Исследование ингибиторной активности фосфорорганических соединений - Диссертация

Органические производные пятивалентного фосфора (фосфорорганические соединения, ФОС) широко применяются в агрохимической практике и ветеринарии (инсектициды, акарициды, противопаразитные агенты), в промышленности (пластификаторы, компоненты смазочных материалов, антипирены), в качестве лекарственных средств для лечения шистосомоза (метрифонат), глаукомы (экотиофат), рака (циклофосфамид), остеопороза (некоторые бисфосфонаты). Фармакологическое применение антихолинэстеразных соединений и потребность в новых эффективных препаратах, не обладающих опасными побочными эффектами, обусловливают необходимость разработки методологии прогнозирования потенциальных терапевтических и токсических эффектов соединений на этапе их синтеза и исследований in vitro. Для характеристики эффективности взаимодействия антихолинэстеразных соединений с эстеразами-мишенями in vitro в нашей лаборатории предложена концепция «эстеразного профиля» - набора кинетических констант, описывающих ингибиторную активность соединения в отношении эстераз различной функциональной значимости: ацетилхолинэстеразы (КФ 3.1.1.7, АХЭ, острая токсичность, улучшение когнитивных функций); нейротоксичной эстеразы (КФ 3.1.1.5, НТЭ, отставленная нейротоксичность, ОНТФОС), бутирилхолинэстеразы (КФ 3.1.1.8, БХЭ, стехиометрический скэвенджер, улучшение когнитивных функций, модуляция метаболизма лекарств), карбоксилэстеразы (КФ 3.1.1.1, КЭ, стехиометрический скэвенджер, модуляция метаболизма лекарств). В токсикологических и фармакологических исследованиях комплексная оценка химических рисков и потенциальных терапевтических свойств соединений основывается на предположении (экстраполяции), что эффект, наблюдаемый на лабораторных животных, будет наблюдаться и у человека. Ценность таких моделей заключается не только или не столько в их способности заменить животных, сколько в получении максимально полной информации о потенциальных фармакологических и токсических свойствах соединений до проведения исследований на животных.(ЭДТА), протеин стандарт (бычий сывороточный альбумин (BSA), хлорид кальция (CACL2); диметилсульфоксид (DMSO), этопропазин (ЭПР), 1-нафтилацетат (1-NA), 4-нитрофенилацетат (4-NPA), фенилацетат (PHA), эзерин, диэтил-4-нитрофениловый эфир фосфорной кислоты (параоксон, РО), тетра(моноизопропил)пирофосфотетрамид (iso-OMPA), бис-пара-нитро-фенилфосфат (BNPP) фирмы Sigma-Aldrich (США); 4-аминоантипирин (4-ААП) (Acros organics, Бельгия); фенилвалерат (PHV) и мипафокс (МХ) (Oryza Laboratory Inc., США), цитрат натрия (Merck, Германия). О-фосфорилированные гексафторизопропанолы (PFP): O,O-диэтил-O-(1-трифторметил-2,2,2-трифторэтил)фосфат (DIET-PFP) и O,O-дибутил-O-(1-трифторметил-2,2,2-трифторэтил)фосфат (DIBU-PFP); серия O,O-диалкил-O-(1-этоксикарбонил-2,2,2-трифторэтил) фосфатов (O-фосфорилированных этилтрифторлактатов, TFL) и O,O-ди-1-пропил-О-2,2-дихлорвинилфосфат (DIPR-DCLVP) синтезированы и предоставлены зав. лаб. синтеза физиологически активных веществ ИФАВ РАН к.х.н.Определение бимолекулярных констант ингибирования АХЭ, БХЭ, КЭ и НТЭ исследуемыми ФОС (ki, М-1мин-1) проводили с использованием коммерческих препаратов ферментов фирмы Sigma-Aldrich (США) - ацетилхолинэстеразы (АХЭ, Е.С. 3.1.1.7) эритроцитов человека (500 Ед/мг, C0663), бутирилхолинэстеразы (БХЭ, Е.С. 3.1.18) сыворотки крови лошади (500 Ед/мг, (C4290)), карбоксилэстеразы (КЭ, E.C. 3.1.1.1.) печени свиньи (150 Ед/мг, (E2884)); и стабильного лиофилизованного препарата НТЭ мозга кур (ЛИОНТЭ), полученного по методике, разработанной в нашей лаборатории и детально описанной в работах [457, 458]. Активность НТЭ определяли как разность между параоксон-резистентной (ЛИОНТЭ) и (параоксон мипафокс)-резистентной (ЛИОНТЭ мипафокс 250 МКМ, 20 мин) эстеразной активностью в соответствии с дифференциальным методом Johnson M.K. Реакцию проводили в 50 ММ трис-HCL буфере РН 8.0 с 0.2 ММ ЭДТА при 37°C, субстрат - 1.4 ММ фенилвалерат. Контрольная проба без ингибитора содержала 10 мкл 5% раствора ацетона в соответствующем рабочем буфере и 40 мкл раствора фермента в буфере. Исходную активность препарата ЛИОНТЭ (V0) определяли как разницу между РО-резистентной фенилвалерат-гидролизирующей активностью (VPO) - проба 1 (0.855 мл рабочего буфера, 0.02 мл растворителя (ацетон) и 0.125 мл препарата ЛИОНТЭ, объем смеси 1 мл) и (РО МХ)-резистентной активностью (VPO MX) - проба 2 (0.835 мл рабочего буфера, 0.02 мл растворителя, 0.02 мл 12.5 ММ раствора МХ (250 МКМ конечная концентрация), 0.125 мл препарата ЛИОНТЭ, объем смеси 1 мл).Количество плазмы крови человека, взятой для анализа составляло 60 и 10 мкл, плазмы крысы - 15 и 40 мкл, 9S фракции гомогената мозга мыши - 20 и 75 мкл для АХЭ и БХЭ соответственно, и 20 мкл препарата 9S фракции гомогената мозга кур, предварительно разбавленного в соотношении 1:3 рабочим буфером. Объем рабочего буфера для каждой реакции рассчитывали, исходя из суммарного объема реакционной смеси - 3 мл. Количество гемолизованной крови, взятой для анализа, составляло для человека и крысы 1 мл, для м

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Ацетилхолинэстераза

1.2 Бутирилхолинэстераза

1.3 Нейротоксичная эстераза

1.4 Карбоксилэстераза

1.5 Параоксоназа

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1 Материалы

2.2 Исследование кинетики ингибирования АХЭ, БХЭ, КЭ и НТЭ фосфорорганическими соединениями

2.3 Приготовление препаратов тканей (мозга и крови)

2.4 Определение активности эстераз в препаратах мозга и крови

2.5 Определение величин IC50 для ингибирования АХЭ, БХЭ, КЭ и НТЭ исследуемыми соединениями в препаратах мозга и крови

2.6 Эксперименты на животных

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

3.1 Исследование эстеразного профиля новых фосфорорганических соединений для оценки их биологической активности как потенциальных ингибиторов сериновых эстераз

3.2 Исследование активности АХЭ, БХЭ, КЭ, НТЭ и PON1 в крови оценка «эстеразного статуса» человека и грызунов

3.3 Мыши как модель для биохимической оценки нейропатичного потенциала фосфорорганических соединений

3.4 Исследование эффектов фосфорорганических соединений с различным эстеразным профилем на препаратах мозга и крови мышей in vitro

3.5 Исследование эффектов фосфорорганических соединений с различным эстеразным профилем на уровне целого организма

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ