Отработка условий получения очищенного и концентрированного вируса бешенства штамм "CVS" и гликопротеина для использования их в качестве антигенов в иммуноферментной тест-системе. Анализ вируса бешенства антител в сыворотках крови привитых кошек и собак.
При низкой оригинальности работы "Иммуноферментная тест-система определения уровня антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак", Вы можете повысить уникальность этой работы до 80-100%
В соответствии с рекомендациями Комитета экспертов ВОЗ по бешенству содержание в сыворотках крови вакцинированных против бешенства животных вируснейтрализующих антител 0,5 МЕ/мл считается минимальным уровнем антирабических антител, соотносимого с возможностью защиты от бешенства (Manual of standards Diagnostic Tests and Vaccines,2004). На основании этого, комитет экспертов ВОЗ по бешенству рекомендует в качестве быстрого, пробный тест на основе непрямого иммуноферментного анализа для количественного определения в сыворотках крови вакцинированных животных антител к вирусу бешенства. Научная новизна результатов, полученных при выполнении работы, состоит в следующем: Впервые в РФ разработана иммуноферментная тест-система на основе непрямого ИФА с применением культурального фиксированного вируса бешенства штамм «CVS» и референс-препарата для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак. Отработаны условия очистки и концентрирования культурального фиксированного вируса бешенства штамм «CVS» и гликопротеина вируса бешенства, пригодных в качестве антигенов иммуноферментной тест-системы. Впервые в РФ разработан набор компонентов и иммуноферментная тест-система для определения уровня антирабических антител в сыворотках привитых против бешенства кошек и собак, внедрение которой в практику ветлабораторий позволит в короткие сроки провести исследования сывороток крови на наличие антирабических антител и оценить эффективность вакцинации кошек и собак.С использованием последовательного центрифугирования при 1 тыс.g и 50 тыс.g и гель-хроматографии на сефарозе 4В получен очищенный и концентрированный вирус бешенства штамм «CVS» 97,4% чистоты по белку, инфекционностью на 1,2 LGLD 50/см выше исходной и активностью в ИФА 1:800. Обработкой вируса бешенства штамм «CVS» 2% тритоном Х-100 получен гликопротеин вируса с сохранением антигенной активности, определяемой в ИФА в титре 1:600. Иммунизацией баранов и собак инактивированным b-пропиолактоном 1:4000 очищенным вирусом бешенства штамм «CVS» получены антирабические сыворотки с титром вируснейтрализующих антител, определенных в РН 1:16-1:64 и содержанием 4-24 МЕ/мл антител, пригодные в качестве контрольных положительных сывороток и референс-препаратов для иммуноферментной тест-системы.
Вывод
1. С использованием последовательного центрифугирования при 1 тыс.g и 50 тыс.g и гель-хроматографии на сефарозе 4В получен очищенный и концентрированный вирус бешенства штамм «CVS» 97,4% чистоты по белку, инфекционностью на 1,2 LGLD 50/см выше исходной и активностью в ИФА 1:800.
2. Обработкой вируса бешенства штамм «CVS» 2% тритоном Х-100 получен гликопротеин вируса с сохранением антигенной активности, определяемой в ИФА в титре 1:600.
3. При введении животным очищенный вирус бешенства и ГП вызывал образование в сыворотках вируснейтрализующих антител в титрах 1:8 -1:64 и содержанием антирабических антител 2-12 МЕ/мл.
4. Иммунизацией баранов и собак инактивированным b-пропиолактоном 1:4000 очищенным вирусом бешенства штамм «CVS» получены антирабические сыворотки с титром вируснейтрализующих антител, определенных в РН 1:16-1:64 и содержанием 4-24 МЕ/мл антител, пригодные в качестве контрольных положительных сывороток и референс-препаратов для иммуноферментной тест-системы.
5. Показано, что протеин А- пероксидазный коньюгат в рабочем разведении 1:4000 и концентрации по ПХ - 240 мкг/0,1мл может быть использован в иммуноферментной тест-системы для количественного определения антител к вирусу бешенства в сыворотках привитых кошек и собак.
6. Разработана иммуноферментная тест-система непрямого ИФА для количественного определения в сыворотках крови антитела к вирусу бешенства с чувствительностью 0,02-0,03 МЕ/мл антирабических антител. Установлено, что относительно РН, чувствительность и специфичность тест-системы непрямого ИФА с использованием в качестве антигена очищенного вируса была выше ( 91% и 94%), в сравнении с использованием гликопротеина вируса (88% и 86% соответственно).
7. Установлена пороговая величина ОП490 =0,620 о.е., по которой определен в сыворотках крови привитых кошек и собак уровень антирабических антител менее 0,5 МЕ/мл.
8. Установлена согласованность (K=0,67) результатов, полученных при определении уровня антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак в разработанной иммуноферментной тест-системе и РН в культуре клеток. Чувствительность разработанной тест-системы непрямого ИФА относительно РН составила 88%, специфичность 80%.
Список литературы
Клюкина В.И., Гринь С.А. Рахманин П.В., Востряков К.В. Современная эпизоотическая ситуация бешенства в республике Карелия. Материалы международной юбилейной научно-практической конференции посв. 110-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности России. Курск, 2006, - С 131-132
Клюкина В.И, Рахманин П.В.. Серологическое обнаружение антирабических антител. Материалы Международной научно-практической конференции к 100-летию рождения Я.С.Коваленко «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных 16-17 мая 2006 г. -Щелково-2007, - С 251.
Клюкина В.И, Гринь С.А., Рахманин П.В., Проничев А.Б. Получение и изучение иммунохимических свойств компонентов вируса бешенства.. Материалы Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», 20-21 декабря 2007 г. -Щелково-2007, - С 95-99.
Рахманин П.В.,.Клюкина В.И, Проничев А.Б., Востряков К.В. Определение антирабических антител в сыворотках крови вакцинированных животных. Материалы Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов»,20-21 декабря, 2007г,-Щелково-2007, - С 99-103.
Клюкина В.И, Востряков К.В., Рахманин П.В., Проничев А.Б. Ситуация по бешенству в Ненецком Автономном округе. Материалы Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», 20-21 декабря 2007 г.
Рахманин П.В., Клюкина В.И, Проничев А.Б. Иммуноферментная тест-система определения уровня иммунитета у вакцинированных против бешенства кошек и собак. Ветеринария и кормление.№ 3, 2008, -С 45-46
Размещено на .ru
Вы можете ЗАГРУЗИТЬ и ПОВЫСИТЬ уникальность своей работы
