Биологическая характеристика клинических штаммов Enterobacter spp. в свете новых представлений о генетических основах патогенности микроорганизмов. Механизм действия термолабильного энтеротоксина бактерий рода Enterobacter на иммунную систему хозяина.
При низкой оригинальности работы "Иммунобиологические свойства термолабильного энтеротоксина бактерий рода Enterobacter в системе взаимодействия "патоген–хозяин"", Вы можете повысить уникальность этой работы до 80-100%
В развитии инфекционного процесса, ассоциируемого с УПЭ, безусловно, основополагающую роль играют токсины возбудителя, среди которых особый интерес представляет термолабильный (LT) энтеротоксин бактерий рода Enterobacter. Известно, что LT-энтеротоксины УПЭ имеют сходный механизм токсического эффекта на желудочно-кишечный тракт как человека, так и животных, к разряду основных клинических проявлений которого относят диарейный симптомокомплекс на фоне выраженной интоксикации организма (A.L. Вместе с тем, комплексный анализ иммунобиологических характеристик в системе «патоген-хозяин» LT-энтеротоксина Enterobacter spp. не проводился. Современное понимание особенностей иммунной реакции при инфекционных заболеваниях, вызванных энтеротоксигенными УПЭ, в частности, бактериями рода Enterobacter, невозможно без оценки функциональной активности Т-и В-лимфоцитов, так как направление дифференцировки Т-клеток в Т-хелпер - 1 (Th1)/ Т-супрессор - 1 (Тс1) или Т-хелпер - 2 (Th2)/ Т-супрессор - 2 (Tc2) тип, переключение В-клеток на продукцию классов иммуноглобулинов определяет характер и течение заболевания (А.С. Из коллекции культур Enterobacter spp. были выделены новые 3 штамма, обладающие комплексом факторов патогенности, в частности, продуцирующие термолабильный энтеротоксин: Enterobacter gergoviae ГИСК №259 (патент РФ №2161197 от 18.11.1999), Enterobacter cloacae ГИСК №258 (патент РФ №2164942 от 13.03.2000), Enterobacter agglomerans ГИСК №257 (патент РФ №2162485 от 13.03.2000).
Список литературы
По теме диссертации опубликованы 45 печатных работ.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 227 страницах, иллюстрирована 31 таблицами и 28 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, заключения и выводов. Список литературы включает 95 отечественных и 320 иностранных источников.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Клинический материал бактерий рода Enterobacter получали из бактериологических лабораторий Республиканской клинической больницы им. Куватова Г.Г., Городской клинической больницы №21, Детской Республиканской клинической больницы и Больницы скорой медицинской помощи №22 г. Уфы в период с 1998 по 2008 г.г.
В качестве эталонных штаммов использовали E.gergoviae ГИСК №259 (Патент РФ №2161197 от 18.11.1999), E.cloacae ГИСК №258 (Патент РФ №2164942 от 13.03.2000) и E.agglomerans ГИСК №257 (патент РФ №2162485 от 13.03.2000). В настоящее время Enterobacter agglomerans (Pantoea agglomerans) выделен в новый род Pantoea.
Эксперименты выполнены на 1130 беспородных белых мышах-самцах, 14 кроликах, 36 белых мышах - сосунках. Животные содержались в условиях вивария БГМУ с естественным световым режимом на стандартной диете лабораторных животных (ГОСТ Р50258-92) с соблюдением Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997), а также правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ З 51000.3-96 и 51000.4-96). Животные (мыши и кролики) получены из питомника лабораторных животных уфимского филиала «Иммунопрепарат» ФГУП «НПО «Микроген» МЗ и СР РФ и из питомника БГМУ.
В соответствии с целью диссертационной работы экспериментальная часть выполнялась в 3 этапа.
На первом этапе оценивались фенотипические признаки патогенности клинических штаммов Enterobacter spp. in vitro.
Объектом изучения служили 218 клинических штаммов бактерий рода Enterobacter, выделенных из проб клинического материала, полученного от больных с желудочно-кишечными, урологическими, гнойно-воспалительными заболеваниями - 132 штамма и здоровых лиц - 86 штаммов.
Биохимическую идентификацию культур осуществляли с использованием тест-систем «Enterotest» фирмы «Lachema» (Чехия) и компьютерной биохимической тест-системы типа API фирмы «BIOMERUIOX».
Изучение бактериальных колоний и особенностей клеточной структуры бактерий рода Enterobacter проводили с помощью оптического («Биолам», Россия) и электронного («JEM-100B», Япония) микроскопов.
Адгезивную активность изучали в реакции гемагглютинации с эритроцитами птиц (З.Г. Габидуллин и др., 1987) и I (0) группы АВО человека (В.И. Брилис и др., 1986). Продукцию ?-гемолизина, тиолзависимого и энтерогемолизина определяли по рекомендациям Г.З. Габидуллина (1978), J. Albesa et al. (1985) и L. Beutin et al. (1988) соответственно. Определение лецитиназной активности проводили на желточном агаре Ю.Н. Чистовича (1961), антилизоцимную активность (АЛА) определяли по методу О.В. Бухарина и др. (1984), антиинтерфероновую активность (АИА) - по методу Ю.В. Соколова (1990), антикомплементарную активность (АКА) - по методу О.В. Бухарина (2000), ДНК-азную активность по C.D. Jeffries et al. (1957). Патогенность и вирулентность штаммов Enterobacter spp. оценивалась in vivo с определением протистоцидной активности на простейших - Paramecium caudatum (Х.Л. Галикеев, 1987), по способности вызывать гибель белых мышей (М.К.Войно-Ясенецкая, 1957), токсигенности бактериальных культур Enterobacter spp. на моделях лигированной петли тонкого кишечника кролика, на мышах-сосунках (R. Gianella et al., 1976) и в плантарном тесте (Ю.Н. Вартанян и др., 1978).
На втором этапе изучали генотипические признаки патогенности бактерий. Для этого выделяли бактериальную ДНК лизоцимом («Serva» США) с добавлением протеиназы, плазмидную ДНК по методу C.T. Kado, S.T. Liu (1981), проводили избирательную амплификацию участков ДНК «островков патогенности» методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для амплификации использовали специфические праймеры, подобранные на определенные участки генов для E.coli и ответственные за разные этапы взаимодействия патогена с клеткой хозяина (А.Р. Мавзютов, 2001; E.F. Boyd, 1998).
На третьем этапе изучали патогенетические механизмы термолабильного энтеротоксина бактерий рода Enterobacter в системе взаимодействия «патоген-хозяин» in vivo.
Модель острой энтеробактерной экспериментальной инфекции воспроизводили в 3 экспериментальных группах: - экспериментальная 1: осуществляли внутрибрюшинным введением бульонной культуры E.cloacae, содержащей LT-энтеротоксин в дозе LD50 -5 •1010КОЕ/мл.
- экспериментальная 2: осуществляли внутрибрюшинным введением бульонной культуры изогенной пары E.cloacae в дозе LD50-5 •106 КОЕ/мл.
- экспериментальная 3: осуществляли внутрибрюшинным введением супернатанта бульонной культуры E.cloacae в дозе LD50-5 •108 КОЕ/мл.
При введении дозы LD50 развивался инфекционный процесс, сопровождающийся выраженными изменениями активности животных, массы и состояния шерстяного покрова.
Оценку всех тестируемых параметров проводили на 1-е, 3-и, 5-е и15-е сутки.
Перитонеальные макрофаги (ПМ) мышей получали после внутрибрюшинного введения 2 мл пептонного бульона.
Селезенку после извлечения и взвешивания разрезали ножницами на несколько частей, размельчали в стеклянном гемогенизаторе Поттера и путем 2-3 тракций выдавливали клеточную массу в охлажденную среду 199.
Мононуклеарные клетки периферической крови выделяли на двойном градиенте плотности стерильных растворов фиколл - верографина. Плотность верхнего слоя градиента составляла 1,075-1,077, а нижнего - 1,093-1,095 (L.Wong, 1975).
На третьем этапе проводили: 1)оценку способности ПМ поглощать частицы полистирольного латекса (И.С.Фрейдлин и др., 1976); 2)изучение антигенпрезентирующей и процессинговой функции перитонеальных макрофагов (В.Г. Галактонов, Т.В.Анфалова, 1974); 3)НСТ - тест (А.Н.Маянский, М.Е.Виксман, 1979); 4)изучение уровня суммарного свечения лизосом в цитоплазме ПМ (И.С.Фрейдлин, 1984); 5)определение числа антителообразующих клеток (N.K. Jerne, 1963); 6)определение интерлейкинов макрофагов и нейтрофилов воспалительного перитонеального экссудата методом ПЦР; ДНК-гибридизации с праймерами и ДНК-зондом, подобранным по M.Takano (1998); 7)исследование апоптоза клеток воспалительного перитонеального экссудата в проточном цитофлюориметре (FL3, >600 нм) по структурным изменениям ядерной ДНК клеток, окрашенных йодистым пропидием (С.В. Сибиряк и др., 2008).
Методы статистической обработки
Для анализа данных использовали методы описательной статистики и дисперсионного анализа. При сравнении 2-х групп применяли парный критерий Стьюдента для независимых выборок; для множественных сравнений-критерий Стьюдента с поправкой Бонферрони, тест Ньюмена - Кейлса и метод Крускала - Уоллиса. При сравнении результатов опытов с альтернативной формой реакции использовался точный критерий Фишера для четырехпольных таблиц. Для сравнения категориальных переменных проводился анализ таблиц сопряженности с использованием критерия ?2.
Для оценки степени (доли) влияния фактора проводился одно- и двухфакторный дисперсионный анализ, где были рассчитаны коэффициенты (?2) и уровень их статистической значимости. Отличия считали статистически значимыми при р<0,05 (И.П. Ашмарин, 1962; О.Ю. Реброва, 2002; В.М. Зайцев и др., 2006).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Исследование проб клинического материала, полученного от больных с инфекционными процессами различной локализации, показали, что наиболее часто Enterobacter spp. обнаруживаются при желудочно-кишечных инфекциях - 49 шт. (39%) (рис.1).
Рис.1. Распределение штаммов Enterobacter spp. по источникам выделения (%)
По видовому составу из 218 клинических штаммов Enterobacter spp. 63 шт. (28,9%) относились к E.cloacae, 59 шт. (27,1%) - E.aerogenes, 52 (23,9%) - E.gergoviae, 39 шт. (17,8%) - E.sakazakii и 5 шт. (2,3%) - E. agglomerans.
Среди бактерий рода Enterobacter подавляющее большинство культур (86,2%) составляли прототрофы, а 13,8% - ауксотрофы. При сравнительном анализе частоты встречаемости прототрофов в зависимости от источника выделения было установлено, что в испражнениях больных с желудочно-кишечной патологией прототрофы обнаруживаются в 87,7% случаев против 91,3% контроля (?2=0,62; р=0,365), в моче больных урологическими инфекциями в 81,9% против 91,3% контроля (?2=0,08, р=0,78) и в раневом отделяемом больных с гнойно-воспалительными процессами - в 82,1% случаев против 83,3% контроля (?2 =0,001; р=0,996)
Полученные результаты свидетельствуют о высокой экологической пластичности указанных бактерий, что позволяет адаптироваться им в различных полостях организма хозяина.
Электронно-микроскопические исследования показали, что колонии Enterobacter spp. способны к клеточной специализации и многоклеточной организации. У бактерий хорошо заметны различия между вегетативными клетками, образующими центр колонии и имеющими размеры длиной 1,97±0,12 мкм и шириной 0,72±0,18 мкм, и локализованными на периферии колонии высокоподвижными длинными клетками - «швермерами» (бродягами), имеющими избыточное количество жгутиков, среднее число которых колеблется от 7 до 60.
Электронограмма отпечатков колоний Enterobacter spp. убедительно показала наличие между клетками контактов двух типов: плотное слипание клеток между собой и контакты “конец в конец”.
По данным M.E.Bayer (1975), через липидные слои мембран проходят соприкасающиеся белковые структуры, часто называемые “Байеровскими зонами” (рис.2б). В результате соединения двух таких белковых структур образуется непрерывный водный канал, связывающий цитозоли двух взаимодействующих клеток. Это своего рода аналог примитивной “циркуляторной системы”, доставляющей питательные субстраты и убирающей продукты метаболизма (J.W. Costerton et al., 1995).
В колониях бактерий имеются перемычки, внутриплазматические мостики, поры и каналы (рис.2в), а также более специализированные структуры (“газовые баллоны”), окруженные своеобразной “мембраной” и содержащие внеклеточные гемопротеины. Предположительно, такие структуры способствуют транспорту О2 к клеткам в колониях (агрегатах) и являются аналогами дыхательной системы органов (В.И. Дуда и др., 1995).
В настоящее время сформировалась тенденция рассматривать межклеточные коммуникации у микроорганизмов с позиций кворума клеток в системе (О.В. Бухарин и др., 2005; К.Р. Allen et al., 2006; S. Towsend et al., 2006). Существующие сложные системы межклеточных контактов, способствуют распространению сигнальных молекул в популяции, особенно если речь идет о недиффундирующих в среде факторах “коммуникации” (J.K. Crane et al., 1999). Вероятно, в эффектах кворума принимают участие все три канала коммуникации (химический, механический, опосредованный физическими полями), но наиболее изучена химическая сигнальная система, в которой внеклеточная концентрация ауторегуляторов отражает плотность микробных популяций. Например, показана способность штаммов E.sakazakii синтезировать сигнальные молекулы «чувства кворума» (quorum sensing), регулирующие экспрессию факторов патогенности. К ним относят молекулы N-гексаноил-L-гомосеринлактонов двух типов, выявленные методом тонкослойной хроматографии (A. Lehner et al., 2005; G.T. Gunduz, G. Tuncel, 2006).
Наличие определенных структур на внешней поверхности бактериальной клетки определяет их адгезивность к чувствительным клеткам хозяина, и обеспечивает быструю колонизацию самых разнообразных поверхностей, в том числе мембран клеток. Их фенотипическая экспрессия строго коррелирует с образованием пилей разных типов и обусловливает РГА (D.C. Old et al., 1983; 1984; Mange Jean-Philippe et al., 2006).
Анализ результатов показал, что из 218 клинических штаммов Enterobacter spp., 141 (64,7%) являются маннозочувствительными и 77 (35,3%) - маннозорезистентными.
При сравнительном анализе маннозорезистентных и маннозочувствительных клинических штаммов Enterobacter spp. в зависимости от источника выделения чаще обнаруживались маннозочувствительные штаммы Enterobacter spp. при гнойно-воспалительных процессах (87,2% против 29,2% в контроле; ?2=19,53; р=0,001).
В следующей серии опытов мы провели оценку адгезивной активности средний показатель адгезивности (СПА) штаммов Enterobacter spp. в реакции гемагглютинации с формалинизированными эритроцитами I (0) группы крови системы АВО.
Результаты исследования показали, что из 218 клинических штаммов Enterobacter spp. 132 (60,6%) обладали адгезивной активностью.
У штаммов Enterobacter spp., выделенных от больных с желудочно-кишечной патологией, адгезивные свойства встречались чаще и были выражены сильнее (рис.3).
Рис.3. Распределение показателей адгезивности клинических штаммов Enterobacter spp., выделенных у больных с патологией желудочно-кишечного тракта и в контрольной группе (%)
Результаты дисперсионного анализа показали, что коэффициент влияния экологического фактора на адгезивные свойства бактерий рода Enterobacter spp., выделенных при патологии желудочно-кишечного тракта, составил ?2=14,9% (F=22,9; р<0,01). Этому способствует наличие развитого аппарата адгезии, обеспечивающего способность бактерий выдерживать воздействие перистальтической волны или тока мочи (T.G. Theander et al., 1998).
Наименьшей экологической зависимостью обладали культуры Enterobacter spp., изолированные при урологической патологии (?2=9,1%; F=9,3; р<0,05), а у штаммов Enterobacter spp., выделенных при гнойно-воспалительных процессах, коэффициент влияния экологического фактора составил 14% (F=14,7; р<0,05).
Способность к адгезии, зависящей от условий экониш, позволяет расценивать адгезивность, как существенный детерминант, необходимый возбудителю для быстрого размножения и колонизации. Способность к адгезии обеспечивает выживаемость бактерий на разных этапах инфекционного процесса, особенно в начальной его фазе (T.G.Theander et al., 1998).
Изучение ультраструктуры внешней поверхности бактериальной клетки высокоадгезивных штаммов Enterobacter spp. показало наличие ресничек длиной 297,8±152,8 нм и шириной 4,91±0,53 нм.
Таким образом, адгезия бактерий рода Enterobacter spp. обусловлена наличием фимбриальных структур, с помощью которых происходит специфическое взаимодействие микроба с определенными рецепторами клеток хозяина.
В целях самосохранения бактериальные клетки обладают защитными механизмами дистанционного действия, которые благоприятствуют их выживанию. В этом отношении были изучены фенотипические признаки способности инактивировать лизоцим, лейкоцитарный интерферон и комплемент.
Фенотипический признак инактивации лизоцима был обнаружен у 87 (40%) клинических штаммов Enterobacter spp.
Штаммы АЛА были преимущественно представлены изолятами от больных с патологией желудочно-кишечного тракта - 33 (67,4%) против 3 (8,1%) контроля (?2=12,33; р=0,001).
При этом результат дисперсионного анализа показал, что коэффициент влияния экологического фактора на АЛА штаммов Enterobacter spp., выделенных при патологии желудочно-кишечного тракта, был слабым и составил ?2=0,6% (F=3,5; р>0,05), а для штаммов Enterobacter spp., изолированных при гнойно-воспалительных процессах и урологических заболеваниях, был ?2=24,6% (F=43,1; р<0,001) и ?2=4,4% (F=7,5; р<0,05) соответственно. Таким образом, существенное влияние на АЛА Enterobacter spp, изолированных при гнойно-воспалительных процессах, оказывает экологический фактор.
Наибольшую способность инактивировать интерферон проявляли штаммы Enterobacter spp., выделенные от больных с желудочно-кишечной патологией - 22 (44,6%), против 3 (8,1%) контроля (?2=6,79; р=0,009) и с гнойно-воспалительными процессами 22 (56,4%) против 4 (16,7%) (?2=3,4; р=0,065). При этом в большей зависимости от экологических условий по указанному признаку находились штаммы Enterobacter spp., изолированные при гнойно-воспалительных процессах (?2=13,5%; F=15,3; р<0,001), а в меньшей - штаммы Enterobacter spp., выделенные при желудочно-кишечных заболеваниях (?2=5,2%; F=12,8; р<0,05).
АКА была определена у 65 (29,8%) культур Enterobacter spp. Распространенность и экспрессия АКА варьировали. Наибольшей активностью обладали штаммы Enterobacter spp, выделенные при желудочно-кишечных заболеваниях - 38 ( 77,6%), против 5 (13,5%) контроля (?2=11,48; р=0,001). Значения признака распределились следующим образом: штаммы Enterobacter spp. с высокой активностью составили 15 (30,6%) против 0 контроля, со средней активностью ? 16 (32,7%) против 0 контроля, с низкой активностью - 7 (14,3%) против 5 (13,5%) контролей (?2=0,05; р=0,82), не активные - 11 (22,4%) против 32 (86,5%) контролей (?2=10,1; р=0,001).
При этом коэффициент влияния экологического фактора на АКА культур Enterobacter spp., выделенных при патологии желудочно-кишечного тракта, составил ?2 =20% (F=33; р<0,001).
Колонизация эпителиальных поверхностей бактериальными клетками параллельно сопровождается секрецией гемолизинов. Среди них наиболее известны ?-гемолизин, тиолзависимый гемолизин и энтерогемолизин.
В зависимости от источника выделения штаммов Enterobacter spp. частота встречаемости ?-гемолитической активности была различной и колебалась в широких пределах. Штаммы Enterobacter spp. с ?-гемолитической активностью наиболее часто выделялись от больных с желудочно-кишечной патологией и составили 12 (24,5%) при 4 (10,8%) в контроле (р>0,11).
По степени активности преобладали штаммы с высокой активностью - 6 (12,3%) при 0 контроля. В контрольной группе обнаруживались штаммы Enterobacter spp. с низкой активностью - 4 (10,8%) и неактивные штаммы - 33 (89,2%) (рис.4).
Рис.4. Показатели ?-гемолитической активности штаммов Enterobacter spp., выделенных от больных с желудочно-кишечной патологией и в контрольной группе (%): 1 - отсутствует, 2 - низкая активность, 3 - средняя активность и 4 - высокая активность
Среди штаммов Enterobacter spp., продуцирующих тиолзависимый гемолизин, преобладали культуры, изолированные при патологии желудочно-кишечного тракта, и составили 30 (61,3%) против 4 (10,8%) контроля (?2=9,24; р=0,002). При этом штаммов с высокой активностью было 7 (14,3%), со средней - 11 (22,5%) и с низкой - 12 (25,5%), неактивные составили 19 (38,8%) против 37 (100%) контроля.
Аналогичные результаты были получены и при исследовании энтерогемолитической активности Enterobacter spp. Результаты согласуются с данными I. Beutin et al. (1988).
Проведенный сравнительный анализ гемолитической активности Enterobacter spp. выявил их своеобразие, по всей видимости, отражающее результат приспособления бактериальных популяций к специфическим условиям среды экониш.
Итоги дисперсионного анализа показали, что коэффициент влияния экологического фактора на тиолзависимую активность Enterobacter spp. был выше, чем на ?- и тиолзависимую гемолитическую активности. Данные влияния экологического фактора на тиолзависимую активность Enterobacter spp. представлены в табл. 1.
Таблица 1. Сила экологического влияния на тиолзависимую гемолитическую активность штаммов Enterobacter spp
Нозология Сила влияния фактора, ?2 (%) F р
Желудочно-кишечные заболевания 16,5 35,5 р<0,001
Урологические заболевания 5,1 8,1 р<0,001
Гнойно-воспалительные процессы 11,4 13,8 р<0,001
Изучение лецитиназной и ДНК-азной активностей Enterobacter spp. показали, что 59 (27,1%) и 22 (10,1%) штаммов, соответственно, обладают указанными свойствами.
Наиболее высокими значениями ДНК-азной активности характеризовались штаммы Enterobacter spp., изолированные от больных с желудочно-кишечной патологией. При этом высокая активность отмечалась у 13 (26,5%) штаммов против 0 контроля, средняя - у 10 (20,4%) против 1 (2,7%) контроля (р=0,0171), низкая - у 7 (14,3%) против 3 (8,1%) контроля (р=0,377) и неактивными были ? 19 (38,8%) против 33 (89,2%) (?2=4,63; р<0,001). Полученные результаты согласуются с данными Н.А. Поликарпова и др. (1990).
Результаты дисперсионного анализа показали, что коэффициент влияния экологического фактора на ДНК-азную активность штаммов Enterobacter spp., выделенных от больных с патологией желудочно-кишечного тракта, составил ?2=11,8% (F=19,5; р0,05).
В зависимости от источника выделения, лецитиназная активность была выше среди культур Enterobacter spp., выделенных от больных с гнойно-воспалительными процессами. При этом культуры с высокой активностью составили 4 (10,3%) против 0 контроля, средней активностью - 3 (7,7%) против 0 контроля, низкой активностью - 2 (5,1%) против 0 контроля, неактивные - 30 (76,9%) против 24 (100%) контроля (р=0,013).
Изучение силы экологического влияния на лецитиназную активность Enterobacter spp. показало, что более подверженными экологической детерминации оказались штаммы Enterobacter spp., выделенные при патологии желудочно-кишечного тракта (?2=22%, F=24,8; р<0,001). Это, возможно, отражает результат приспособления бактериальных популяций к специфическим условиям среды эндоэкониш.
Способность бактерий продуцировать токсин тесным образом связана с патогенетической значимостью возбудителя при развитии ряда инфекционных заболеваний. В литературе имеются сообщения об энтеротоксигенной способности Enterobacter spp. (И.Х. Мамоткулов и др., 1997), при этом исследования, направленные на выявление способности Enterobacter spp. вырабатывать токсины, немногочисленны и противоречивы (М.М. Баркус и др., 1986). Рутинным подходом к определению токсигенности и вирулентности служат биологические пробы, которые, однако, имеют ряд недостатков, связанных с необходимостью использования лабораторных животных, трудоемкостью, но, вместе с тем, достаточно полно отражают этиологическую значимость предполагаемого возбудителя. В связи с этим было проведено тестирование клинических штаммов Enterobacter spp. с использованием модели “плантарного теста” (Ю.Н. Вартанян и др., 1978), “интраназального инфицирования” беспородных белых мышей (М.К. Войно-Ясенецкая, 1957) и определение протистоцидной активности на токсигенность и вирулентность (Х.Л. Галикеев, 1987).
В результате постановки теста «отек лап» у мышей лишь 17 (7,8%) исследованных культур Enterobacter spp. давали положительный результат. Наибольшей активностью в этом тесте характеризовались 9 (18,4%) культур, выделенных от больных с желудочно-кишечными инфекциями. Показатели у культур Enterobacter spp., выделенных при урологических заболеваниях, были сопоставимы с результатами культур, изолированных при гнойно-воспалительных процессах, соответственно 4 (9,1%) и 4 (10,3%) (?2=1,607; р=0,446). Ни один из штаммов Enterobacter spp., изолированных от здоровых людей, не вызывал появления визуально определяемой отечности лап.
Полученные результаты свидетельствуют о способности клинических штаммов Enterobacter spp. синтезировать термолабильное токсическое вещество, обусловливающее развитие “отека лапки” у белых мышей, что совпадает с вирулентностью, поэтому плантарный тест может быть использован в качестве биологической модели для выявления энтеротоксигенности бактерий рода Enterobacter.
Среди клинических штаммов Enterobacter spp., давших «отек лапки», центрифугат 3 штаммов оказался способным давать отек лапки мышей с разницей к интактной лапке до 80 мг. На основании полученных результатов 3 штамма Enterobacter spp. были депонированы в ФГУН ГНИИСК им. Л.А.Тарасевича, как продуценты LT-энтеротоксина (патент РФ №2161197 от 18.11.1999, патент РФ №2164942 от 13.03.2000, патент РФ №2162485 от 13.03.2000).
В следующей серии опытов для подтверждения способности клинических штаммов Enterobacter spp. продуцировать LT-энтеротоксин мы использовали метод «лигированная петля тонкого кишечника кролика» (R. Gianella et al., 1997). Результат опыта определялся по способности центрифугата 20-часовых бульонных культур Enterobacter spp. при введении в просвет тонкого кишечника кролика вызывать накопление экссудата, с последующим измерением отношения V/L (объема экссудата к длине лигированного участка). За положительную реакцию принимали показатель V/L=1,0-1,2.
Было выявлено 20 (9,2,6%) культур Enterobacter spp., вызывающих накопление экссудата в просвете тонкого кишечника кролика. При этом наибольшей активностью обладали штаммы Enterobacter spp., выделенные от больных с желудочно-кишечной патологией - 9 (18,4%). Так, у 1 (8,2%) штамма Enterobacter spp. против 0 в контроле V/L = 1,1-1,3, у 5 (10,2%) штаммов против 0 контроля V/L = 1,2, у 3 (6,1%) штаммов против 0 в контроле V/L = 1,0 и неактивные ? 37 (75,5%) штаммов против 37 (100%) в контроле.
Среди штаммов Enterobacter spp., выделенных при гнойных процессах, преобладали штаммы с V/L = 1,2. Так, 1 (2,7%) штамм против 0 контроля обладал V/L = 1,1-1,3; 3 (7,7%) штамма против 0 в контроле ?V/L = 1,2; 2 (5,1%) штамма против 0 контроля ?V/L = 1,0 и неактивные 33 (84,6%) штамма против 24 (100%) в контроле (р=0,151).
Штаммы Enterobacter spp., изолированные при патологии мочевыделительной системы, обладали наименьшей активностью. Так, 3 (6,8%) штамма против 0 контроля вызывали V/L = 1,2; 2 (4,6%) штамма против 0 контроля вызывали V/L = 1,0 и неактивными были 39 (88,6%) штаммов против 25 (100%) в контроле (р=0,074). Как показали результаты, ни один из штаммов, выделенных у лиц из группы контроля, указанным свойством не обладал.
Сила влияния экологического фактора на показатели V/L была низкой и не имела статистически значимых различий.
На легочной модели 54 (24,8%) клинических штамма Enterobacter spp. вызывали гибель экспериментальных мышей.
Патогенный потенциал был наиболее выражен среди культур, выделенных при патологии желудочно-кишечного тракта, поскольку больший процент указанных культур - 4 (8,2%) вызывал гибель животных в ранние сроки и 15 (30,8%) штаммов обусловливали летальную инфекцию. Среди культур Enterobacter spp., выделенных при заболеваниях мочевыделительной системы, 2 (4,6%) штамма вызывали раннюю гибель животных и 11 (25%) - летальную инфекцию. Штаммы Enterobacter spp., изолированные от больных с гнойно-воспалительными процессами, раннюю гибель животных обусловливали в 3-х (7,7%) случаях, а летальную инфекцию - в 4-х (10,2%). При этом показатели гибели в ранние сроки и летальной инфекции относительно штаммов Enterobacter spp., выделенных при патологии желудочно-кишечного тракта, не имели статистически значимых различий и составили соответственно ?2=0,544; р=0,762 и ?2=5,318; р=0,070.
При определении силы влияния экологического фактора на показатели интраназального теста обнаружено, что штаммы Enterobacter spp., выделенные от больных с желудочно-кишечными заболеваниями и гнойно-воспалительными процессами, находились в одинаковой зависимости от условий обитания, где сила влияния экологического фактора составила соответственно 8,6% (F=16,8; р<0,001) и 8,6% (F=13,5; р<0,001).
Проведенные нами исследования на различных биологических моделях экспериментальной инфекции показали, что интраназальное заражение и плантарный тест требуют значительного количества экспериментальных животных, поэтому не всегда выполнимы в условиях бактериологической лаборатории.
Метод, предложенный для выявления степени патогенности дизентерийных палочек на модели P.caudatum, вполне применим и для выявления патогенности УПЭ. Это связанно с тем, что P.caudatum относятся к эукариотическим клеткам, и могут быть чувствительны к действию токсических субстанций бактерий.
На модели P.caudatum был выявлен 61 (27,9%) клинический штамм Enterobacter spp., вызывающий гибель простейших.
Наибольшей активностью в этом тесте характеризовались штаммы Enterobacter spp., выделенные при патологии желудочно-кишечного тракта. Так, 1 (2,1%) штамм Enterobacter spp. против 0 контроля вызывал гибель P.caudatum в течение 0,5-14 мин, 6 (12,3%) штаммов против 0 контроля - в течение 1,5-3,4 мин, 16 (32,7%) штаммов против 3 (8,1%) в контроле - в течение 3,5-5,5 с (?2=3,80; р=0,008), неактивными были 24 (52,9%) против 34 (91,9%) штамма контролей (р<0,001). Среди штаммов Enterobacter spp., выделенных от больных с патологией мочевыделительной системы, в течение 0,5-1,4 мин угнетали жизнедеятельность P.caudatum 4 (9,1%) штамма против 0 контроля, в течение 1,5-3,4 мин - 3 (6,8%) штамма против 0 контроля, в течение 3,5-5,5 мин - 7 (15,9%) штаммов против 6 (24%) контроля (?2=0,256; р=0,613), неактивными были 30 (68,2%) штамма против 19 (76%) в контроле (?2=0,17; р=0,680). Штаммы Enterobacter spp., изолированные от больных с гнойно-воспалительными процессами, характеризовались следующими значениями: 3 (7,7%) штамма против 0 контроля инактивировали P. caudatum в течение 0,5-1,4 мин, 4 (10,3%) штамма против 0 контроля - в течение 1,5-3,4 мин, 8 (20,5%) штаммов против 3 (12,5%) в контроле в течение 3,5-5,5 мин (р=0,193), неактивными были 24 (61,5%) штамма против 34 (87,5%) в контроле (р=0,003).
Гибель P.caudatum в ранние сроки вызывали культуры Enterobacter spp., одновременно показавшие высокую патогенность при интраназальном инфицировании мышей, а также продуцировавшие термолабильные токсические вещества, выявляемые в тесте «отек лап» на мышах.
Итоги дисперсионного анализа показали, что экологический фактор оказывал крайне слабое влияние на протистоцидный тест. Так, коэффициент влияния экологического фактора на протистоцидный тест штаммов Enterobacter spp., изолированных от больных с желудочно-кишечными заболеваниями, составил ?2=0,2% (F=0,8; р<0,05), выделенных при урологических заболеваниях, - ?2=0,8% (F=1,2; р<0,05), изолированных при гнойно-воспалительных процессах, - ?2=2,9% (F=4,1; р<0,05).
Результаты исследований дают основание заключить, что время, в течение которого происходит гибель инфузорий, зависит от биологических свойств клинических штаммов Enterobacter spp., в частности, от их способности продуцировать токсические вещества, наличие которых у бактерий сочетается с их способностью вызывать гибель интраназально зараженных мышей. Протистоцидный тест на P.caudatum может быть рекомендован для выявления потенциально патогенных клинических штаммов Enterobacter spp.
Таким образом, изолируемые при инфекционных процессах различной локализации штаммы Enterobacter spp. характеризуются свойствами, определяющими их потенциальную способность выживать в условиях внутренней среды макроорганизма благодаря возможности противостоять факторам врожденного иммунитета.
Известно, что фенотипические проявления экспрессируемого фактора патогенности заложены в геноме бактериальной клетки. При этом гены, определяющие патогенность, могут входить в состав как хромосомы, так и плазмиды, а также могут быть фланкированы в состав IS-последовательностей и транспозонов.
В связи с этим перспективным является исследование плазмидного профиля ДНК для генотипической характеристики клинических штаммов бактерий рода Enterobacter. Наличие в бактериальной клетке плазмидной ДНК дает микроорганизму широкие адаптационные возможности в различных экологических нишах. Планируя проведение соответствующих опытов, мы основывались на том, что плазмиды различаются на: кодирующие устойчивость к лекарственным препаратам - R-плазмиды; отвечающие за фертильность бактериальной клетки - F-плазмиды, а также плазмиды бактериоциногении и патогенности. Вирулентные свойства энтеробактерий, чаще всего, контролируются плазмидой патогенности. В частности, F-, R-плазмиды и плазмиды бактериоциногении могут включать tox -транспозоны, кодирующие токсинообразование. Нередко tox -плазмиды кодируют синтез интактных протоксинов, активируемых клеточными протеазами, образование которых контролируют гены бактериальных хромосом (В.М. Бондаренко и др., 2001; А.Р. Мавзютов, 2002).
Анализ полученных данных позволил отобрать 132 клинических штаммов Enterobacter spp., обладающих Д-маннозочувствительной и Д-маннозорезистентной гемагглютинирующей активностью. Из 132 культур энтеробактеров 45 штаммов несли плазмиды, что составило 34,1%. При сравнительном анализе частоты встречаемости плазмидонесущих штаммов было установлено, что в 19 (42,2%) случаях относительно контроля плазмидонесущие штаммы были выделены от больных с желудочно-кишечной патологией (?2=4,95; р=0,03), в 16 (35,6%) - урологической патологией (?2=3,46;р=0,06), в 7 (15,6%) - гнойно-воспалительными процессами (?2=0,10; р=0,75) и 3 (6,6%) - от здоровых людей.
Молекулярные массы плазмид значительно различались. Так, электрофоретически было установлено, что бактерии рода Enterobacter, вне зависимости от источника выделения, могут нести плазмиды с массами 120; 60; 38; 3,2; 1,4 МД и другие. При изучении плазмидного профиля штаммов с высокой адгезивностью было установлено, что они вообще не имели внехромосомной ДНК.
В следующей серии опытов у штаммов с адгезивной активностью провели элиминирование плазмид в бульоне Хоттингера, содержащем 5% додецилсульфата натрия. Тестирование изогенных пар на их способность давать MS- и MR-реакции гемагглютинации с эритроцитами цыпленка показало, что штаммы в одинаковой степени агглютинируют эритроциты. Результаты исследований дают основание полагать, что генетической детерминантой, контролирующей MS и MR реакцию гемагглютинации с эритроцитами цыпленка у Enterobacter spp., являются структурные элементы хромосомной природы.
Известно, что продукция LT-энтеротоксина у E.coli детерминируется Ent плазмидами с мол.м. 55 - 61 МД (P.K. Lee et al.,1991; F.Qadri et al., 2005). В то же время энтеротоксин Vibrio cholerae является иммунологически родственным LT-энтеротоксину E.coli и C.freundii, контролируется структурными элементами хромосомной природы (M.I. Lesseva et al., 1995).
Из 17 культур энтеробактеров, продуцирующих LT-энтеротоксин, 13 штаммов оказались плазмидонесущими. В 8 случаях плазмидонесущие штаммы были выделены от больных с желудочно - кишечной патологией, в 2 с урологической патологией, в 3 - гнойно-воспалительными процессами. Среди штаммов Enterobacter spp., выделенных от здоровых людей, LT-энтеротоксин продуцирующих штаммов не оказалось.
В связи с этим было проведено электрофоретическое исследование штаммов Enterobacter spp., продуцирующих LT-энтеротоксин, на предмет обнаружения внехромосомных факторов наследственности. Для этого были выделены 2 группы штаммов: первую группу составили штаммы Enterobacter spp., суперпродуценты LT-энтеротоксина, способные вызывать “отек лап” мышей с разницей между контрольной лапкой 95 мг и более, вторую - культуры, не продуцирующие LT-энтеротоксин и дающие в опытах “отек лапки” разницу не более 35 мг. Все изученные 12 штаммов первой группы являлись носителями плазмиды мол.м. 60 МД. Среди 3 штаммов второй группы 2 культуры были бесплазмидными и 1 штамм нес плазмиды с мол.м.120; 38; 3,2 МД.
Элиминирование плазмид у штаммов, продуцирующих LT-энтеротоксин, показало, что бесплазмидные изогенные пары токсигенных штаммов не вызывали гибель P.caudatum.
Из 10 отобранных клонов каждого штамма Enterobacter spp., утративших свойство продуцировать LT-энтеротоксин, у двух на фореграмме просматривалась плазмида мол.м. 60 МД, остальные клоны оказались не несущими данной плазмиды и в биологических пробах не обладали активностью.
Опыты по фенотипическому определению гемолитической активности Enterobacter spp. указывают на то, что гемолизины являются одним из ведущих факторов патогенности клинических штаммов Enterobacter spp. В связи с этим было проведено электрофоретическое исследование гемолитически активных штаммов Enterobacter spp. для обнаружения природы детерминант.
Из 35 культур Enterobacter spp., способных гемолизировать эритроциты, 21 (60%) несли плазмиду мол.м. 120 МД. В 8 случаях плазмидонесущие штаммы были выделены от больных с желудочно-кишечной патологией, в 5 - урологической патологией, в 6 - гнойно-воспалительными процессами и в 2 - здоровых людей. Различия в частоте обнаружения указанных плазмид относительно контроля носили статистически не значимый характер (р>0,05).
Полученные результаты, таким образом, говорили в пользу плазмидной природы детерминирования гемолитической активности штаммов Enterobacter spp. Существование бесплазмидных вариантов гемолитических энтеробактеров не исключало этого предположения, так как при этом на результатах могло сказаться небольшое число копий этих плазмид, которые не обнаруживались исследуемым методом.
Для проверки этой рабочей гипотезы путем обработки акридиновым оранжевым были получены 2 генетически родственные изогенные пары штаммов Enterobacter spp., различающихся по наличию плазмиды с молекулярной массой 120 МД. При этом клоны 2 штаммов не продуцировали а?гемолизин, а клоны 2 штаммов - продолжали его продуцировать.
Эти данные, по нашему мнению, свидетельствуют в пользу хромосомной природы детерминирования указанного признака. Установление этого факта представляется существенным и, по нашему мнению, заслуживает самостоятельного изучения.
Проведенные нами опыты по изучению профиля плазмидной ДНК, элиминации и конъюгативной передачи плазмид не привели к выявлению новых плазмид, контролирующих синтез энтерогемолизина, ДНК-азную, лецитиназную, антилизоцимную и антиинтерфероновую активности клинических штаммов Enterobacter spp.
Следует отметить, что сила влияния экологического фактора во всех исследованиях была низкой и варьировала от 1 до 2,5 % (р>0,05).
Таким образом, результаты изучения плазмидного профиля дают основание полагать, что генетической детерминантой адгезивной активности бактерий рода Enterobacter, возможно, являются структурные элементы хромосомной природы, продукции LT-энтеротоксина ? плазмида мол.м. 60 МД, а?гемолизина - 120 МД.
Наличие у ряда клинических штаммов Enterobacter spp. генетических детерминант, контролирующих факторы патогенности, свидетельствует о том, что среди культур Enterobacter spp. встречаются штаммы, которые следует рассматривать не как условно-патогенные, а как конкретные патовары бактерий рода Enterobacter.
Учитывая, что штаммы легко могут теря
Вы можете ЗАГРУЗИТЬ и ПОВЫСИТЬ уникальность своей работы
