО и ГТ в эритроцитах (р < 0,05) и в плазме (р < 0,05) относительно контрольной группы. Активность ГПО в эритроцитах у этих больных возрасла на 55 % (р<0,01), в плазме на 96 %; ГТ в эритроцитах - на 81 % (р<0,01) и в плазме - на 48 % (р<0,05).
В то время как в группе больных с более поздними сроками забора анализов от наступления инсульта, этих изменений не наблюдалось. Уровень функционирования ГПО в эритроцитах практически был равен его позиции в контрольной группе. Данный факт можно трактовать как подтверждение того, что интенсивность СРО наиболее выражена в ранний период ИИ, В наших исследованиях это - первые три дня от развития заболевания.
Следует обратить внимание и на то, что более значимые изменения в системе глутатиона касались активности ГПО. По сути дела это - реализация определенной закономерности, ведь свободнорадикальные механизмы являются превалирующими в острый период инсульта, в то время как этапы глутамат-кальциевого каскада истощаются в первые часы заболевания. Поэтому вполне аргументировано выглядит установка, провести коррекцию изменений с назначением нейропротекторной терапии с использованием препаратов с антиоксидантным действием как можно раньше.
Нами также была предпринята попытка оценить эффективность лечения больных ИИ в зависимости от сроков назначения терапии. Для этого проведен анализ клинического состояния больных с разными временными периодами до начала госпитализации.
Регистрация данных проводилась в группе больных с ишемическим инсультом средней степени тяжести. Пациентов, поступивших в ранние сроки от развития инсульта (до трех суток), было 19 человек, после трех - 13. Констатация клинического состояния осуществлялась по шкале NIHSS (по критериям этой шкалы, чем выше сумма баллов, тем более выражен неврологический дефицит у больных). У поступивших в ранний период сумма баллов составила 9,6; у тех, кто был госпитализирован в более позднее время, - 7,7 балла. Очевидно, что больные, госпитализированные ургентно, имели больший неврологический дефект. И тем не менее, при выписке отмечено, что у «ранопоступивших» эффект от терапии был выше. После лечения оценка их клинического статуса по шкале NIHSS - 3,9 (улучшение на 5,7 балла), а у «позднопоступивших» пациентов - 5,9 (улучшение на 1,8 балла).
Как уже было отмечено, больные ИИ получали два варианта фармакологической коррекции. Первый - стандартная терапия, проводимая по рекомендованным российским формуляром схемам лечения. При втором варианте - в качестве дополнительного средства была использована АЛК.
Критерием эффективности лечения служили клиническая оценка состояния больных по шкале NIHSS и изменения показателей системы глутатиона.
Лечение прошел 51 пациент с ишемическим инсультом: 5 больных - ИИ-I, 26 больных - ИИ-II и 20 больных - ИИ-III (у 50% последних - летальный исход). Результаты у больных ИИ-I не анализировались изза малого количества наблюдений.
Итогом стандартной коррекции было лишь снижение активности ГПО в эритроцитах у больных ИИ-II (р < 0,05). Этот результат вполне объясним. Активизация свободнорадикального окисления при церебральной ишемии инициирует систему антиоксидантной защиты в организме; после лечения падает интенсивность СРО, и вместе с тем устраняется активность ГПО как показателя АОС, что мы и наблюдали у пациентов с ИИ-II и ИИ-III.
Таблица 5. Оценка клинического состояния больных ишемическим инсультом средней и тяжелой степени по шкале NIHSS в зависимости от вида фармакотерапии
Группы Виды лечения n Возраст (лет) Показатели NIHSS (баллы) Динамика (%)
До лечения После лечения
ИИ II Стандартная терапия 13 63,7 8,6±0,9 4,9±0,6 43,0v**
Лечение с АЛК 13 63,3 9,2±1,2 3,5±0,9 61,9v***
ИИ III Стандартная терапия 8 69,5 16,2±1,6 11,6±2,3 28,4v*
Лечение с АЛК 13 68,4 14,9±1,6 8,2±1,6 44,9v***
Примечание: значимость различий между группами: * - р < 0,05, ** - р < 0,01, *** - р < 0,001; v - уменьшение показателя; АЛК - альфа-липоевая кислота
Эффективность воздействия АЛК была оценена у 26 больных, из них 13 - с ИИ-II и 13 - с ИИ-III. Сравнивались показатели системы глутатиона до и после лечения АЛК, а также проводилось сопоставление с данными больных, которым проводилась стандартная терапия.
Наиболее значимые изменения в системе глутатиона после лечения АЛК зафиксированы в активности ГПО и ГТ, причем их глубина зависела от степени тяжести ИИ. При более тяжело протекающем процессе (ИИ-III) их интенсивность была выше (табл.5).
У больных ИИ-II после лечения АЛК снизилась активность ГТ в эритроцитах (р<0,05) по сравнению с ее активностью до лечения у этих же больных. При сравнении результатов в группе пациентов, получавших стандартное лечение с группой больных, у которых применялась АЛК, установлено, что у последних также значимо (р<0,05) снизилась активность ГТ в эритроцитах после лечения.
В группе лиц с ИИ-III, получавших АЛК, после лечения отмечалось снижение активности ГПО в плазме (р<0,05) и в эритроцитах крови (р<0,01). Оценивался и эффект от лечения АЛК по отношению к действию стандартной терапии. Уровень функционирования ГПО в плазме у больных ИИ-III значимо (р<0,05) снизился после лечения АЛК относительно показателей больных, получавших стандартную коррекцию, уменьшилось и накопление GSH в плазме (р<0,01) по отношению к исходным показателям у этих больных.
Данные изменения в системе глутатиона подтвердились и клиническими наблюдениями. В группах ИИ-II и ИИ-III проводилась оценка состояния больных по шкале NIHSS до и после лечения, сравнивался эффект от стандартного лечения и лечения АЛК.
У пациентов с ИИ-II, с назначением АЛК, степень неврологического дефицита снизилась с 9,2 до 3,5 (на 5,7) баллов по шкале NIHSS, на 61,9% (р<0,001), в группе больных, получавших стандартное лечение, с 8,6 до 4,9балла (на 3,7 единиц) по шкале NIHSS, на 43,0% (р<0,01).
При наличии ИИ-III сохранялась та же тенденция. После лечения АЛК произошло снижение с 14,9 до 8,1 (на 6,8) балла по шкале NIHSS, на 44,9%, (р<0,001).
Таблица 6. Показатели системы глутатиона в плазме и эритроцитах крови больных ишемическим инсультом тяжелой степени в зависимости от исхода заболевания
Группы GSH ГПО ГТ ГР
Контроль эр 2,27±0,20 27,4±3,52 4,44±0,44 2,76±0,30 пл 21,7±3,2 2,64±0,33 1,02±0,11 0,38±0,03
Примечание: концентрация глутатиона в эритроцитах выражается в ммоль/л; концентрация глутатиона в плазме - мкмоль/л; активность ферментов - в нмоль/мин на 1мг белка; * - р < 0,05, ** - р < 0,01, *** - р < 0,001; ^ - увеличение показателя; эр - эритроциты, пл - плазма
Стандартная коррекция сопровождалась аналогичной, но менее выраженной реакцией: уменьшение с 16,2 до 11,6 баллов (на 4,6 единиц), на 28,4%, (р<0,05).
Таким образом, фармакологическая коррекция с использованием антиоксидантного компонента в нашем исследовании показала, что лечение дает положительную динамику. После назначения АЛК мы наблюдали нормализацию показателей системы глутатиона, которая коррелировала с клиническими данными.
Тенденция к снижению концентрации GSH и активности его ферментов, достоверное снижение активности ГПО у больных тяжелой формой ИИ, в последствии умерших, в то время как у этих больных должны быть выражены процессы СРО, скорее всего, говорит об истощении АОС (табл. 6). Видимо, тип реагирования системы глутатиона существенно влияет на исход ишемического инсульта. Отсутствие глутатионпероксидазной активации определяет прогноз болезни и ответ на фармакологическую коррекцию. Пониженный уровень функционирования ГПО у больных ИИ тяжелой степени при поступлении, является неблагоприятным прогностическим признаком исхода заболевания.
В литературе данных по ГТ при инсульте мы не обнаружили, но она также является важным антиоксидантным ферментом, который обезвреживает многие окисленные метаболиты путем как их восстановления, так и конъюгации и, кроме того, восстанавливает окисленные нуклеотиды в ДНК - это четвертая линия защиты о пероксидации. Активация вспомогательного фермента ГР наблюдались намного реже, чем ГПО и ГТ, так как его активность как в клетках, так и в плазме намного меньше. Обращает внимание, что высокая активность в плазме и эритроцитах ферментов метаболизма глутатиона - ГПО и ГТ не приводит к снижению его концентрации, а иногда GSH даже накапливается. Очевидно, это объясняется не столько восстановлением глутатиона, сколько увеличенным синтезом GSH в клетках, включая эритроциты; а для плазмы более легким, по сравнению с белками, выходом в кровоток глутатиона из поврежденных клеток.
Наиболее частое изменение в системе глутатиона, выявленное в нашем исследовании - увеличение активности основных антиоксидантных ферментов ГПО и ГТ - защищает от активных форм О2 и продуктов пероксидации, позволяет в определенной степени восстановить равновесие и улучшить редокс-регуляцию. В пользу этого свидетельствуют наши
Вы можете ЗАГРУЗИТЬ и ПОВЫСИТЬ уникальность своей работы
