Кінетика транспорту іонів Са у мітохондріях матки щурів та вплив кофеїну на цей процес - Автореферат

Вважають, що виникнення різноманітних патологій репродуктивної функції (спонтанні аборти, гіпо-і гіпертонус матки тощо) повязане з порушенням гомеостазу іонів Са, яким, як відомо, належить фундаментальна роль у забезпеченні контролю скоротливої активності мяза [Burdyga T., Wray S., 2002; Бабіч Л.Г., 1999]. Ідентифікація цих систем, вивчення їхніх властивостей, особливостей регуляції транспортної активності та фізіологічної ролі у кальцієвому гомеостазі має виключно важливе значення для розуміння іонних, молекулярних та мембранних механізмів електро-та фармакомеханічного спряження в гладеньких мязах [Kosterin S. et al, 1999; Kosterin S., 2003]. Не дивлячись на те, що питання про роль МХ у підтримці внутрішньоклітинного гомеостазу іонів Са у гладеньких мязах вже давно привертає увагу дослідників, ряд експериментальних задач потребують подальшого зясування. Приймаючи до уваги провідну роль Са2 у розвитку процесу скорочення, вбачається корисним дослідити вплив даного алкалоїду на мембранозвязані Са2 -транспортуючі системи, що беруть участь у регуляції внутрішньоклітинного гомеостазу іонів Са у гладеньких мязах. Втім, у ряді робіт були наведені переконливі докази, що кофеїн викликає ряд порушень функціонування МХ (пригнічення дихання, руйнування структури внутрішньої мембрани) та безпосередньо впливає на гомеостаз Са2 у клітинах [Bruyere H. et al, 1988; Sardao V. et al, 2002].Результати досліджень, що викладено в дисертації, були заслухані та обговорені на таких наукових конференція та симпозіумах: конференція молодих вчених “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології”, Київ, Інституту біохімії НАНУ (2003); школа-конференція молодих вчених “Биология - наука 21 века”, Пущино, Росія (2003); 2ий Міжнародний симпозіум “Фізіологія та біофізика гладеньких мязів”, Київ, Україна (2003); Конгрес Федерації Європейських Біохімічних Товариств, Варшава, Польща (2004); Парнасівська польсько-українська конференція з біохімії, Київ (2005), конкурс на здобуття стипендій імені видатних вчених, Інституту біохімії НАНУ (2005); загальноінститутські семінари та засідання Вченої Ради Інституту біохімії НАНУ (2001 - 2006). Результати експериментів неодноразово доповідались на наукових семінарах відділу біохімії мязів Інституту біохімії НАНУ (2001 - 2006). За результатами дисертації опубліковано 4 статті у фахових наукових журналах та 5 тез доповідей у матеріалах міжнародних та всеукраїнських наукових конференцій.У даній роботі, виконаній із використанням Са2 -чутливого флуоресцентного зонду тетрацикліну, були досліджені кінетичні закономірності транспорту іонів Са в ізольованих мітохондріях міометрія невагітних щурів, вивчено вплив кофеїну на цей процес. Наші дані свідчать, що протонофор-та азид-чутливі складові збільшення флуоресцентного сигналу тетрацикліну, які є резистентними до тапсигаргіну, характеризують Mg2 ,АТР-залежну оборотну акумуляцію іонів Са в мітохондріях. Величина константи швидкості k акумуляції іонів Са у мітохондріях куполоподібно залежить від концентрації іонів Mg (оптимальне значення - 3 - 5 ММ) та збільшується із зростанням концентрації АТР (до 3 ММ), але практично не залежить від концентрації сукцинату (до 3 ММ) у середовищі інкубації. Кофеїн, внесений у середовище інкубації, дозозалежно гальмує акумуляцію іонів Са (значення константи інгібування І0.5 становить 10,4 ± 1,8 ММ) та Н -АТРАЗНУ активність в мітохондріях, зменшуючи як платовий (у часі) рівень акумуляції катіону, так і величину константи швидкості цього процесу. У випадку попередньої інкубації мітохондрій з кофеїном при відсутності реагентів, що забезпечують транспортний процес (Са2 , Mg2 , АТР) також спостерігається пригнічення акумуляції іонів Са.

На теперішній час доведена важлива роль мітохондрій у контролі внутрішньоклітинної концентрації іонів Са, у тому числі в гладеньких мязах. У даній роботі, виконаній із використанням Са2 -чутливого флуоресцентного зонду тетрацикліну, були досліджені кінетичні закономірності транспорту іонів Са в ізольованих мітохондріях міометрія невагітних щурів, вивчено вплив кофеїну на цей процес.

Наші дані свідчать, що протонофор- та азид-чутливі складові збільшення флуоресцентного сигналу тетрацикліну, які є резистентними до тапсигаргіну, характеризують Mg2 ,АТР-залежну оборотну акумуляцію іонів Са в мітохондріях. Кінетика акумуляції Са2 задовольняє закономірностям реакції першого порядку (константа швидкості k становить (4,8 ± 0,7) x10-2 с-1).

Протонофор СССР, азид та Са2 -іонофор А-23187 стимулювали пасивне вивільнення іонів Са із мітохондрій за умов попереднього енергозалежного накопичення цього катіону в них. Протонофор здатний більш ефективно, ніж азид, індукувати вивільнення Са2 із цих субклітинних структур: значення k становлять (8,6 ± 0,8) x10-2 та (3,8 ± 0,2) x10-2 с-1 відповідно.

Величина константи швидкості k акумуляції іонів Са у мітохондріях куполоподібно залежить від концентрації іонів Mg (оптимальне значення - 3 - 5 ММ) та збільшується із зростанням концентрації АТР (до 3 ММ), але практично не залежить від концентрації сукцинату (до 3 ММ) у середовищі інкубації.

Кофеїн, внесений у середовище інкубації, дозозалежно гальмує акумуляцію іонів Са (значення константи інгібування І0.5 становить 10,4 ± 1,8 ММ) та Н -АТРАЗНУ активність в мітохондріях, зменшуючи як платовий (у часі) рівень акумуляції катіону, так і величину константи швидкості цього процесу. У випадку попередньої інкубації мітохондрій з кофеїном при відсутності реагентів, що забезпечують транспортний процес (Са2 , Mg2 , АТР) також спостерігається пригнічення акумуляції іонів Са. Кофеїн стимулює пасивне вивільнення іонів Са з мітохондрій, які попередньо були навантажені цим катіоном у енергозалежному процесі.

Циклоспорин А (5 МКМ) стимулює на (30 %) акумуляцію іонів Са в мітохондріях, але не впливає на їх пасивний вихід із цих субклітинних структур. На фоні пригнічуючої дії кофеїну (20 ММ) на акумуляцію іонів Са стимулюючий ефект циклоспорину А (5 МКМ) не спостерігається.

Із використанням флуоресцентного зонду 3-гідрокси 4-диметиламінофлавону розроблено метод визначення концентрації АТР у водних розчинах.

ПЕРЕЛІК ПУБЛІКАЦІЙ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Вадзюк О.Б., Борисова Л.А., Тітус О.В., Костерін С.О. Чутлива до СССР зміна флуоресценції тетрацикліну за умов моделювання Mg2 , АТР-залежного транспорту іонів Са в мітохондріях гладенького мяза.// УБЖ.- 2003.- т.75, N4.- С. 64-74.

Вадзюк О.Б., Костерін С.О. Вплив кофеїну на азидчутливе Mg2 , АТР-залежне збільшення флуоресцентної відповіді тетрацикліну при моделюванні акумуляції іонів Са в мітохондріях.// УБЖ.- 2003.- т. 75, N6.- С. 47 - 55.

Вадзюк О.Б. Вплив кофеїну та ЦСА на трансмембранний обмін іонів Са в мітохондріях гладенького мяза.// УБЖ.- 2005.- т.77, N2.- С. 77-82.

Pivovarenko V.P., Vadzyuk O.B., Kosterin S.O. Fluorometric detection of adenosine triphosphate with 3-hydroxy-4’(dimethylamino)flavone in aqueos solutions.// Journal of Fluorescence.- V.16, N 1.- Р.9 - 15.

Патент на винахід N 75448 UA, 7МПК, GO 21/64, GO1N 33/52, C07D 311/30, C07D221/06. Спосіб флуориметричного визначення концентрації аденозин-5’-трифосфату (АТР) у розчині/ Пивоваренко В.Г., Вадзюк О.Б., Костерін С.О. Заявл. 15.03.2004, Опубл. 17.04.2006, Бюл. N 4.

Vadzyuk O.B. CCCP- and azide-sensitive Ca2 accumulation in myocytes and the effect of caffeine on this process// .- International Congress “Physiology and Biophysics of the Smiito Muscle”.- 2003.-Р.377.

Вадзюк О.Б. Влияние кофеина на Mg2 ,АТР-зависимое накопление ионов Са митохондриями миоцитов матки// 7-я Пущинская школа-конференция молодых ученых.- Сборник тезисов.-2003.-Р.313.

Вадзюк О.Б. Вплив кофеїну на СССР- та NAN3-чутливу Mg2 ,АТР-залежну систему акумуляції іонів Са в клітинах міометрію.// Конференція-конкурс робіт молодих вчених “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології”.- Київ.- 2003.-Р.8

Vadzyuk O.B., Kosterin S.O. Mg2 , ATP-dependent Ca2 -transport in the mitochondria of the smooth muscle cells// 29-th Meeting of the European Biochemical Societies.-Poland.- 2004.- P.184.

Vadzyuk O.B. Influence of caffeine and cyclosporin A on the transmembrane exchange of Ca2 in smooth muscle mitochondria// 5-th Parnas Conference “Molecular Mechanisms of Cellular Signaling”. 2005.

Размещено на .ru