Кінетичні властивості зародків в’юна у нормі та за впливу іонізуючого випромінювання - Дипломная работа

4.1.2 Аналіз методів досліджень та характеристика обладнання 4.1.3 Характеристика обєкту дослідження та речовин, їх небезпечні властивостіВони забезпечують вибіркову проникність для речовин, які транспортуються в процесі життєдіяльності клітин [11]. Експерименти з додаванням уабаїну в зародках тритона та вюна дали можливість встановити, що Na /K -АТФАЗА здійснює певний внесок у гіперполяризацію мембрани під час дроблення. Збільшення внутрішньоклітинної концентрації іонів калію є не тільки тригером синтезу ДНК та дроблень, а і певною компонентою мембраноспряжених процесів, які переводять клітину у новий режим функціонування [42]. Розрізняють три основні типи активного транспорту іонів: натрій-калієва помпа - Na /K -аденозинтрифосфатаза (АТФАЗА); кальцієва (Са2 ) помпа - Са2 -АТФАЗА, яка транспортує Са2 із клітини або цитозолю в ендоплазматичний ретикулум; протонна помпа - Н -АТФАЗА [2]. Високе співвідношення концентрації калію у поза-і внутрішньоклітинному середовищі (1:38) підтримується завдяки роботи Na /К -АТФАЗИ, активно переносить іони калію в клітину, а іони натрію - з неї (у співвідношенні 2:3 відповідно) (внаслідок активного виведення натрію з клітин Na /K -АТФАЗИ 85-90% всього натрію, що міститься в організмі, знаходиться в позаклітинній рідині і з цієї причини визначає її обсяг) [23].Первинна структура обох субодиниць, які входять до складу Na /K -АТФАЗИ розшифрована завдяки методам генної інженерії в поєднанні з методами білкової хімії [41]. ?-субодиниця (каталітична, молекулярна маса 90-100 КДА) пронизує ліпідний матрикс мембрани, утворюючи 10 ?-спіральних трансмембранних сегментів протяжністю 4 нм кожен, які складаються приблизно з 20 амінокислотних залишків. Аналіз профілю гідрофобності показує, що поліпептидний ланцюг ?-субодиниці Na /K -АТФАЗИ містить від 6 до 10 трансмембранних фрагментів, які складаються з 17-25 амінокислот, утворюють конформацію ?-спіраль [41]. Інєкція зародкам шпорцевої жаби X. leavis гібридизованої МРНК каталітичної субодиниці призводить до інгібування гаструляції, а при введенні в дорзальні бластомери - до зупинки диференціації головного відділу [44]. ?-субодиниця Na /K -АТФАЗИ (~ 40-60 КДА) забезпечує модуляцію спорідненості ферменту до іонів K та Na . Безпосередньої участі в каталізі і транспорті катіонів ?-субодиниця не бере, однак вона необхідна для нормального функціонування Na /K -АТФАЗИ, вона відіграє певну роль в регуляції звязування K з ферментом, разом з ?-субодиницею бере участь в конформаційних переходах, які індукують звязування Na /K -АТФАЗИ з різними лігандами [15]. Інші докази того, що ?-субодиниця є складовою частиною Na /K -помпи в тому, що ця субодиниця локалізується з ?-субодиницею у нефроні сегментів.Шатцман описав ефект групи сполук, які називаються серцевими глікозидами, що полягає в придушенні АТФ-залежного переносу іонів натрію і калію через мембрану еритроцитів. Автор показав, що в результаті витримування клітин в середовищі з цими сполуками різниця в концентрації відповідних одновалентних катіонів по обидві сторони мембрани зменшується. Вона повинна була, на його думку, задовольняти таким умовам: здійснювати гідроліз АТФ, використовуючи цей процес як джерело енергії для перенесення іонів Na та K проти їх концентраційних градієнтів; активуватися переносяться нею іонами; інгібувати уабаїном. Дійсно, виявилося, що гомогенат нервових клітин гідролізують АТФ і спільне присутність іонів натрію і калію активує цей процес, а уабаїн пригнічує його. Проте варто трохи пошкодити клітинну мембрану або іншим способом активувати вхід в клітку натрію і вихід з неї калію, як відбудеться активація АТФАЗИ та її робота буде відновлювати іонну асиметрію.Обєктом досліджень були зародки прісноводної риби вюна Misgurnus fosslis L., які широко використовуються при дослідженні ряду проблем сучасної біології, у тому числі в ембріологічних, біохімічних, цитологічних, біофізичних та інших дослідженнях [11]. Вюн Misgurnus fossilis L. відноситься до родини вюнових Cobitidae, ряду Карпоподібних Cypriniformes, надряду кісткових риб Teleostei. Яйцеклітини вюна по характеру розподілу в них цитоплазми та жовтка відносяться до типу телолецитальних, а по співвідношенню цих компонентів - до поліплазматичних. Тонкий шар цитоплазми оточує жовток, і, крім того, тонкі її тяжі пронизують жовток, анастомозують між собою та утворюють у середині жовтка тонку сітку. Через 3 години після запліднення зародки представлені 32 бластомерами, але борозни 5 поділу проходять паралельно екватору жовтка, в результаті чого утворюється "шапочка" на анімальному полюсі, тобто бластодиск, клітини якого не відділені від жовтка мембраною.Перед початком експерименту аліквоти суспензії мембранного препарату переносили в стандартне середовище інкубації наступного складу (ммоль/л): NACL - 125,0; KCL - 30,0; MGCL2 - 3,0; CACL2 - 0,01; АТР-Na2 - 3; Трис-HCL - 50,0 (РН 7,4; 21 0С). Питому активність Na /K -АТФАЗИ визначали за умов додавання до цього середовища відповідних інгібіторів: 1 ММ NAN3 (інгі

Зміст

Вступ

1. Огляд літератури

1.1 Динаміка біоелектричних та метаболічних параметрів мембран зародків протягом раннього ембріогенезу тварин

1.2 Na /K -АТФАЗА, як система первинно-активного транспорту іонів Na та K

1.2.1 Молекулярна організація Na /K -АТФАЗИ

1.2.2 Механізм функціонування Na /K -АТФАЗИ

1.2.3 Ізоферменти Na /K -АТФАЗИ

1.2.4 Регуляція активності Na /K -АТФАЗИ

1.2.5 Зміни активності Na /K -АТФАЗИ зародків протягом ембріогенезу

1.2.6 Кінетика ферментативної реакції Na /K -АТФАЗИ

2. Матеріали та методи досліджень

2.1 Особливості отримання ікри і характеристика ембріонального розвитку зародків вюна

2.2 Методика виділення і очищення бластодерм зародків вюна

2.3 Визначення Na /K -АТФАЗНОЇ активності зародків вюна

2.4 Реактиви

3. Результати досліджень та їх обговорення

3.1 Активність Na /K -АТФАЗИ вюна Misgurnus fossilis L. впродовж раннього ембріогенезу при різній тривалості інкубації та за умов дії НІЛВ

3.2 Активність Na /K -АТФАЗИ вюна Misgurnus fossilis L. впродовж раннього ембріогенезу при різних температурних значеннях середовища інкубації та за умов дії НІЛВ

4. Безпека життєдіяльності та охорона праці

4.1 Аналіз стану виробничих умов

Вступ ембріогенез метаболічний зародок вюн

Актуальність теми. Мембрани - це високо впорядковані структури клітини. Плазматична мембрана відокремлює клітину від навколишнього середовища і є барєром з високо вибірковою проникністю [17].

Живі системи на всіх рівнях організації - відкриті системи. Тому транспорт речовин через біомембрани - необхідна умова життя [1]. Плазматичні мембрани містять транспортні системи, що регулюють молекулярний та іонний склад внутрішньоклітинного середовища [17]. Деякі з ферментів каналізують трансмембранні реакції, коли реагенти перебувають по різні сторони мембрани або коли каталітичний акт супроводжується транспортом молекул [9].

Na /K -активована, Mg2 -залежна-АТФАЗА (АТФ-гідролаза, уабаїнчутлива Na /K -АТФАЗА, Na /K -помпа, ЕС 3.6.1.37) - електрогенний Са2 -незалежний, Mg2 , Na , K -залежний транспортувальний білок плазматичної мембрани здійснює енергозалежне і протилежно спрямоване перенесення одновалентних іонів Na і К (співвідношення 3:2), внаслідок чого електрохімічні градієнти підтримуються на рівні функціонування клітини у нормі. Однак, Na /К -АТФАЗА не тільки підтримує співвідношення Na /К у цитоплазмі, а зумовлює збільшення рівня трансмембранного потенціалу (ТМП) й відповідає за осмотичність бластоцелю зародків в ранньому розвитку вюна [8].

Мета роботи полягала у дослідженні характеру змін ферментативного гідролізу Na /K -АТФАЗИ мембран зародків вюна Misgurnus fossilis L. впродовж раннього ембріогенезу при різних температурних значеннях середовища інкубації та за умов дії низькоінтенсивного лазерного випромінювання (НІЛВ).

Для досягнення цієї мети у роботі вирішували такі завдання: 1. Дослідити активність Na /К -АТФАЗИ зародків вюна на ранніх стадіях онтогенезу за нормальних умов;

2. Дослідити активність Na /К -АТФАЗИ зародків вюна in vitro впродовж ембріогенезу за умов впливу НІЛВ;

3. Зясувати кінетичні характеристики Mg2 , Na , K -залежної АТФ-гідролази зародків вюна Misgurnus fossilis L.;

4. Дослідити температурну залежність Na /K -АТФАЗИ зародків вюна за умов впливу НІЛВ впродовж раннього ембріогенезу.

Для досягнення мети роботи використовували біофізичні, біохімічні та статистичні методи досліджень.

Особистий внесок здобувача полягає у виконанні частини експериментальних досліджень, поданих у дипломній роботі, статистичному опрацюванні результатів, підборі та обробці даних літератури, а також, за участю наукового керівника, в плануванні напрямків досліджень, аналізі та інтерпретації одержаних результатів, формулюванні висновків.

Публікації за матеріалами роботи. Матеріали роботи були представлені на ІХ Міжнародній науковій конференції студентів та аспірантів «Молодь і поступ біології» (Львів, 2012-2013). За результатами дипломної роботи 1 тези доповіді у матеріалах міжнародної наукової конференції.