Клітинна селекція пшениці на стійкість до fusarium graminearum schwabe - Автореферат

В останні десятиріччя фузаріоз колоса вважають найбільш небезпечною хворобою стратегічно важливої культури - пшениці та інших зернових у світовому масштабі (Windels, 2000), яка спричиняє значні матеріальні втрати. Ураження патогеном викликає зниження до 50 % урожайності (Кислих, Райчук, 1999) та якості зерна пшениці і накопичення мікотоксинів (Ампилогова и др., 1996), отруйність та канцерогенність яких зумовлює непридатність зерна для продовольчих і фуражних потреб (Монастырский, 1998). Метою дослідження було виявити особливості генетичної та фізіологічної дії токсичних метаболітів Fusarium graminearum у калюсній культурі пшениці та розробити технологію індукції, оцінки та добору in vitro селекційного матеріалу, стійкого до фузаріозу колоса, на основі розширення генетичної мінливості. Дослідити в модельних та польових умовах стійкість до патогенів відібраних in vitro ліній, виявити відповідність між стійкістю in vitro та in vivo. Виявлено відповідність рівня регенерації в калюсній культурі пшениці при дії селективного фактора і стійкості до патогена в польових умовах, на цій основі розроблено та удосконалено критерії оцінки і добору стійких клітинних ліній.У результаті виконання поставлених завдань встановлено особливості калюсогенезу, регенерації та отримання стійких до фузаріозу клітинних ліній пшениці в модельованих умовах біотичного стресу. Культуральний фільтрат F. graminearum проявляв фізіологічну активність на різних рівнях організації рослинного організму: субклітинному (зростання проникності мембран, активності пероксидази та інгібіторів протеолізу, інгібування процесів фотосинтезу), клітинному (зміна площі та вмісту ДНК в ядрах мікрогаметофітів і зниження життєздатності клітин у суспензійній культурі), in situ в культурі відсіченого колосся (зменшення фертильності пилку і завязуваності зерен), in planta (пригнічення росту проростків). На частоту калюсогенезу і регенерації впливають генотип, стан експланта, середовище культивування, концентрація 2,4-Д, час субкультивування. В селективних умовах регенераційна здатність залежить від генотипу і знижується відповідно до стійкості сорту при збільшенні концентрації КФ у середовищі та експозиції. На частоту сомаклональної мінливості впливають генотип, стан експланта і умови культивування, за оптимальних умов вона була мінімальною і збільшувалась при зростанні вмісту регуляторів росту і тривалості періоду субкультивування.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У результаті виконання поставлених завдань встановлено особливості калюсогенезу, регенерації та отримання стійких до фузаріозу клітинних ліній пшениці в модельованих умовах біотичного стресу. На цій основі запропоновано елементи технології клітинної селекції пшениці на стійкість до грибних патогенів.

1. Культуральний фільтрат F. graminearum проявляв фізіологічну активність на різних рівнях організації рослинного організму: субклітинному (зростання проникності мембран, активності пероксидази та інгібіторів протеолізу, інгібування процесів фотосинтезу), клітинному (зміна площі та вмісту ДНК в ядрах мікрогаметофітів і зниження життєздатності клітин у суспензійній культурі), in situ в культурі відсіченого колосся (зменшення фертильності пилку і завязуваності зерен), in planta (пригнічення росту проростків).

2. На частоту калюсогенезу і регенерації впливають генотип, стан експланта, середовище культивування, концентрація 2,4-Д, час субкультивування. В селективних умовах регенераційна здатність залежить від генотипу і знижується відповідно до стійкості сорту при збільшенні концентрації КФ у середовищі та експозиції.

3. Ознаки регенераційної здатності контролюються адитивно-домінантною системою з переважанням ефектів домінування, направлених на збільшення регенерації, і адитивними ефектами, направленими на її зменшення. Ознаки „частота появи ембріогенного калюса” і „кількість стебел на регенеруючий калюс” контролюються різними генетичними системами. В селективному середовищі генотипи з відємними адитивними ефектами з клітинної популяції елімінуються.

4. При дії КФ на етапі проліферації калюсів по LD95 можна було достовірно диференціювати генотипи відповідно до їх польової стійкості. Оптимальними умовами для селекції на етапі проліферації були середня сублетальна концентрація КФ 25-27 % і тривалість періоду субкультивування з КФ 4 тижні.

5. Збільшення в присутності КФ кількості хромосомних аберацій, пошкодженості аберантної клітини, зміна співвідношення фрагменти/мости та індукція СХО з високою частотою свідчать про генотоксичну дію КФ у калюсній культурі. Процеси репарації СХО у стійких генотипів мають більшу інтенсивність.

6. На частоту сомаклональної мінливості впливають генотип, стан експланта і умови культивування, за оптимальних умов вона була мінімальною і збільшувалась при зростанні вмісту регуляторів росту і тривалості періоду субкультивування. Дія мутагенів та КФ in vitro підвищувала частоту змін і розширювала спектр мінливості. Поєднання комбінаційної, мутаційної і сомаклональної мінливості розширює її спектр за якісними та кількісними ознаками і змінює характер домінування.

7. Частка стійких варіантів при селекції in vitro на рівні проліферуючого калюса становила порядку 10-4, тоді як на рівні регенеруючого калюса - до 10-3. Добір на клітинному рівні з генетично гетерогенного матеріалу ефективніший, ніж з сортового. Зміна величин генетичних ефектів свідчить про елімінацію нестійких генотипів.

8. Зменшення накопичення токсинів F. graminearum у зерні ураженого колосся нащадків відібраних in vitro ліній свідчить про можливість появи генетично зумовленої стійкості, повязаної з механізмами детоксикації.

9. У лінії LF 48-08 підвищена стійкість до розвитку хвороби контролюється адитивно-домінантною генетичною системою. Лінія відрізнялася принаймні одним локусом від вихідному сорту і характеризувалась меншим накопичення ДОН та резистентністю до інфікування насіння. У ліній LF 04-11 та LF 18-12 зросли компоненти стійкості, повязані з уникненням первинного проникнення патогена, інгібуванням гіфального росту і синтезу тріхотеценів або здатністю до деградації ЗЕА. Порівняння характеру успадкування ознак свідчить про їх різний генетичний контроль у вихідних сортів Са 8055 та 80117.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Як спосіб первинного скринінгу стійких чи толерантних до фузаріозу колоса генотипів пшениці можна рекомендувати культуру відсіченого колосся на середовищах з культуральними фільтратами та аналіз фертильності зрілого пилку після обробки КФ.

2. Прижиттєве фарбування пероксидази в калюсних культурах при дії культуральних фільтратів та визначення активності протеолізу можна рекомендувати як критерій оцінки стійкості генотипів пшениці до грибних патогенів in vitro.

3. Для отримання калюсних культур з високою регенераційною здатністю оптимальним є розмір зародка від 1 до 1,5 мм і концентрація 2,4-Д 2мг/л, при більших розмірах зародків потрібно збільшувати концентрацію 2,4-Д до 3-4 мг/л. Для збереження морфогенного потенціалу калюсних культур потрібне поступове зниження концентрації 2,4-Д в середовищі на 0,5 мг/л при кожному наступному пасажі.

4. Для добору на етапі проліферації концентрації культуральних фільтратів повинні складати 20 - 45 %, тривалість періоду субкультивування - 4,1-6,5 тижнів, залежно від стійкості генотипу і його культурабельності. Більш ефективною є клітинна селекція на етапі закладки ембріоїдподібних структур. Щоб підвищити рівень регенерації, доцільно використовувати гібридні популяції між стійким генотипом та генотипом з високою регенераційною здатністю.

5. Отримані в результаті клітинної селекції лінії LF 48-08 та LF 04-11 можна рекомендувати як джерела більшої стійкості за компонентами індексу розвитку хвороби та накопичення зеараленону, лінії LF 48-08 та LF 18-12 - як джерела більшої стійкості за часткою уражених зерен та накопиченням дезоксиніваленолу.

1. Волощук С.І., Руденко Т.П., Гірко В.С. Мінливість морфоцитохімічних параметрів ядер пилку пшениці під впливом культуральних фільтратів деяких грибкових патогенів // Цитология и генетика. - 1994. - Т. 28, № 4. - С. 7-13. (Проведення експериментів, узагальнення результатів.)

2. Волощук С.І., Волощук Г.Д., Гірко В.С. Створення вихідного матеріалу озимої пшениці, стійкого до грибних патогенів, методами клітинної селекції // Захист рослин. - 1998. - № 8. - С. 4-5.

(Узагальнення результатів експериментальних досліджень, написання статті.)

3. Гирко В.С., Волощук С.И. Действие химических и физических мутагенных факторов в культуре ткани озимой пшеницы // Физиология и биохимия культ. растений. - 1999. - Т. 31, № 3.- С. 220-226.

4. Волощук С.И., Волощук А.Д., Гирко В.С. Скрининг in vitro генотипов пшеницы на устойчивость к культуральным фильтратам патогенных грибов // Там же. - Т. 31, № 6. - С. 441-449. (Планування та проведення досліджень, узагальнення результатів.)

5. Волощук С.И., Гирко В.С. Наследование индуцированной в культуре in vitro устойчивости пшеницы к грибным патогенам // Цитология и генетика. - 1999. - Т. 33, № 4. - С. 25-32.

6. Гирко В.С., Волощук С.И. Генетическая активность химических и физических мутагенных факторов в культуре незрелых зародышей пшеницы // Там же. - С. 33-42.

7. Гірко В.С., Волощук С.І. Прояв індукованих in vitro спадкових змін в озимої пшениці // Вісник аграрної науки. - 1999. - № 6. - С. 58-62.

8. Волощук С.І., Волощук Г.Д., Гірко В.С. Використання клітинних технологій in vitro в селекції озимої пшениці на стійкість до грибних патогенів // Генетика і селекція в Україні на межі тисячоліть: у 4-х т. - К.: Логос, 2001. - Т. 1. - С. 625-634. (Узагальнення результатів експериментальних досліджень, насписання статті.)

9. Волощук С.І., Волощук Г.Д., Гірко В.С. Добір in vitro на стійкість до некротрофних грибних патогенів з гібридних популяцій пшениці // Там же. - С. 610-615. (Планування та проведення експериментів, написання статті.)

10. Коломієць Л.В., Волощук С.І., Волощук Г.Д., Гірко В.С. Можливість гаметофітного добору на стійкість пшениці до Fusarium graminearum Schwabe // Там же. - Т. 2. - С. 297-305.

11. Волощук А.Д., Волощук С.И. Клеточная селекция сельскохозяйственных растений - достижения и перспективы // Технология возделывания зерновых колосовых культур и проблемы их селекции: Сб. науч. тр. / МНИИССП. - 1990. - С. 46-65.

12. Гирко В.С., Волощук С.И., Залисский А.А., Руденко Т.П. Оценка устойчивости пшеницы к действию культуральных фильтратов некоторых грибных патогенов в культуре незрелых зародышей // С.-х. биология. - 1993. - № 1. - С. 62-70.

13. Волощук С.І., Солодовніченко В.Д., Волощук Г.Д., Гірко В.С. Вплив умов культивування на частоту регенерації та сомаклональної мінливості пшениці в культурі незрілих зародків // Наукові розробки і реалізація потенціалу сільськогосподарських культур: Зб. наук. праць УААН. - 1999. - С. 50-58.

14. Волощук А.Д., Волощук С.И., Гирко В.С. Оценка устойчивости пшеницы к Fusarium graminearum по параметрам роста суспензионной культуры в присутствии культурального фильтрата // Доклады Россельхозакадемии. - 2001. - № 2. - С. 9-10.

15. Волощук С.И., Гирко В.С. Наследование в ряду поколений некоторых признаков в расщепляющихся гибридных популяциях озимой пшеницы при мутаганезе in vitro // Там же. - 2002. - № 4. - С. 9-13.

16. Волощук С.И., Волощук А.Д., Гирко В.С. Морфолого-биохимические характеристики каллусов пшеницы при культивировании с патогенными грибами // Там же. - 2005. - № 3. - С. 35-38.

17. Волощук С.И., Волощук А.Д., Гирко В.С. Эффективность селекции in vitro на устойчивость пшеницы к патогенам // Агробиотехнологии растений и животных: Тез. докл. Междунар. конф., Киев, 29-30 мая, 1997. - К., 1997. - С. 87.

18. Волощук С.І., Волощук Г.Д., Гірко В.С. Стійкість до грибних патогенів генотипів пшениці, одержаних за допомогою клітинної селекції з використанням культуральних фільтратів // Використання сучасних молекулярно-генетичних і біотехнологічних розробок в генетично-селекційних дослідженнях: Зб. мат. ІІ Міжнар. конф., Одеса, 1998. - К.: Аграрна наука, 1998. - С. 23-24.

19. Girko V.S., Voloshchuk S.I., Voloshchuk A.D. Efficiency of cell-line selection of wheat for resistance to fungi pathogens // IX Intern. Congr. on Plant Tissue and Cell Cult., Jerusalem, Israel, June 14-19, 1998. - Abstr. - Jerusalem, 1998. - P. 144.

20. Voloshchuk S.I., Voloshchuk A.D., Girko V.S. The scheme of in vitro selection of winter wheat genotypes for resistance to some fungal pathogenes // Abstr. II Intern. Symp. on Plant Biotechnol., 4-8 October, 1998, Kyiv, Ukraine.- Kyiv, 1998. - P. 144.

21. Волощук С.І., Гірко В.С. Деякі компоненти стійкості ліній пшениці, відібраних в культурі тканин із застосуванням культуральних фільтратів грибних патогенів // Наукові основи стабілізації виробництва продукції рослинництва: Тези доп. Міжнар. конф. до 90-річчя ІР ім. В.Я. Юрєва УААН. - Харків, 1999. - С. 240.

22. Волощук С.І., Волощук Г.Д., Гірко В.С. Індукована дією культуральних фільтратів патогенів in vitro цитологічна нестабільність як причина довготривалої сомаклональної мінливості у пшениці // Вчимося господарювати: Матер. наук.-практ. семінару мол. вчених і спец. (Ч. ІІ). 22-23 листопада 1999 р. - Київ - Чабани.- К.: Нора-Прінт, 1999. - С. 32-33.

23. Волощук С.І. Клітинна селекція пшениці на стійкість до некротрофних грибних патогенів // Там само. - С. 34-35.

24. Chaban V., Kislykh T., Voloshchuk S. Control of Fusarium scab on winter wheat // Proc. Intern. Symp. “Wheat Improvement for Scab Resistance” (5-11 May, 2000, China). - 2000. - P. 279-280.

25. Волощук С.И., Волощук А.Д., Гирко В.С. Генетический анализ морфогенеза в культуре незрелых зародышей пшеницы // Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии: Тез. докл. ІІІ Междунар. конф., Москва, 19 октября, 2004 г. - М., 2004. - С. 40-42.

26. Волощук С.И., Гирко В.С. Генетический анализ некоторых компонентов устойчивости к септориозу листьев и фузариозу колоса у отселектированных в культуре тканей линий пшеницы // Там же. - С. 43-45.

27. Волощук С.І., Кислих Т.М., Волощук Г.Д., Гірко В.С. Токсичність грибів роду Fusarium Link на озимому тритикале // Наукове забезпечення виробництва зерна тритикале і продуктів його переробки: Тези доп. Міжнар. наук.-практ. конф., Харків, 6-8 липня 2005 р. - Харків, 2005. - С. 5-7.