Исследование мутаций leg-arista-wing complex, нарушающих экспрессию фактора транскрипции TRF2 в эмбриогенезе Drosophila melanogaster - Автореферат

Эти трудности часто связаны с отсутствием удобных для исследования мутаций генов, кодирующих подобные факторы. эмбрион мутант транскрипция нервный Исследовать in vivo функции этого гена помогло открытие многочисленных видимых и летальных его мутаций, названных lawc (leg-arista-wing complex), локализованных на достаточном расстоянии от открытой рамки считывания этого гена, однако, основательно снижающих его экспрессию. В работе использовалась 31 уникальная линия с летальными мутациями в районе lawc/Trf2, которые были получены в лаборатории генетических основ морфогенеза (ИБР РАН), и девять линий, полученных из коллекционного центра линий дрозофилы (Блумингтон, США). Линии другой группы (27 линий), три из которых (lawc19, lawc69, lawc33) содержали летальные lawc-мутации, вызванные пониженной экспрессией полноразмерной изоформы, и одна (lawc73), у которой гибель особей была вызвана пониженной экспрессией эволюционно вариабельного N-концевого участка полноразмерной изоформы TRF2, являлись производными исходной линии, содержащей видимую мутацию lawcp1, и были получены ранее в нашей лаборатории (Модестова и др., 2005). Г - схема апикального сжатия клеток вентральной борозды: 1) экспрессия транскрипционного фактора twist (twi ), определяющего мезодермальную судьбу вентральных клеток, активирует транскрипцию fog, что приводит к накоплению и секреции белка Fog на их апикальной поверхности (синие кружки); 2) связавшись на апикальной поверхности с белком Fog, неизвестный рецептор включает сигнальный путь, активирующий киназу Rho1 (ROK) (красная звезда), которая в свою очередь активирует способность миозина взаимодействовать с актином и направленно сокращаться в сторону апикальной поверхности клетки (стрелки); 3) актин-миозиновый цитоскелет связан с клеточной поверхностью через адгерентные связи (красные прямоугольники), сила, вызванная сокращением апикально расположенного актин-миозинового цитоскелета, распрямляет и уплощает куполовидную апикальную поверхность клеки и тянет вверх адгерентные связи (стрелки); 4) далее сокращение апикального актин-миозина направлено на адгерентные связи, сближая их, в результате чего происходит апикальное сокращение клеток.У дрозофилы в отличие от позвоночных животных и человека белок TRF2 представлен двумя изоформами. Более того, нокаут гена Trf2 у мыши не приводит к гибели особей и ограничивается лишь стерильностью самцов. Однако у позвоночных животных недавно обнаружен ген Trf3, который, как оказалось, экспрессируется узкоспецифично: в ооцитах и на ранней эмбриональной стадии развития (Gazdag et al., 2007). У дрозофилы известны мутации гена lawc/Trf2, снижающие фертильность самок, связанную с нарушением созревания ооцита (Копытова и др, 2005). Исследуя фенотип погибших эмбрионов, и анализируя полученные ранее генетические данные, можно заключить, что небольшое нарушение концентрации любой из изоформ TRF2 приводит к неправильному формированию вентральной борозды.В подавляющем большинстве линий со сниженной экспрессией, как эволюционно-консервативной укороченной, так и полноразмерной изоформ белка TRF2, возникает гибель особей на эмбриональной стадии развития. Нарушение экспрессии лишь эволюционно-вариабельного N-концевого участка полноразмерной изоформы TRF2 сдвигает время гибели особей на более поздние стадии развития.

В данной работе впервые были охарактеризованы летальные мутации гена lawc/Trf2 у D.melanogaster. Мы показали, что гибель особей наступает преимущественно на эмбриональной стадии развития. У дрозофилы в отличие от позвоночных животных и человека белок TRF2 представлен двумя изоформами. Более того, нокаут гена Trf2 у мыши не приводит к гибели особей и ограничивается лишь стерильностью самцов. Однако у позвоночных животных недавно обнаружен ген Trf3, который, как оказалось, экспрессируется узкоспецифично: в ооцитах и на ранней эмбриональной стадии развития (Gazdag et al., 2007). У дрозофилы известны мутации гена lawc/Trf2, снижающие фертильность самок, связанную с нарушением созревания ооцита (Копытова и др, 2005). Таким образом, можно предположить, что по влиянию на развитие белок TRF2 дрозофилы ближе к TRF3 позвоночных.

Исследуя фенотип погибших эмбрионов, и анализируя полученные ранее генетические данные, можно заключить, что небольшое нарушение концентрации любой из изоформ TRF2 приводит к неправильному формированию вентральной борозды. Этот процесс, очевидно, наиболее чувствителен к колебаниям уровня экспрессии гена lawc/Trf2. Более сильные аллели приводят к нарушениям сокращения зародышевой полоски и спинного закрытия, возможно, контролируя сигнальный путь JNK. Экспрессия полноразмерной изоформы специфически контролирует нейрогенез, возможно, через активацию сигнального пути Notch. Особой функцией в эмбриогенезе обладает и N-концевой отдел полноразмерной изоформы TRF2, которая очевидно, необходима для миграции и слияния трахейных ветвей при формировании дыхательной системы зародыша. Материнский эффект этого гена приводит к асинхронным делениям ядер эмбрионального синцития. Таким образом, несмотря на то, что продуктом lawc/Trf2 является один из трех известных на данный момент у дрозофилы факторов базовой транскрипции, нарушение его экспрессии вызывает хотя и сильные, но весьма специфические дефекты. В основном все они связаны с миграцией и движением эпителиальных клеток, в основе которых лежит скоординированное изменение их формы и размера. Хотя отдельные изменения формы клеток, свойственные каждому процессу, хорошо описаны, однако, как это происходит механистически, мало понятно. Изменение формы клеток зависит от актина и миозина, а то, какую форму примет клетка зависит от регуляторных белков цитоскелета. Выяснение того, как взаимодействуют морфогенетические регуляторы, и в частности эволюционно консервативные факторы транскрипции, к каким относится TRF2, поможет понять процесс формообразования органов и тканей.1. В подавляющем большинстве линий со сниженной экспрессией, как эволюционно-консервативной укороченной, так и полноразмерной изоформ белка TRF2, возникает гибель особей на эмбриональной стадии развития.

2. Нарушение экспрессии лишь эволюционно-вариабельного N-концевого участка полноразмерной изоформы TRF2 сдвигает время гибели особей на более поздние стадии развития.

3. Снижение уровня экспрессии любой из изоформ TRF2 нарушает дорсо-вентральную полярность эмбринов. Неправильное формирование вентральной борозды у мутантов вызвано нарушением сжимания апикальной поверхности ее клеток.

4. Снижение уровня экспрессии полноразмерной изоформы вызывает гипертрофию периферической нервной системы эмбриона.

5. Эволюционно-вариабельный домен TRF2 необходим на финальных этапах формирования дыхательной системы эмбриона во время слияния трахейных ветвей.

6. Снижение уровня экспрессии TRF2 в оогенезе родительских самок вызывает материнский эффект, приводящий к нарушению синхронности первых делений ядер эмбрионального синцития у их потомков.

7. Молекулярное исследование четырех мутантных линий выявило делеции внутри кодирующей белок последовательности гена lawc/Trf2.

1. Воронцова Ю.Е., Модестова Е.А.,. Бурдина Н.В., Симонова О.Б.. Восстановление жизнеспособности летальных мутантов гена leg-arista-wing complex на фоне конструкций, экспрессирующих домены гена trf 2, у Drosophila melanogaster // ДАН. 2007. Т. 417. №1. С. 429-31.

2. Симонова О.Б., Бурдина Н.В. Морфогенетическое движение клеток в эмбриогенезе Drosophila: механизмы и генетический контроль // Онтогенез. 2009. Т. 40. №5. С. 355-372.

Тезисы конференций: 1. Simonova O., Modestova E., Kopantseva M.R., Vorontsova J., Burdina N.V., Korochkin L. Lethal and sterile mutations in leg-arista-wing complex: zygotic and maternal effects // 47th Annual Drosophila Research Conference. Houston. USA. 2006. Р.481С.

2. Бурдина Н.В.. Морфологический анализ летальных эмбрионов, мутантных по гену leg-arista-wing complex у Drosophila melanogaster // Тезисы Конференции молодых ученых ИБР РАН. Онтогенез. 2007. Т. 38. №4. С. 314-315.

3. Бурдина Н.В.. Исследование функции нейрогена leg-arista-wing complex в эмбриогенезе у Drosophila melanogaster // Всероссийская медико-биологическая научная конференция молодых ученых «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Х Всероссийская конференция «Человек и его здоровье»). Спб. 2007. С. 60-61.

4. Бурдина Н.В., Мерцалов И.Б., Куликова Д.А., О.Б. Симонова. Исследование молекулярной структуры двух аллельных вариантов гена lawc/trf2, нарушающих развитие Drosophila melanogaster // «Проблемы молекулярной и клеточной биологии». Сборник Международной молодежной научно-методической конференции Томск. 2007. С. 35-36.

5. Симонова О.Б., Модестова Е.А., Бурдина Н.В., Мерцалов И.Б., Куликова Д.А., Кузин Б.А. Гипоморфные мутации транс-регуляторных генов как фактор фенотипического разнообразия органов и тканей у высших многоклеточных организмов. Получение и молекулярно-генетический анализ транс-регуляторных мутаций гена дрозофилы leg-arista-wing complex - гомолога фактору базовой транскрипции человека TBP related factor 2 // Программа фундаментальных исследований РАН №11 «Биоразнообразие и динамика генофондов», подпрограмма II «Динамика генофондов». Материалы отчетной конференции, посвященной памяти академика Ю.П. Алтухова. Москва. 2007. С. 125-126.

6. Simonova O., Burdina N., Vorontsova J., Cherezov R., Modestova E., Mertsalov I., Kulikova D. Two leg-arista-wing complex mutations disrupt different coding regions of TBP related factor 2 in Drosophila melanogaster// 49th Annual Drosophila Research Conference. San Diego. USA. 2008. P.186, 290B.

7. Симонова О.Б., Бурдина Н.В., Воронцова Ю.Е., Черезов Р.О., Кузин Б.А. Гипоморфные мутации транс-регуляторных генов как фактор фенотипического разнообразия органов и тканей у высших многоклеточных организмов. Продукты гена lawc/trf2 синхронизируют деления и координируют клеточную миграцию во время развития у Drosophila melanogaster // Сборник статей подпрограммы II «Динамика генофондов» Программы фундаментальных исследований РАН №11 «Биоразнообразие и динамика генофондов». 2008. Т.3. С.129-131.

8. Бурдина Н.В., Мерцалов И.Б., Куликова Д.А., Симонова О.Б. Выявление и анализ фенотипического проявления двух мутаций, нарушающих структуру разных доменов гена lawc/trf2 у Drosophila melanogaster // Тезисы Конференции молодых ученых ИБР РАН. Онтогенез. 2008. Т.39. №4. С.311.

9. Simonova O., Burdina N., Vorontsova J., Cherezov R. Isolation and investigation of hypomorphic lethal mutations that specifically disturb the expression of each two protein izoforms of TBP related factor 2 in Drosophila // 50th Annual Drosophila Research Conference. Chicago. USA. 2009. 913A. P.44.

10. Бурдина Н.В. Особенности эмбриогенеза мутантов leg-arista-wing complex с нарушенной экспрессией фактора транскрипции TRF2 у Drosophila melanogaster // Тезисы Конференции молодых ученых ИБР РАН. Онтогенез. 2009. Т.40. №.4. С.308-309.

Размещено на .ru