Хромосомная организация геномов растений с хромосомами малых размеров или малоинформативным рисунком дифференциального окрашивания - Диссертация

Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени Хромосомная организация геномов растений с хромосомами малых размеров или малоинформативным рисунком дифференциального окрашивания Работа выполнена в Лаборатории молекулярной кариологии и основ клеточной терапии Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, профессор, академик Юрий Викторович Ильин С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им.Метод С-бэндинга, основанный на выявлении участков конститутивного гетерохроматина, на долгие годы занял ведущее место в исследованиях хромосом растений, что связано с чрезвычайной обогащенностью их геномов повторяющимися последовательностями ДНК. Следующий этап в развитии цитогенетики растений, приведший к серьезному расширению ее возможностей, связан с разработкой и началом широкого использования в 80-90-х годах прошлого столетия флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). В результате за прошедшие десятилетия был накоплен огромный багаж знаний, касающихся особенностей хромосомной организации геномов растений, получены важнейшие сведения об их изменчивости, происхождении и эволюции, что послужило базисом для разработки цитогенетических основ селекции. Разработка комплекса методов, повышающих разрешающую способность анализа хромосомной организации геномов растений с хромосомами малых размеров или малоинформативным рисунком С-бэндинга на модельных объектах (человек, ячмень, пшеница) и объектах исследования (ромашка, лен, горох). На модельном объекте - ячмене разработана модификация метода, позволяющая выявлять рисунок ранней репликации хромосом у растений.Подход включает комплекс высокоразрешающих молекулярно-цитогенетических методов исследования, позволяющих получать достаточное число маркеров для распознавания и сравнительного изучения мелких хромосом или хромосом с малоинформативным рисунком С-бэндинга. В каждой гомологичной группе (номера 1-7) хромосомы расположены по типам окрашивания слева направо: - рисунок поздней репликации хромосом (по данным Uozu et al., 1997); При этом на хромосомах ячменя, как и на хромосомах человека [Захаров и др., 1982], рисунок поздней репликации хромосом в целом совпадает с рисунком С-окраски [Uozu et al., 1997], а рисунок ранней репликации хромосом - с рисунком G-подобного дифференциального окрашивания, выявляемого на хромосомах после обработки трипсином (Рис. Большое число сегментов, которые выявил на хромосомах ячменя метод репликативного бэндинга, побудило нас попытаться использовать этот подход для изучения мелких хромосом растений с целью идентификации этих хромосом по рисункам ранней репликации (См. раздел 2.1). Отработку метода задержки конденсации хромосом с помощью 9-АМА проводили на хромосомах человека, поскольку степень их конденсации легко оценивать по числу G-бэндов на гаплоидный набор, и на хромосомах ромашки аптечной (Matricaria chamomilla L.), степень конденсации которых оценивали по числу OR-бэндов.Полученные рисунки ранней репликации хромосом были воспроизводимы и хромосомоспецифичны, что позволило идентифицировать все хромосомы в геноме A1 диплоида G. herbaceum и в геноме (AD)2 аллотетраплоида G. barbadense. В автоспорах всех трех видов Galdieria было обнаружено по две хромосомы длиной 0,8-2,3 мкм, причем одна из хромосом была на треть больше другой (Рис. Больше трудностей представлял подсчет числа хромосом в геноме C. caldarium, поскольку размеры 5 видимых хромосом были от 0,4 до 0,7 мкм (Рис. Это обстоятельство позволяет подобрать степень конденсации хромосом, при которой по рисунку DAPI-бэндинга возможно идентифицировать хромосомы и при необходимости локализовать на них точки хромосомных перестроек или ДНК-зонды. I - С-окраска хромосом и ядра L.flavum; II - Ag-ЯОР-окрашивание профазных хромосом L.flavum (а) и его совмещение с последующим DAPI-окрашиванием (б); III - CMA-окрашивание В-хромосом в профазе (а), ядре (б) и сравнение рисунков окраски CMA и DAPI метафазных В-хромосом; IV - основной морфологический тип В-хромосом у разных видов, представлено инвертированное изображение DAPI-окрашивания и рядом та же хромосома с локализацией 26S РДНК (зеленый сигнал) и 5S РДНК (красный сигнал); V - иногда встречаемые атипичные В-хромосомы (а) и ассоциации В-хромосом (б).В работе представлен комплекс методов, позволяющих осуществлять детальное изучение хромосомной организации геномов растений, включая надежную идентификацию малоинформативных (небольшие размеры и/или бедность рисунков С-окраски) индивидуальных хромосом. Использование метода выявления рисунков ранней репликации хромосом открывает широкие возможности не только для идентификации хромосом, но и для более глубокого исследования последовательности репликации ДНК у растений.