Клініко-експериментальне обґрунтування діагностики пастерельозу великої рогатої худоби і свиней - Автореферат

Однією з головних проблем промислового тваринництва є респіраторні хвороби молодняку великої рогатої худоби (ВРХ) та свиней інфекційної етіології, які характеризуються гострим або хронічним перебігом, розвитком катарального запального процесу в дихальних шляхах, різким зниженням продуктивності та значною смертністю. Пастерельозна інфекція часто перебігає в асоціації з інфекційним ринотрахеїтом ВРХ, класичною чумою свиней, цирковірусною інфекцією другого типу (PRDC 2), репродуктивно-респіраторним синдромом свиней (PRRS), мікоплазмозами ВРХ і свиней, бордетельозом. Частота виділення пастерел від тварин, які мають клінічні ознаки пневмоній, досягає 75-87 % (Thomson R., 1975; Verma N. D., Saxena C. S., 1987; Pijoan C., Fuentes M., 1987; Абрамов А., Пороло Л., 1996; Міланко О. Я., 1999; Заболотна В. П., 2002). Лабораторна діагностика інфекційних захворювань сільськогосподарських тварин і людини поповнюється сучасними методами, такими як імуноферментний аналіз (ІФА) та полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) (Eamens G. J. et al., 1988), проте ці методи ще не набули широкого застосування в Україні. Визначення місця ПЛР у системі діагностики пастерельозу; розробити ефективну схему оздоровчих заходів при пастерельозі ВРХ і свиней та впровадити її у ветеринарну практику.Епізоотологічні дослідження, клінічні та паталогоанатомічні зміни у ВРХ і свиней, хворих на пастерельоз, у господарствах України проводили за загальноприйнятими методами (Жаров А. В., Налетов Н. А., 1982; Колосов А. А., 1986). Для діагностики пастерельозу в ПЛР нами були проведені дослідження із розробленими парами праймерів: для P. multocida серовару А CAPA-FWD CAPA-REV; для серовару В САРВ-FWD CAPD-REV; для серовару D CAPD-FWD CAPD-REV, також спільну пару праймерів, що кодує рід P. multocida КМТ-1. Бактеріологічні дослідження проводили згідно з „Настановою з лабораторної діагностики пастерельозів тварин та птахів” (Павленко М. С., Манченко В. М., Ображей А. Ф., Завірюха А. І., 1995) і включали в себе мікроскопію мазків та мазків-відбитків із патологічного матеріалу, культуральні (пасажування виділених культур на поживних середовищах (4-5 разів)) та вивчення біохімічних властивостей, трипанофлавінова проба, біопроби та серотипізації на білих мишах (за Картером). Тому мета наших подальших досліджень була спрямована на виявлення P. multocida у господарствах, де реєструються інфекційний ринотрахеїт ВРХ, інфекційний атрофічний риніт свиней та інші респіраторні захворювання цих тварин. У КСГАП „Новогригорівка” пастерелу виділяли з мигдаликів у 38,0 % випадків, із слизу носової порожнини-37,0 % випадків; у ТОВ “Союз” пастерелу виділено з мигдаликів і слизу носової порожнини у 35,0 % випадків; у СВК “Рута” відповідно у 27,0 % і 28,0 % випадків.У дисертації наведене теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, що виявляється в ефективності застосування ПЛР для діагностики пастерельозу великої рогатої худоби та свиней. Експериментально доведено ефективність застосування ПЛР з метою виявлення пастерел у патологічному матеріалі від загиблих і вимушено забитих тварин. Так, за допомогою ПЛР генетичний матеріал P. multocida виявляється від ВРХ (n = 50) у 49 випадках (98,6 %), від свиней (n = 50) - у 49 (99,4 %), тоді як за допомогою бактеріологічного методу - у 41 (82,0 %) та у 44 (89,4 %) відповідно. Ефективність застосування ПЛР при виявлені P. multocida із проб клінічного матеріалу від відлучених поросят з ознаками респіраторних захворювань становить 100,0 %, в той час як бактеріологічні дослідження були позитивними у 80,0 % випадків (р ? 0,1). Отримані дані дають підстави рекомендувати слиз носової порожнини тварин, як обєкт прижиттєвої діагностики пастерельозу .

Основний зміст роботи

У дисертації наведене теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, що виявляється в ефективності застосування ПЛР для діагностики пастерельозу великої рогатої худоби та свиней. Експериментально обґрунтована домінуюча роль P. multocida в асоціаціях інфекційних агентів, які викликають респіраторні захворювання сільськогосподарських тварин і визначено їх сероварний склад. Вдосконалено методику прижиттєвої діагностики пастерельозу. Запропоновано неспецифічні і специфічні засоби профілактики хвороби.

1. Експериментально доведено ефективність застосування ПЛР з метою виявлення пастерел у патологічному матеріалі від загиблих і вимушено забитих тварин. Так, за допомогою ПЛР генетичний матеріал P. multocida виявляється від ВРХ (n = 50) у 49 випадках (98,6 %), від свиней (n = 50) - у 49 (99,4 %), тоді як за допомогою бактеріологічного методу - у 41 (82,0 %) та у 44 (89,4 %) відповідно. Доведено досконалість внутрішньовидової диференціації P. multocida за допомогою ПЛР. При дослідженні патологічного матеріалу сероварний склад був такий: серовар А - 61,3 %, серовар D - 38,7 %.

2. Ефективність ПЛР при індикації пастерел у пробах крові та слизу носової порожнини від хворих на бронхопневмонію телят становить 100,0 %, тоді як бактеріологічного методу - 87,5 % (р ? 0,1). Ефективність застосування ПЛР при виявлені P. multocida із проб клінічного матеріалу від відлучених поросят з ознаками респіраторних захворювань становить 100,0 %, в той час як бактеріологічні дослідження були позитивними у 80,0 % випадків (р ? 0,1). Отримані дані дають підстави рекомендувати слиз носової порожнини тварин, як обєкт прижиттєвої діагностики пастерельозу .

3. Основним бактеріальним агентом, який виявлявся при респіраторних захворюваннях у сільськогосподарських тварин, є P. multocida. Диференціація сероварів пастерел за допомогою праймерів ПЛР досить швидка (протягом 5 год.) та ефективна, тоді як серотипування на білих мишах тривале (до 5 діб) і трудомістке. При бронхопневмоніях телят переважають P. multocida серовари А (40,0 %) і D (60,0 %); у свиней - А (55,0 %) та D (45,0 %) відповідно. P. multocida серовар В у дослідних зразках не виявлений.

4. Встановлено, що ІРТ ВРХ супроводжується бактеріальними асоціаціями такого складу: P. multocida (40,0 %), при внутрішньовидовій серотипізації значна частка належить серовару D (65,0 %); B. bronchiseptica (25,0 %); S. typhimurium (15,0 %); M. bovis (10,0 %); S. pyogenes (10,0 %). Від свиней з ознаками ІАР виділяється бактеріальна асоціація: P. multocida (57,0 %); B. bronchiseptica (35,0 %). При дослідженні 31 проби крові свиней ПЛР у 83,87 % випадків виділено ДНК пастерел серовару А та у 90,32 % - серовару D.

5. Встановлено, що пастерелам притаманна антилізоцимна активність, що свідчить про потенційну можливість персистенції мікроорганізму. Найвищий рівень антилізоцимної активності (АЛА) P. multocida має серовар А - 6 мкг/см3 референтного і 5 мкг/см3 епізоотичного штаму. АЛА P. mul-tocida серовару D становить 6 мкг/см3 як референтного, так і епізоотичного штаму, серовару В - 3 мкг/см3.

6. При виявленні тварин-пастеролоносіїв доцільно використовувати ПЛР, оскільки за допомогою цього методу було виявлено 100,0 % прихованих тварин-носіїв, у той час як за допомогою серологічних реакцій виявлено менше 50 % випадків. Пастерелоносійство у 45,5 % випадків зумовлюють P. multocida сероварів А та D, які виявляються у клінічно здорових тварин.

7. Застосування ПЛР дозволяє виявити на 27,0 % більше контамінованих предметів довкілля (відвійок, ґрунту, гною, продуктів боєнських відходів, стічних вод боєнь), ніж бактеріологічними дослідженнями, що дає підстави використовувати ПЛР з метою виявлення можливих факторів передачі збудника.

8. Експериментально доведена можливість контролю впроваджених лікувально-оздоровчих заходів при пастерельозі ВРХ і свиней за допомогою ПЛР. З цією метою індикацію збудника в біологічному матеріалі контрольованих тварин проводять через 60 днів після впроваджених лікувально-оздоровчих заходів.

Пропозиції виробництву

На підставі проведених досліджень у виробничих і лабораторних умовах для практичного застосування пропонуються: - методичні рекомендації “Лабораторна діагностика пневмоній свиней” (затверджені науково-методичною радою Державного департаменту ветеринарної медицини МІНАПК України від 17.12.1999 р., протокол № 2);

- “Рекомендації з профілактики та оздоровлення свинарських господ-дарств від пастерельозу” (затверджені науково-методичною радою Державного департаменту ветеринарної медицини України від 17 грудня 1999 р., протокол № 17) для лікарів-фахівців і викладачів;

- “Інструкція щодо контролю пастерельозу тварин” (затверджена науково-методичною радою Державного департаменту ветеринарної медицини МІНАПК України від 22-23 грудня 2004 р., протокол № 4);

- “Настанова з лабораторної діагностики пастерельозу тварин і птиці” (затверджена науково-методичною радою Державного департаменту ветеринарної медицини МІНАПК України від 20.12.2006 р., протокол № 3);

- “Спосіб отримання сироватки крові великої рогатої худоби для культивування пастерел” (деклараційний патент на корисну модель затверджений 3.10.2006 р., № 24780/1);

- “Спосіб визначення антилізоцимної активності бактерій P. multocida із використанням лізобакту (лізоциму хлориду)” (заявка на деклараційний патент корисної моделі, від 14. 10. 2008 р., № u 2008 09429 Вх. №14518/1).

1. Вплив факторів зовнішнього середовища на виживання збудника пастерельозу / Т. І. Тарасюк, Л. К. Волинець, В. І. Москалюк, В. М. Яненко, У. М. Яненко // Вісник Сумського державного аграрного ун-ту.- 1999. - Вип.4. - С. 181-183. (Здобувач брала участь в експериментальних дослідженнях, аналіз одержаних результатів).

2. Характеристика властивостей епізоотичних штамів пастерел, виділених від свиней / Л.К. Волинець, Т.В. Мазур, Т.І. Тарасюк, У.М. Яненко // Аграрний вісник Причорноморя. -1999. - Вип. 2 (7). - С. 45-47. (Здобувач брала участь у виділенні штамів пастерел і визначенні ступеня їх патогенності для білих мишей).

3. Яненко У.М. Виявлення свиней-пастерелоносіїв за допомогою РНГА / У. М. Яненко // Науковий вісник Національного аграрного ун-ту. - 2000. - Вип. 28. - С. 228-230.

4. Прокопюк О.Г. Пастерельозна пневмонія свиней / О.Г. Прокопюк, У.М. Яненко, Т.В. Мазур // Вісник Білоцерківського державного аграрного ун-ту.- Біла Церква, 2000. - Вип. 11.- С. 97-100. (Здобувач провела роботу з гіперімунізації кролів для отримання типоспецифічних сироваток і виготовлення капсульних антигенів для постановки РНГА).

5. Ефективність щеплення свиней вакциною „Пасако” / Л. К. Волинець, Т. В. Мазур, Т. І. Тарасюк, О. І. Москаленко, Л. В. Зоценко, У. М. Яненко та ін. // Науковий вісник Національного аграрного ун-ту.- 2001. - Вип. 36. - С. 111-114. (Здобувач брала участь у визначенні антигенної активності вакцинних штамів пастерел).

6. Виробниче застосування „Набору типоспецифічних сироваток для серологічного ідентифікування штамів P. multocida”/ В. І. Москалюк, Т. В. Мазур, Л. К. Волинець У. М. Яненко // Ветеринарна біотехнологія. - Київ : Аграрна наука, 2004. - Бюл. № 4. - С. 135-138. (Здобувач брала участь в експериментальних дослідженнях, аналізі одержаних результатів, підготовці матеріалів до публікації).

7. Яненко У. М. Імунобіологічні показники відповіді організму поросят, імунізованих вакциною „Пасако” // Ветеринарна біотехнологія.- Київ : Аграрна наука, 2004. - Бюл. № 5. - С. 179-183.

8. Яненко У., Ефективність гідрокисалюмінієвої вакцини „Пасако” проти пастерельозу, сальмонельозу та колібактеріозу свиней / У. Яненко, Л. Волинець, Т. Мазур // Ветеринарна медицина України. - 2005. - № 7. - С. 41-42. (Здобувач брала участь в експериментальних дослідженнях, аналізі одержаних результатів, підготовці матеріалів до публікації).

9. Яненко У. М. Епізоотична ситуація по пастерельозу свиней у господарствах України за 2001-2004 рр. та етіологічна структура захворювання // Ветеринарна біотехнологія.- Київ : Аграрна наука, 2005. - Бюл. № 6. - С. 229-237.

10. Волинець Л. К. Вакцина проти пастерельозу, сальмонельозу та колібактеріозу свиней „Пасако” при респіраторних захворюваннях свиней, які ускладнюються інфекційним атрофічним ринітом/ Л. К. Волинець, У. М. Яненко, В. І. Москалюк // Науковий вісник Львівської Національної академії вет. мед. ім. С. З. Гжицького, Львів, 2006. - Т. 8, № 2 (29). - С. 23-27. (Здобувач провела дослідження з вивчення етіології збудників атрофічного інфекційного риніту свиней).

11. Сравнительная оценка эффективности вакцин против пастереллеза свиней / Л. К. Волынец, Т. В. Мазур, О. Г Прокопьюк, У. М. Яненко // Материалы Междунар. науч.-практ. конф.: Проблемы патологии, санитарии и бесплодия в животноводстве. - Минск, 1998. - С.82-83.

12. Методичні рекомендації “Лабораторна діагностика пневмоній свиней” / О. Я. Міланко, О. Г. Міланко, Н. О. Авраменко, Л. К. Волинець, Т. І. Тарасюк , В. М. Яненко, У. М. Яненко - Суми: Вид-во СДАУ. - 1999. - 23 с. (Здобувач брала участь у вивченні етіології респіраторних хвороб свиней, визначенні домінанти пастерел при респіраторних асоціаціях).

13. Рекомендації з профілактики та оздоровлення свинарських господарств від пастерельозу / О. Я.Міланко, О. Г. Міланко, Н. О. Авраменко, Л. К. Волинець, Т. В. Мазур, О Г. Прокопюк, Т. І. Тарасюк, В. М. Яненко, У. М. Яненко - Суми: Вид-во СДАУ. - 2000. - 10 с.(Здобувач провела дослідження по виявленню збудника пастерельозу в продуктах тваринного походження, стічних водах та в ґрунті).

14. Інструкція щодо контролю пастерельозу тварин / В. О. Ушкалов, Б. Т.Стегній, Т. Ю. Трускова, А. Ф. Бабкін, Є. П. Петренчук, О. В. Обухівська, І. І. Головащук, П. П. Цімох, В. І. Сікачина, В. М. Плис, А. М. Головко, В. Г.Скрипник, А. В. Абрамов, Л. К. Волинець, Т. В. Мазур, У. М. Яненко, О. І. Сосницький , В. П. Заболотна. - Київ, 2004. - 25 с. (Здобувач брала участь в дослідженні культурально-морфологічних властивостей P. multocida сероварів А, В, D та F).

15. Настанова з лабораторної діагностики пастерельозу тварин та птиці/ О. І. Сосницький, В. П. Заболотна , А. А. Руденко, А. Ф. Руденко, Б. Т. Стегній , А. Ф. Бабкін, В. О. Ушкалов, А. М. Головко, В. Г. Скрипник, Л. М. Да-видовська, П. П. Сімох, В. І. Сікачина, А. В. Абрамов, Г. М. Данисюк, Л. К. Волинець, У. М. Яненко, В. Ю. Кассіч, Г. О. Міланко, Н. О. Авраменко. - Харків, 2007. - 12 с. (Здобувач брала участь в експериментальних дослідженнях, ізоляції та визначенні діагностично-необхідних властивостей культур P. multocida).

16. Пат. А Україна, А 61К39/00. „Спосіб отримання сироватки крові великої рогатої худоби для культивування пастерел” МПК (2006), Яненко У. М., Компанієць К. С., Волинець Л. К; Інститут ветеринарної медицини Української академії ігрірних наук. - № 21236; Заявл. 10.07.06; Опубл. 15.03.07, Бюл. № 3. - 4 с. (Здобувач брала участь в експериментальних дослідженнях, аналізі одержаних результатів, підготовці матеріалів до публікації).

17. Заявка на деклараційний патент корисної моделі “Спосіб визначення антилізоцимної активності бактерій P. multocida з використанням лісобакту (лізоциму хлориду)” / У. М. Яненко від 18.07.2008 р., № u 2008 09429.