Исследование in vitro и in vivo морфофизиологических характеристик Escherichia coli и Staphylococcus aureus при действии низкоинтенсивного излучения видимого и радиодиапазонов - Автореферат

Цель работы - изучить изменения численности популяций, морфологических и физиологических характеристик бактерий Staphylococcus aureus 209Р и Escherichia coli в условиях in vitro при действии синего и красного низкоинтенсивных светодиодных излучений (НСИ), дециметровых сверхвысокочастотных (СВЧ) радиоволн с разной поляризацией и мощностью, а также влияние разных штаммов E. coli на микроциркуляцию крови в брыжейке белых крыс. Показаны изменения морфологических и физиологических характеристик несенсибилизированных и сенсибилизированных метиленовым синим штаммов E. coli при действии in vitro низкоинтенсивного светодиодного синего (467 нм) и красного (660 нм) излучений. Популяционная численность, морфологические и физиологические характеристики бактерий E. coli Ca58 претерпевают дозозависимые изменения под действием светодиодного красного (660 нм) излучения на сенсибилизированную метиленовым синим культуру, и светодиодного синего (467 нм) излучения - на несенсибилизированную культуру. Аппликация бактериальных взвесей E. coli, подвергнутых фотодинамическому воздействию, и токсинсодержащего материала E. coli приводит к изменениям скорости микроциркуляции крови в капиллярах брыжейки белых крыс, регистрируемых методом спекл-микроскопии. В качестве объектов исследования использовали микроорганизмы: E. coli A5, E. coli B, E. coli B5, E. coli Ca58, E. coli K12, E. coli О1 и S. aureus 209P, полученные из музея микроорганизмов кафедры микробиологии и физиологии растений Саратовского государственного университета имени Н.Г. Чернышевского.Выявлены изменения численности популяции E. coli Ca58, уменьшение размеров клеток, стимуляция сахаролитической активности и повышение резистентности к большинству исследованных антибиотиков при действии на сенсибилизированную метиленовым синим бактериальную взвесь красного (660 нм) низкоинтенсивного светодиодного излучения в дозах 2394, 2736 и 4104 Дж/см2; отмечено достоверное снижение числа КОЕ E. coli Ca58 без изменения размеров клеток при действии этого излучения в диапазоне доз 34,2 - 478,8 Дж/см2.

Актуальность темы. Изучение морфофизиологических характеристик условно-патогенных бактерий и их взаимодействия с организмом животных и человека представляет традиционно большой интерес в области прикладной микробиологии, в то же время актуальными задачами являются исследования состояния микробных популяций и их адаптационного потенциала на фоне действия стрессовых факторов различной природы (Шендеров, 1994; 1998; Белобородова, 1998; Митрохин, 2000; Доронин, Шендеров, 2002; Ильин, Воложин, Виха, 2005; Ильина, 2006; Тихомирова, 2007; Shrivastava, 2007).

В настоящее время в медико-биологических исследованиях и в клинической практике для достижения выраженного фотодинамического эффекта по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмов, равно как и с целью терапевтического воздействия на макроорганизм, широко используются электромагнитные излучения с различными длинами волн (Фрайкин и др., 1986; Зорина и др., 1988; Страховская и др., 1998; Тучин, 1998; Страховская и др., 2002а; 2002б; Шумарина и др., 2003; Soukos, Ximenez-Fyvie, Hamblin, 1998; Bliss et al., 2004; Hamblin, Hasan, 2004; Lin, Chen, Huang, 2004; Maisch et al., 2005; Wong, 2005).

Антибактериальная фотодинамическая терапия (ФДТ), основанная на избирательной окислительной деструкции патогенных микроорганизмов при комбинированном воздействии красителя-фотосенсибилизатора и света с определенной длиной волны, рассматривается на настоящий момент как альтернатива антибиотикотерапии (Абрамова, 1978; Готовский, Вышеславцев, Косарева, 2001; Kjedstad, Johnson, 1986; Wainwright, 1998; Strakhovskaya et al., 1999; Wood et al., 1999; Meisel, Kocher, 2005). Представляется возможным использовать эффект действия излучений для коррекции численности определенного вида бактерий в составе нормальной микрофлоры (Журавлева, 2004; Тучина, 2008; Wilson, Dobson, Harvey, 1992; Wilson, 1993; Millson et al., 1996; Zeina et al., 2001; Tuchin et al, 2003). В литературе достаточно широко описаны эффекты действия на микроорганизмы ионизирующих и УФ-излучений (Владимиров и др., 1975; Цзю, Джаманова, Прохорова, 1983; Фрайкин и др., 1986; Беленикина, Фрайкин, 1989); в то время как влияние видимого света и, особенно, длинноволновых (ИК- и радиодиапазона) излучений остается практически не исследованным. При этом следует отметить, что изучение эффектов, оказываемых излучениями на бактерии, имеет и фундаментальный характер, поскольку излучения способны оказывать как положительное, так и отрицательное влияние, механизмы которого не ясны до настоящего времени (Рубин, 1973; Тимошин, Бекер, 1990; Тимошин, Данилевич, Рапопорт, 1991; Трушин, 2002). Данных о стрессовых реакциях микроорганизмов на действие этих типов излучений, используемых в ФДТ, и оценке их адаптационного потенциала, недостаточно, а их получение представляет значительный научный интерес и может иметь прикладное значение.

Микроорганизмы и биологические препараты, созданные на их основе, могут неоднозначно действовать на макроорганизм, вызывая как местные, так и общие побочные реакции за счет различных метаболитов (Мельников, 1969; Бондаренко, 1999; Воробьев, 1999; Тихомирова, 2005; Brubaker, 1985; Isenberg, 1988; Finley, Falkow, 1989; Bhakdi, Tranum-Jensen, 1991; Falkow, Isberg, Portnoy, 1992; Dougan, 1994). В общем случае местные патологические реакции приводят к нарушениям лимфо- и гемодинамики, прежде всего в микрососудах. Подобные изменения характеристик и структуры потоков крови несут в себе важную патогенетическую и диагностическую информацию, отражающую характер действия микроорганизма на состояние макроорганизма (Борисов, Дворкина, Корнеева, 1985; Галанжа, 2004; Ульянова, Ганилова, Ульянов, 2007). Для оценки этого влияния в последние годы в биомедицинской практике используется спекл-микроскопия, позволяющая in vivo в режиме реального времени провести наблюдение за изменениями гемодинамики сосудов (Тучин, 1998; Федосов, Ульянов, 2001; Ульянова, 2006; Ульянова, Ганилова, Ульянов, 2007; Aizu et al., 1990; Ulyanov, 1995; 2001; 2002).

В связи с вышеизложенным представляется актуальным изучение реакций популяций бактерий на действие низкоинтенсивного излучения видимого и радиодиапазонов антропогенного происхождения и оценка локального влияния этих бактерий на микроциркуляцию крови макроорганизма методом спекл-микроскопии.

Цель работы - изучить изменения численности популяций, морфологических и физиологических характеристик бактерий Staphylococcus aureus 209Р и Escherichia coli в условиях in vitro при действии синего и красного низкоинтенсивных светодиодных излучений (НСИ), дециметровых сверхвысокочастотных (СВЧ) радиоволн с разной поляризацией и мощностью, а также влияние разных штаммов E. coli на микроциркуляцию крови в брыжейке белых крыс.

Для достижения данной цели были поставлены и решены следующие задачи: 1. Оценить численность популяции клеток E. coli Са58 под влиянием синего низкоинтенсивного светодиодного излучения.

2. Изучить культуральные свойства, морфологические характеристики и численность популяции сенсибилизированных метиленовым синим клеток E. coli Са58 при действии красного низкоинтенсивного светодиодного излучения.

3. Определить изменения численности популяций бактериальных клеток E. coli Са58 и S. aureus 209Р под влиянием низкоинтенсивного дециметрового СВЧ-радиоизлучения с разной поляризацией и мощностью.

4. Оценить in vivo влияние бактериальных взвесей различных штаммов E. coli, сенсибилизированных метиленовым синим и подвергнутых фотодинамическому воздействию, и токсинсодержащего материала на микроциркуляцию крови в брыжейке белых крыс extempore методом спекл-микроскопии.

Научная новизна. Показаны изменения морфологических и физиологических характеристик несенсибилизированных и сенсибилизированных метиленовым синим штаммов E. coli при действии in vitro низкоинтенсивного светодиодного синего (467 нм) и красного (660 нм) излучений. Определен дозозависимый характер изменения жизнеспособности условно-патогенных штаммов E. coli при действии красного НСИ. Впервые установлено влияние in vitro на численность популяций и культуральные свойства разных штаммов E. coli и S. aureus 209Р дециметровых радиоволн СВЧ-диапазона и показана зависимость численности популяций изученных штаммов от поляризации и мощности СВЧ излучения. Впервые показаны изменения скорости кровотока в брыжейке белых крыс extempore in vivo при действии облученных красным НСИ сенсибилизированных клеток E. coli разных штаммов. Обнаружено увеличение скорости кровотока в первые минуты после аппликации на брыжейку белых крыс супернатанта необлученных и несенсибилизированных штаммов E. coli, содержащего экзо- или эндотоксин.

Практическая значимость. Полученные результаты вносят вклад в разделы микробиологии, связанные с исследованиями процессов адаптации микроорганизмов к действию стрессовых факторов антропогенного происхождения, а также в понимание механизмов действия биологических препаратов на циркуляцию крови в капиллярах макроорганизма.

Выявлены параметры светодиодного и радиоизлучения, способные привести к увеличению или уменьшению численности E. coli Ca58 и S. aureus 209P. Результаты исследований могут быть использованы в практике биомедицинских исследований действия разных видов излучений, а также в клинической практике с целью выбора оптимальных режимов излучения при фотодинамической и микроволновой терапии при лечении и профилактике гнойно-воспалительных заболеваний.

Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций по общей микробиологии и экологии микроорганизмов, написании курсовых и дипломных работ в Саратовском государственном университете имени Н.Г Чернышевского и Саратовском государственном техническом университете.

Основные положения, выносимые на защиту: 1. Популяционная численность, морфологические и физиологические характеристики бактерий E. coli Ca58 претерпевают дозозависимые изменения под действием светодиодного красного (660 нм) излучения на сенсибилизированную метиленовым синим культуру, и светодиодного синего (467 нм) излучения - на несенсибилизированную культуру.

2. Популяционная численность E. coli Ca58 и S. aureus 209P изменяется под действием низкоинтенсивного дециметрового СВЧ-радиоизлучения различной поляризации и мощности.

3. Аппликация бактериальных взвесей E. coli, подвергнутых фотодинамическому воздействию, и токсинсодержащего материала E. coli приводит к изменениям скорости микроциркуляции крови в капиллярах брыжейки белых крыс, регистрируемых методом спекл-микроскопии.

Работа выполнена в рамках НИР СГТУ «Разработка методических подходов к комплексной оценке состояния живых организмов при действии различных экологических факторов», частично поддержана грантом № 45434 в рамках ведомственной научной программы «Развитие научного потенциала высшей школы» (СГУ, 2006); а также в рамках НИР Федерального агентства по образованию № 1.4.09. «Исследование взаимодействия оптического излучения с биологическими тканями и разработка когерентно-оптических и спектральных методов медицинской диагностики и фототерапии» (СГУ, 2009).

Апробация работы. Основные результаты и положения работы представлены на: Международных школах для молодых ученых и студентов по оптике, лазерной физике и биофизике Saratov Fall Meeting (Саратов, 2003; 2007); научных конференциях биологического факультета СГУ «Исследования молодых ученых и студентов в биологии, секция «Микробиология и паразитология» (Саратов, 2004; 2005; 2008);

IV Съезде фотобиологов России (Саратов, 2005); Заочной электронной конференции РАЕ «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии» (2007 г.); XII Всероссийском Форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2008); 4-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Экологические проблемы промышленных городов» (Саратов, 2009); 1-м этапе молодежного научно-инновационного конкурса «У.М.Н.И.К.» Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере (Саратов, 2009).

Публикации. Основные результаты диссертационной работы опубликованы в 9 печатных работах, в том числе 3 - в изданиях из перечня ВАК РФ.

1. Материалы и методы микробный стрессовый кишечный

В качестве объектов исследования использовали микроорганизмы: E. coli A5, E. coli B, E. coli B5, E. coli Ca58, E. coli K12, E. coli О1 и S. aureus 209P, полученные из музея микроорганизмов кафедры микробиологии и физиологии растений Саратовского государственного университета имени Н.Г. Чернышевского.

Во всех экспериментах использовали суточные культуры бактерий, выращенные на скошенном мясопептонном агаре (МПА) при 37 ?C. Бактериальную взвесь готовили в стерильном физиологическом растворе по стандарту мутности №5 (500 млн. клеток в мл), путем последовательных разведений получали рабочую концентрацию 500 клеток в мл.

Для проведения экспериментов по облучению видимым излучением нами была разработана схема опытной установки для облучения бактериальных взвесей, состоящая из источника постоянного тока, светодиодного излучателя и 18-ти ячеистой кюветы. Установка накрывалась стеклянным конусом-воронкой для создания асептических условий (рис. 1).

Рис. 1. Схема экспериментальной установки

При проведении экспериментов использовали низкоинтенсивные светодиодные излучения (НСИ) видимого синего (467 нм) и красного (660 нм) диапазонов, а также дециметровое сверхвысокочастотное (СВЧ) радиоизлучение (30 см). В качестве источника синего НСИ использовали светодиодный излучатель Ultra Lime 5™ с максимумом спектра испускания в синей области 467±10 нм и мощностью без фильтров порядка 700 - 800 МВТ, с собирающим прозрачным фильтром - 100 МВТ. В качестве источника красного НСИ - светодиод с длиной волны 660±10 нм и мощностью 6 МВТ. В качестве источника радиоизлучения использовали СВЧ-излучатель Акватон - 01 (ООО «Телемак-Наука») с регулируемой мощностью, и сменными излучателями различной поляризации, длина волны испускаемого излучения составляла ~ 30 см, частота - 1 ГГЦ. В опытах применяли неполяризованное радиоизлучение мощностью 10 и 100 МКВТ, а также радиоизлучение мощностью 1 МКВТ с право- и левовращающей поляризацией. Во всех экспериментах использовали непрерывный режим излучения.

В экспериментах использовали культуры бактерий, не сенсибилизированные и сенсибилизированные метиленовым синим (МС) в качестве фотосенсибилизатора (Лабинская, 1978), обладающего максимумом поглощения при длинах волн 650 - 670 нм. Перед постановкой опытов с сенсибилизированными культурами взвесь бактерий обрабатывали водно-спиртовым 2% раствором фотосенсибилизатора в соотношении фотосенсибилизатор к взвеси 1:15 в течение 30 минут при 37 ?C, конечная концентрация составляла 0,15%. Бактериальную взвесь в объеме 0,2 мл вносили в ячейки кюветы и подвергали действию видимого НСИ, последовательно увеличивая экспозицию с 1 до 4 с и с 10 до 100 с в случае синего НСИ, а также с 1 до 14 мин и с 6 до 84 с в случае красного НСИ. Контролем служили взвеси бактерий, не подвергнутые облучению. После облучения производили высев бактерий на МПА или среды Гисса. Через 24 - 48 часов после инкубации при 37 ?С определяли морфологические и физиологические характеристики: численность популяции бактерий и число КОЕ, морфологию колоний и клеток, особенности роста на питательных средах (Методы…, 1984; Теппер, Шильникова, Переверзева., 2004; Нетрусов, Егорова, Захарчук, 2005). Для изучения биохимической активности изучаемых штаммов использовали стандартные методики (Сидоров, Скородумов, Федотов, 1995). Определение чувствительности культуры E. coli Ca58 к антибиотикам - стрептомицину, тетрациклину, левомицетину, олеандомицину и гентамицину - осуществляли с помощью диско-диффузного метода. Учет чувствительности к антибиотикам проводили путем измерения зоны задержки роста культуры (Ланчини, Паренти, 1985) и дальнейшей статистической обработки полученных данных.

Для анализа морфологии отдельных бактериальных клеток готовили микропрепараты из отдельных колоний и окрашивали генцианвиолетом, разведенным карболовым фуксином, либо по методу Грама. Микропрепараты изучали путем световой микроскопии под масляной иммерсией при помощи цифровой камеры-окуляра для микроскопа SCOPETEK® DCM 35 с выведением изображения на экран компьютера (увеличение 900Х).

Для проведения экспериментов по воздействию низкоинтенсивного СВЧ-излучения дециметрового диапазона бактериальные взвеси предварительно высевали на МПА в чашки Петри и затем подвергали облучению. Во всех случаях излучатель аппарата Акватон - 01 помещали на расстоянии 10 см над поверхностью питательной среды и проводили воздействие поляризованным и неполяризованным радиоизлучением на бактерии в течение 10 мин. Учет результатов проводили через двое суток для E. coli Ca58 и через сутки - для S. aureus 209P.

Исследования микроциркуляции крови методом спекл-микроскопии проводили в Научной бактериологической лаборатории НИЧ СГУ имени Н.Г. Чернышевского. При постановке экспериментов использовали микроскоп «Биолам», в который был введен дополнительный источник когерентного света - He-Ne лазер с максимумом спектра испускания 633 нм и мощностью 1 МВТ (Илларионов, 1994; Ульянова, Ганилова, Ульянов, 2007).

В качестве экспериментальных животных использовали 46 беспородных белых крыс двух-, трехмесячного возраста массой 180 - 200 г, без различия пола. Для наркоза применяли внутримышечную инъекцию натриевой соли 5-этил-5-(1-метилбутил)-2,4,6-триокси-пиримидина (нембутал) из расчета 0,5 мг на 1 г массы тела. Эксперимент проводился во время глубокого наркоза, адекватность анестезии оценивалась по частоте дыхания и зрачковому рефлексу (Чернух, Александров, Алексеев, 1984). Лапаротомию выполняли по средней линии тела на протяжении ~1 - 1,5 см, после чего животное помещали на специальный термостабилизированный столик (t = 38 ?С) и извлекали петлю тонкого кишечника с брыжейкой для наблюдения микроциркуляции. Регистрацию параметров микроциркуляции осуществляли через 10 - 15 минут после вскрытия брюшной полости для уменьшения послеоперационных изменений.

В исследованиях на петлю брыжейки наносили взвеси исследуемых штаммов E. coli или супернатант культуры в объеме 0,5 мл и по истечении 1 мин проводили регистрацию исходящего сигнала спекл-микроскопа в течение 10 с. Супернатанты культур E. coli A5 и E. coli B6 получали путем центрифугирования при 600g. При изучении их влияния на кровоток повторные регистрации проводили через 2, 3, 4 и 5 мин для изучения динамики процесса; при изучении влияния бактериальных взвесей

E. coli B., E. coli Ca58, E. coli K12, E. coli O1 - регистрацию осуществляли в течение 1 минуты каждые 5 мин на протяжении 30 мин. В качестве контроля использовали значения скорости кровотока до нанесения исследуемого материала. Выходящий сигнал оцифровывался, записывался в wav-файл и затем обрабатывался при помощи оригинального алгоритма для прикладного пакета программ MATHCAD 2001. Полученные данные представлены как изменения ширины полосы спектра (ШПС) флуктуации интенсивности сигнала для каждого временного периода регистрации.

Для статистической обработки экспериментальных данных использовали непараметрические критерии Уилкоксона-Манна-Уитни и параметрический t-критерий Стьюдента. Достоверными считали различия при вероятности ошибки p<0.05 (95% доверительный интервал). Результаты исследования количественных параметров в группах сравнения представлены в виде M±m, где М - среднее арифметическое значение из выборки, m - стандартная ошибка средней (Ойвин, 1960; Ашмарин, Воробьев, 1962; Ашмарин, Васильев, Амбросов, 1974; Урбах, 1975; Афифи, Эйзен, 1982).Расчет результатов осуществляли с применением пакета прикладных программ Statistica 6.0 (for Windows; «Stat Soft Inc.», США), Microsoft Excel 2002 (for Windows).

2. Изменения морфофизиологических характеристик E. coli Ca58 при действии синего и красного низкоинтенсивных светодиодных излучений

В первой серии экспериментов проводили облучение бактериальной взвеси E. coli Ca58 (несенсибилизированной МС) синим НСИ в экспозиции 1 - 4 с и 10 - 100 с, чему соответствовали дозы от 23 до 2300 Дж/см2. На основании полученных результатов были построены графики зависимости изменения числа КОЕ от экспозиции (рис. 2).

Рис. 2. Значения КОЕ при облучении взвеси E. coli Ca58 синим НСИ в экспозициях 1 - 4 с и 10 - 100 с

Выявлена стимуляция роста и наиболее благоприятный для изучаемого штамма E. coli Ca58 диапазон экспозиций 10 - 40 с (дозы 230 - 920 Дж/см2), причем устойчивый рост числа КОЕ относительно контроля наблюдался и при облучении в экспозициях 1 - 4 с, и в экспозициях 10 - 40 с. На фоне общего увеличения численности популяций бактерий (по числу КОЕ) при воздействии светом с длиной волны 467 нм были отмечены следующие особенности: при облучении в экспозициях 10 - 40 с наблюдался дозозависимый эффект стимуляции клеточного деления, в результате происходило увеличение числа КОЕ; облучение в экспозициях 1 - 4 с характеризовалось постепенным снижением угнетающего действия синего НСИ на бактерии; при облучении экспозициями дольше 50 с однотипной динамики не выявлено (см. рис. 2).

Далее были изучены особенности влияния красного НСИ в экспозициях от 1 до 14 мин (дозы 342 - 4788 Дж/см2) на бактериальную взвесь E. coli Ca58, сенсибилизированную МС (рис. 3).

Рис. 3. Значения КОЕ при облучении взвеси E. coli Ca58 красным НСИ в экспозициях 1 - 14 мин

Установлены выраженные различия в численности популяций бактериальной культуры в зависимости от дозы облучения: стимуляция роста отмечена только при действии красного НСИ в экспозициях 7, 8 и 12 мин, которым соответствовали дозы облучения 2394, 2736 и 4104 Дж/см2 соответственно. Показано, что действие красного НСИ с вышеуказанными дозами приводило к достоверному изменению размеров облученных клеток по сравнению с контролем (рис. 4). Для изучения корреляции между численностью бактериальных популяций и размерами клеток нами было введено определение «площадь проекции клетки», представляющее собой произведение видимой длины клетки на ее ширину (рис. 5).

Рис. 4. Морфология и размеры клеток E. coli Ca58, сенсибилизированных метиленовым синим и облученных красным НСИ (8 мин), - а; контрольных - б (отрезок соответствует 3 мкм)

Рис. 5. Корреляция между числом КОЕ и «площадью проекции» клеток при облучении взвеси E. coli Ca 58 красным НСИ в экспозициях 1 - 14 мин

При действии на бактериальную взвесь красного НСИ в экспозициях 6 - 84 с, что соответствовало диапазону доз 34,2 - 478,8 Дж/см2, происходило достоверное и довольно резкое снижение численности популяции E. coli Ca58 (рис. 6).

В отличие от предыдущих серий экспериментов, было отмечено достоверное угнетение роста культуры E. coli Ca58 при действии НСИ в присутствии сенсибилизатора.

Рис. 6. Значения КОЕ при облучении E. coli Ca58 красным НСИ в экспозициях 6 - 84 с

Выраженный пессимум численности бактериальной культуры проявлялся при экспозициях дольше 36 с. При этом зависимости размеров клеток от численности популяции E. coli Ca58 не отмечено.

Исследование морфологических и культуральных особенностей E. coli Ca58 на фоне действия синего и красного НСИ не выявило принципиальных отличий по сравнению с аналогичными показателями контрольной культуры (табл. 1).

Таблица 1 - Морфология колоний E. coli Ca58 на фоне действия видимого НСИ

Морфологический признак Характеристика опыт контроль

Форма Прозрачность Характер поверхности Цвет Выделение пигмента в среду Характер края колонии Видимая структура колонии Консистенция Средние размеры круглые полупрозрачные, к центру почти непрозрачные гладкая, блестящая слабопигментированные нет гладкий однородная аморфная маслянистая вязкая до 3 - 4 мм круглые полупрозрачные гладкая слабопигментированные нет гладкий однородная вязкая не более 5 мм

Результаты исследований биохимической активности подвергнутых облучению красным НСИ в экспозиции 8 мин (доза облучения, наиболее благоприятная для роста популяции) бактерий E. coli Ca58 показали (табл. 2), что происходила активизация сахаролитических свойств в отношении сахарозы, дульцита и маннита. В то же время протеолитическая активность не изменялась.

Таблица 2 - Биохимическая активность несенсибилизированной и сенсибилизированной метиленовым синим E. coli Ca58 при действии красного НСИ

Условия опыта глюкоза сахароза дульцит маннит лактоза сорбит желатин триптофан индола H2S NH3

E. coli Ca58 1 -2 - - 3 - - - - -

E. coli Ca58 и МС - - - - - - - -

E. coli Ca58, облучение и МС - - - - -

Примечание: 1 - признак выражен; 2 - признак не выражен; 3 - признак выражен слабо.

Для более достоверной оценки изменений клеточного метаболизма были проведены эксперименты по изучению изменений чувствительности к антибиотикам исследуемого штамма E. coli Ca58. Выбор антибиотиков был обусловлен спектром их действия (подавление биосинтеза белка) и широтой практического использования. Облучение бактериальной взвеси красным НСИ осуществляли в экспозициях, которым соответствовала максимальное увеличение численности популяций и изменения морфологических и физиологических показателей клеток - 7, 8 и 12 мин. Установлено, что облучение красным НСИ приводит к повышению устойчивости изучаемого штамма в случае использования всех антибиотиков (сужению зоны задержки роста), кроме левомицетина (рис. 7).

3. Изменения численности популяций E. coli Ca58 и S. aureus 209P при действии низкоинтенсивного дециметрового СВЧ-радиоизлучения

При исследовании влияния облучения клеток S. aureus 209P и E. coli Ca58 дециметровым радиоизлучением было выявлено изменение численности их популяций в зависимости от мощности и поляризации излучения (рис. 8 а, б). Действие радиоизлучениями мощностью 1 МКВТ с право- и левовращающей поляризацией уменьшило число КОЕ S. aureus 209P относительно контроля. Облучение клеток E. coli Ca58 излучением с левовращающей поляризацией привело к увеличению численности популяции, действие правовращающего СВЧ не выявило каких-либо достоверных изменений числа КОЕ.

Рис. 7. Процентное отношение зоны задержки роста культуры E. coli Ca58 в эксперименте к контролю (контроль - 100%)

Рис. 8. Изменения популяционной численности культур S. aureus 209P и E. coli Ca58 при облучении дециметровым радиоизлучением различной мощности и поляризации: а - S. aureus 209P, б - E. coli Ca58 (поляризация, 1 МКВТ); в - S. aureus 209P; г - E. coli Ca58 (неполяризованное СВЧ, 10 и 100 МКВТ)

Воздействие 100 МКВТ СВЧ на клетки S. aureus 209P привело к увеличению численности популяции. Изменений численности популяций S. aureus 209P, облученного неполяризованным дециметровым радиоизлучением мощностью 10 МКВТ и E. coli Ca58, облученной неполяризованным СВЧ мощностью 10 и 100 МКВТ, выявлено не было (рис. 8 в, г).. Изучение влияния различных штаммов E. coli и токсинсодержащих материалов на микроциркуляцию крови в брыжейке белых крыс методом спекл-микроскопии

Для оценки действия in vivo бактериальных клеток, сенсибилизированных МС и подвергнутых действию красного НСИ, на микроциркуляцию крови в брыжейке белых крыс extempore использовали метод спекл-микроскопии. В этих опытах исследовали штаммы E. coli с разными характеристиками: E. coli B (дикий тип, представитель нормальной микрофлоры кишечника); E. coli Са58 (лактозопозитивный, продуцент колицина H, представитель нормальной микрофлоры кишечника); E. coli K12 (лактозонегативный, продуцент колицина I) и E. coli O1 - лактозонегативный, зоопатогенный. При сенсибилизации бактерий концентрация МС была уменьшена до 0,005% в связи с полученными предварительно данными о фотодинамическом повреждении наблюдаемых сосудов при нанесении бактериальных взвесей, сенсибилизированных МС в концентрации 0,15%, как в предыдущих экспериментах.

Было показано, что изменения гемодинамики в микрососудах брыжейки белых крыс происходили в течение первых секунд после аппликации сенсибилизированных и облученных бактериальных взвесей штаммов E. coli B, E. coli Са58, E. coli K12, E. coli O1 (рис. 9) и отличались шириной полосы спектра флуктуации интенсивности сигнала для каждого штамма.

При нанесении взвесей E. coli B и E. coli Са58, облученных красным НСИ, отмечалось незначительное увеличение скорости кровотока. Динамика кровотока восстановилась на 15 мин наблюдения в обоих случаях. Более значительное повышение скорости кровотока было вызвано аппликацией на брыжейку взвеси E. coli К12 после воздействия на нее красного НСИ. Установлено, что через 20 мин после нанесения бактериальной взвеси скорость кровотока стабилизировалась, оставаясь, однако, выше, чем в контроле.

Рис. 9. Динамика кровотока в микрососудах брыжейки белых крыс после нанесения взвесей клеток E. coli, сенсибилизированных метиленовым синим и облученных красным низкоинтенсивным светодиодным излучением

В отличие от этого, аппликация облученной взвеси E. coli О1 приводила к значительному (более, чем в 3 раза) и продолжительному (свыше 30 мин) замедлению по сравнению с контролем.

Затем исследовали в аналогичных условиях in vivo extempore действие супернатантов культур E. coli A5 и E. coli B6, продуцирующих экзо- и эндотоксин соответственно (Волкова, 2006), на микроциркуляцию крови в брыжейке белых крыс. Показано, что аппликация экзотоксинсодержащего супернатанта приводила к значительному ускорению микроциркуляции крови в капиллярах, отмечено достоверное динамическое увеличение ширины полосы спектра флуктуации интенсивности сигнала со среднего значения 75,97 Гц в контроле до среднего значения 135,87 Гц на 5 мин наблюдения (рис. 10а).

При нанесении эндотоксинсодержащего материала изменения скорости кровотока были менее выражены, наблюдались колебания значения ширины полосы спектра относительно контроля (рис. 10б).

Таким образом, проведенные исследования позволили оценить изменения численности популяций S. aureus 209P, а также численности популяций, морфологических и физиологических характеристик несенсибилизированных и сенсибилизированных метиленовым синим штаммов E. coli при действии in vitro излучений антропогенной природы - некогерентного светодиодного синего (467 нм) и красного (660 нм), дециметровых радиоволн СВЧ-диапазона с разной поляризацией и мощностью. Полученные результаты вносят вклад в понимание процессов адаптации микроорганизмов к действию физических экологических факторов.

Рис. 10. Динамика кровотока в микрососудах брыжейки белых крыс после нанесения экзотоксинсодержащего материала E. coli A5 (а) и эндотоксинсодержащего материала E. coli B5 (б)

Изучение влияния разных штаммов E. coli на скорость кровотока в микрососудах брыжейки белых крыс in vivo методом спекл-микроскопии позволило определить характер их взаимодействия с организмом хозяина, и обосновать возможность использования этого метода при скрининге микробиологических и фармацевтических биопрепаратов.

1. Показано достоверное увеличение численности популяции E. coli Ca58 при облучении несенсибилизированной взвеси бактериальных клеток светодиодным синим излучением (467 нм) в экспозициях 10 - 40 с.

2. Выявлены изменения численности популяции E. coli Ca58, уменьшение размеров клеток, стимуляция сахаролитической активности и повышение резистентности к большинству исследованных антибиотиков при действии на сенсибилизированную метиленовым синим бактериальную взвесь красного (660 нм) низкоинтенсивного светодиодного излучения в дозах 2394, 2736 и 4104 Дж/см2; отмечено достоверное снижение числа КОЕ E. coli Ca58 без изменения размеров клеток при действии этого излучения в диапазоне доз 34,2 - 478,8 Дж/см2.

3. Установлена зависимость изменений численности популяций E. coli Ca58 и S. aureus 209P от поляризации и мощности низкоинтенсивного дециметрового радиоизлучения; достоверных изменений морфологических показателей исследуемых штаммов не было выявлено.

4. Выявлены изменения микроциркуляции крови при аппликации микроорганизмов, подвергнутых фотодинамическому воздействию, на капилляры брыжейки белых крыс: ускорение кровотока отмечено при нанесении бактериальных клеток E. coli B, E.coli Ca58 и E. coli K12, а также токсинсодержащих материалов E. coli A5 и E. coli B6; замедление кровотока - при действии взвеси клеток E. coli O1.

1. Подшибякин, Д.В. Влияние некогерентного красного светодиодного излучения на рост сенсибилизированной метиленовым синим культуры Escherichia coli /Д.В. Подшибякин, Д.В. Рудик // Исследования молодых ученых и студентов в биологии: сборник научных трудов. - Саратов: Изд-во СГУ, 2005. - Вып. 3. - С.74 - 77.

2. Подшибякин, Д.В. Особенности роста и чувствительность к некоторым антибиотикам сенсибилизированной метиленовым синим культуры Escherichia coli при действии некогерентного красного светодиодного излучения / Д.В. Подшибякин, Д.В, Рудик, Е.И. Тихомирова, Д.Э. Попов // В сборнике тезисов докладов на IV съезде фотобиологов России. - Саратов, 2005. - С. 159 - 161.

3. Podshibyakin, D.V. The affect of low-coherent light on microbial colony forming ability and morphology of some gram-positive and gram-negative bacteria / D.Ed. Popov, E.S. Tuchina, Ju.A. Chernova, D.V. Podshibyakin, D.V. Rudik, M. Samsonova, I. Gromov, V. V. Tuchin // Proceedings of SPIE, «Optical Technologies in Biophysics and Medicine». - Washington, 2005. - V. 5771. - P. 353 - 356.

4. Подшибякин, Д.В. Влияние токсина Escherichia coli на микроциркуляцию крови в брыжейке белых крыс / Д.В. Подшибякин, С.С. Ульянов, О.В. Ульянова, Е.И. Тихомирова, М.А. Шибаева // Фундаментальные исследования. - 2007. - №12 -

С. 266 - 267.

5. *Подшибякин, Д.В. Оценка действия цитокинов in vivo на микроциркуляцию крови методом спекл-микроскопии / М.А. Шибаева, Е.И. Тихомирова, Д.В. Подшибякин, О.В. Ульянова, С.С. Ульянов // Российский иммунологический журнал. - 2008. - Т.2 (11), №2-3. - С. 138.

6. Подшибякин, Д.В. Использование метода спекл-микроскопии для оценки действия токсин продуцирующих штаммов кишечной палочки на микроциркуляцию крови / Д.В. Подшибякин, Е.И. Тихомирова, О.В. Ульянова, С.С. Ульянов, М.А. Шибаева // Известия Саратовского университета. Серия «Химия. Биология. Экология». - 2008. - Т.8., Вып. 2. - С. 73 - 76.

7. Podshibyakin D.V., The affect of Escherichia coli toxins on blood microcirculation in ventral mesentery of white rats / D.V. Podshibyakin, S.S. Ulyanov, O.V. Ulianova, E.I. Tikhomirova, M.A Shibaeva // European Journal of Natural History. - 2009. - № 2. - P. 62 - 65.

8. *Подшибякин, Д.В. Влияние низкоинтенсивного длинноволнового излучения видимого диапазона на рост и жизнеспособность сенсибилизированной метиленовым синим культуры Escherichia coli / Д.В. Подшибякин // Естественные и технические науки. - 2009. - №5. - С. 94 - 96.

9. Подшибякин, Д.В. Использование метода спекл-микроскопии для оценки влияния биопрепаратов на микроциркуляцию крови / О.В. Ульянова, С.С. Ульянов, Д.В. Подшибякин, М.А. Шибаева, Е.И. Тихомирова // Естественные и технические науки. - 2009. - №6. - С. 40 - 46.

Размещено на .ru