Иммунобиологические свойства хламидий, разработка и усовершенствование средств лабораторной диагностики и специфической профилактики хламидиозов сельскохозяйственных животных - Автореферат
Изучение клинико-эпизоотологических проявлений различных форм хламидиозов крупного рогатого скота, свиней и лошадей в хозяйствах региона Среднего Поволжья и Предуралья. Разработка технологии производства полиштаммовых вакцин, их испытание и внедрение.
При низкой оригинальности работы "Иммунобиологические свойства хламидий, разработка и усовершенствование средств лабораторной диагностики и специфической профилактики хламидиозов сельскохозяйственных животных", Вы можете повысить уникальность этой работы до 80-100%
В настоящее время проблема по созданию высокоэффективных биопрепаратов против хламидиозов крупного рогатого скота, свиней и лошадей приобретают особую актуальность. При этом предусматривалось решить следующие задачи:-изучить клинико-эпизоотологические проявления различных форм хламидиозов крупного рогатого скота, свиней и лошадей в хозяйствах региона Среднего Поволжья и Предуралья; Впервые выделены ранее неизвестные инфекционные агенты, являющиеся возбудителями болезней крупного рогатого скота, свиней и лошадей в хозяйствах региона Среднего Поволжья и Предуралья, которые по своим иммунобиологическим характеристикам (морфо-тинкториальным свойствам, патогенность для лабораторных животных, токсичность, групповая антигенная специфичность), а некоторые из них по фрагментам ДНК, выявленным специфическими праймерами (ПЦР), идентифицированы как представители рода Chlamydia (Chlamydophila). Усовершенствована технология изготовления и применения инактивированной эмульсионной вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота, позволяющей повысить иммуногенную активность вакцины путем установления оптимальной концентрации хламидийного антигена и дозу вакцины, обеспечивающей формирование напряженного противохламидийного иммунитета у животных в период беременности и в первые дни жизни молодняка (патент на изобретение № 2092188 с приоритетом от 29.10.1991г.). "Вакцина против хламидиозов крупного рогатого скота" была отмечена серебряной медалью № 8092; "Вакцина полиштаммовая против хламидиоза крупного рогатого скота" представленная на ВВЦ в (1994г.) была удостоена медали "ЛАУРЕАТ ВВЦ" № 2357; "Вакцина против хламидиоза свиней"(1999г.) удостоена медали "ЛАУРЕАТ ВВЦ" №1983.В результате было установлено, что при исследовании в РСК сывороток крови на хламидиоз, в диагностических титрах реагировали крупный рогатый скот - от 4 до 18%, свиньи - от 1 до 6% и овцы - от 2,0 до 20%. Этиологическая роль хламидий в патологии крупного рогатого скота, свиней и овец в регионе была подтверждена выделением возбудителя из патологического материала: в среднем у крупного рогатого скота от 3 до 37% случаев, у свиней от 1 до 35 и у овец до 25% случаев из числа исследованных животных. Эксперименты по изучению спектра патогенности изучаемых штаммов хламидий по отношению к морским свинкам, также показали неодинаковую их чувствительность при разных способах введения: интраназальном и внутрибрюшинном заражении - лишь штамм "СК-89" оказался патогенным для морских свинок (установлена гибель 40-50 % животных): интраназальном способе введения штаммы хламидий "УП-89" и "КС-98" вызывали гибель 50-80% животных. У животных, зараженных штаммами хламидий "МЗ-89", при заболевании доминировали признаки менингоэнцефалита, ?СК-89?-конъюнктивита, "УП-89"-полиартрита, у супоросных свиноматок, зараженных штаммом "РС-85"-наблюдали аборты, рождение нежизнеспособных поросят, а штаммом ?ЛС-87?-пневмонию и рождение мертвых поросят. Антигены штаммов хламидий, выделенные от крупного рогатого скота "МЗ-89", "УП-89", "СК-89" и свиней "ЛС-87", "ПСС-89" и "РС-85", реагировали между собой на один или два порядка ниже, чем с гомологичными штаммами, что указывает на возможное существование различных серотипов штаммов хламидий, поражающих крупный рогатый скот и свиней.Серопозитивность к антигену возбудителя хламидиоза выявлена у крупного рогатого скота от 29 до 75%, свиней от 14 до 28%, лошадей от 18 до 31%. Сравнительным изучением биологических свойств 7 штаммов возбудителей хламидиозов с.-х. животных, выявлены различия по токсичности, патогенности для белых мышей и морских свинок при различных способах заражения и по характеру проявления экспериментальной инфекции на естественных хозяевах. Усовершенствована технология изготовления и способ применения моновакцины против хламидиоза крупного рогатого скота: внедрен способ очистки хламидийного антигена от балластных веществ КЭ, позволяющий повышать иммуногенную активность вакцины, установлено оптимальное количество специфического хламидийного антигена в составе вакцины, изыскан способ и кратность ее инъекции, индуцирующий формирование напряженного противохламидийного иммунитета в течение 12 месяцев. Впервые разработана новая полиштаммовая инактивированная эмульсионная вакцина против хламидиоза крупного рогатого скота сконструированная на основе штаммов "250", "МЗ-89", "СК-89", обладающая широким спектром набора антигенов, иммуногенной активностью и обеспечивающая эффективную защиту вакцинированных животных от различных форм клинико-анатомического его проявления. Испытание полиштаммовой инактивированной эмульсионной вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота с целью защиты овцематок показало, что она также способна формировать напряженный иммунитет у мелкого рогатого скота против возбудителя хламидиозного аборта.
Вывод
1. Выделение и идентификация хламидий из патологического материала при различных клинических формах проявления заболеваний крупного рогатого скота, свиней и лошадей в хозяйствах региона Среднего Поволжья и Предуралья
Изучение и анализ эпизоотической ситуации по хламидиозу с.-х. животных проводили в хозяйствах Ульяновской, Кировской, Пермской областей; республик Чувашия, Башкортостан, Удмуртия, Татарстан, Марий-Эл. В результате было установлено, что при исследовании в РСК сывороток крови на хламидиоз, в диагностических титрах реагировали крупный рогатый скот - от 4 до 18%, свиньи - от 1 до 6% и овцы - от 2,0 до 20%.
Этиологическая роль хламидий в патологии крупного рогатого скота, свиней и овец в регионе была подтверждена выделением возбудителя из патологического материала: в среднем у крупного рогатого скота от 3 до 37% случаев, у свиней от 1 до 35 и у овец до 25% случаев из числа исследованных животных.
В ряде хозяйств Республики Татарстан ежегодно регистрировался высокий процент заболеваемости и падежа среди телят. Лабораторными исследованиями были исключены общеизвестные бактериальные и вирусные инфекции. Серопозитивность к возбудителю хламидиоза у телят в этих хозяйствах, где наблюдались заболевания, проявляющиеся полиартритами, конъюнктивитами, энцефаломиелитами и пневмоэнтеритами, колебалась в пределах 50-52% в титре 3,8±0,6 лог2. Из патологического материала от павших и вынуждено убитых телят в 65% случаев наличие хламидий было подтверждено микроскопически и в РИФ, а в 42% проб были выделены патогенные изоляты хламидий, условно названные "УП-89", "СК-89", "МЗ-89", и идентифицированы в последующем как представители рода Chlamydia (Chlamydophila).
Изучение этиологии различных клинических форм патологии свиней проводили в хозяйствах республики Татарстан, Марий-Эл, Башкортостана и Ульяновской области. Клинико-эпизоотологически было обследовано три крупных свиноводческих комплекса ("Сосновоборский", "Звениговский", "Рощинский"), где регистрировались аборты, мертворождения и респираторно-кишечные заболевания невыясненной этиологии у 3,2-10% животных. При этом имели место бронхопневмонии, полиартриты, конъюнктивиты и гибель животных разных половозрастных групп от 10 до 14%. У хряков производителей заболевание чаще всего протекало бессимптомно.
При серологическом исследовании в РДСК с хламидиозным антигеном 604 пробы сыворотки крови, полученные из 24 хозяйств, у 29% взрослых свиней выявили специфические хламидийные антитела в титрах 1:5-1:40. Эти показатели у свиноматок составили 28%, у хряков-производителей - 21% и у поросят- 14%. В большинстве случаев хламидиоз свиней подтверждали выделением возбудителя от абортированных плодов и пораженного участка легочной ткани вынуждено убитых и павших поросят. В результате комплексного изучения этиологии респираторно-кишечных заболеваний свиней в хозяйствах Среднего Поволжья и Предуралья нами выделены и идентифицированы патогенные штаммы хламидий: "РС-85", "ЛС-87"и "ПСС-89".
Заболевание лошадей неизвестной этиологии изучали в трех хозяйствах Пермской области и республики Татарстан, которое клинически проявлялось в виде спорадических абортов, рождением мертвых и нежизнеспособных жеребят у 11-35% кобыл, а у 7 - 23% народившегося молодняка с признаками полиартрита и бронхопневмонии.
При серологическом исследовании 26 проб сывороток крови, полученных от жеребцов-производителей и кобыл с неблагополучным потомством, в РСК с хламидиозным антигеном положительно реагировали 8 (30%) исследованных проб и составил 1:8,1±0,12 Лог2. Исследование этих сывороток крови в РНГА в 23 (88,5%) пробах были выявлены специфические хламидийные антитела со средним титром 1:320±0,5 Лог2. При заражении КЭ взвесями патологических и клинических материалов удавалось выделять инфекционные биологические агенты из спермы 3-х жеребцов-производителей, а также паренхиматозных органов (легкие, печень) и суставной жидкости павшего жеребенка, которые по морфологическим признакам оказались сходными с хламидиями. На основании морфологических признаков, тинкториальных особенностей и некоторых биологических свойств, выделенный из суставной жидкости скакательного сустава жеребенка изолят, условно названный "КС-98", нами был идентифицирован как представитель рода Chlamydia (Chlamydophila).
Таким образом, по результатам лабораторных исследований у лошадей конезавода Пермской области и в двух других неблагополучных хозяйствах была установлена хламидиозная инфекция, сопровождаемая энзоотически протекающими абортами, мертворождаемостью и рождением нежизнеспособного приплода. У жеребят заболевание проявлялось в виде полиартритов, пневмоний, конъюнктивита и гибелью, у жеребцов-производителей - поражением половых органов и контаминацией спермы хламидиями.
2. Биологические свойства и молекулярно-генетический анализ штаммов хламидий, изолированных от крупного рогатого скота, свиней и лошадей
Из лабораторных животных наиболее чувствительными к выделенным штаммам хламидий оказались белые мыши и морские свинки. С их помощью устанавливали вирулентность, антигенные и иммуногенные свойства хламидий.
При этом степень вирулентности хламидий к белым мышам зависела от вида животного, у которого они выделены, и способах их заражения. Мыши были наиболее чувствительны к штаммам, выделенным от крупного рогатого скота, свиней и лошадей. Более эффективными оказались (в порядке убывания) внутривенный (в/в), интрацеребральный (и/ц), интраназальный (и\н), внутрибрюшинный (в/б) и подкожный (п/к) способы инъекции инфекционного материала. Так, процент гибели белых мышей от различных штаммов при в/в инъекции варьировал от 80 до 100, при и/ц - 25-98, и/н- 50-80, в/б - 10-93, п/к -от 5 до 40.
Эксперименты по изучению спектра патогенности изучаемых штаммов хламидий по отношению к морским свинкам, также показали неодинаковую их чувствительность при разных способах введения: интраназальном и внутрибрюшинном заражении - лишь штамм "СК-89" оказался патогенным для морских свинок (установлена гибель 40-50 % животных): интраназальном способе введения штаммы хламидий "УП-89" и "КС-98" вызывали гибель 50-80% животных. Некоторые штаммы хламидий ("Г-88","МЗ-89","РС-85","ЛС-87") при внутрибрюшинном способе заражении не вызывали гибель морских свинок.
Существенные различия в течении заболевания наблюдали при внутривенном заражении телят и свиноматок соответственно штаммами "МЗ-89", "СК-89","УП-89"и "РС-85","ЛС-87". У животных, зараженных штаммами хламидий "МЗ-89", при заболевании доминировали признаки менингоэнцефалита, ?СК-89??конъюнктивита, "УП-89"- полиартрита, у супоросных свиноматок, зараженных штаммом "РС-85"? наблюдали аборты, рождение нежизнеспособных поросят, а штаммом ?ЛС-87?? пневмонию и рождение мертвых поросят.
Таким образом, при изучении биологических свойств штаммов "РС-85" и "ЛС-87" были установлены различия в патогенности и вирулентности по отношению к экспериментальным и естественным хозяевам. Результаты экспериментальных исследований обобщены в таблице 1.
Таблица 1
Спектр патогенности новых штаммов хламидий
Штаммы С.-х. животное, клиника Способ заражения Патогенность
Сравнительное изучение антигенной активности выделенных нами штаммов хламидий в перекрестном исследовании в РСК с использованием гипериммунных сывороток морских свинок, полученных от возбудителей хламидиозов крупного и мелкого рогатого скота, свиней и птиц, с группоспецифическим антигеном из этих же штаммов, выявило их антигенное родство с эталонными представителями рода Chlamydia (Chlamydophila).
При этом отмечали не высокую активность орнитозного антигена (шт. Лори) и титр комплементсвязывающих антител в гипериммунных сыворотках был на 2-3 порядка ниже, чем при исследовании с антигенами изготовленными из других штаммов хламидий.
Кроме этого, обнаружена более выраженная антигенная активность у штамма хламидий "МЗ-89" выделенного при менингоэнцефалите крупного рогатого скота.
Антигены штаммов хламидий, выделенные от крупного рогатого скота "МЗ-89", "УП-89", "СК-89" и свиней "ЛС-87", "ПСС-89" и "РС-85", реагировали между собой на один или два порядка ниже, чем с гомологичными штаммами, что указывает на возможное существование различных серотипов штаммов хламидий, поражающих крупный рогатый скот и свиней. Обобщенные данные исследований представлены в таблице 2.
Таблица 2
Характеристика антигенных свойств изучаемых и известных штаммов хламидий выделенных от крупного рогатого скота и свиней
В опытах по изучению иммуногенности штаммов хламидий установили (таблица 3), что двукратная внутрибрюшинная иммунизация мышей суспензиями хламидий штаммов "МЗ-89", ?250?,"УП-89" и "СК-89" предохраняет их: от гибели при экспериментальном заражении этими штаммами на 90-98%.
Таблица 3
Характеристика иммуногенных свойств изучаемых и известных штаммов хламидий выделенных от крупного рогатого скота и свиней
Штамм используемый для иммунизации Процент выживаемости после контрольного заражения штаммами, М±м, %
При заражении их штаммами хламидий "250" и "МЗ-89" защита мышей, иммунизированных штаммом "СК-89", составляла лишь 60-68%. Аналогичные иммуногенные свойства выявляли у штаммов хламидий, выделенных при хламидиозном аборте ("РС-85", "ПСС-89") и пневмонии свиней ("ЛС-87"). Устойчивость мышей к заражению штаммами хламидий "РС-85", "ПСС-89" и "ЛС-87" составляла 92-93%, а при перекрестном заражении их защита между штаммами, вызывающие аборты "РС-85", "ПСС-89" и "ЛС-87" была значительно ниже и колебалась в пределах 60-68% (табл.3).
Таким образом, в опытах по изучению иммуногенных свойств изучаемых штаммов установили, что изготовленные на их основе препараты обеспечивают у привитых животных формирование разного по напряженности иммунитета. Эти данные свидетельствуют о неоднородности антигенной структуры изучаемых штаммов хламидий крупного рогатого скота и свиней.
В последующем, выше перечисленные штаммы хламидий были отобраны для дальнейшего использования при разработке набора для серологической диагностики хламидиоза с.-х. животных в РНГА и вакцин, предназначенных для специфической профилактики хламидиоза рогатого скота и свиней.
Современные достижения молекулярной биологии открыли перспективы в решении проблем диагностики, основанной на прямой идентификации первичной субстанции, т.е. нуклеиновых кислот. Наибольшее внимание среди этих методов привлекает ПЦР, позволяющий выявлять и дифференцировать геномы возбудителей хламидиоза (Обухов И.Л.,1997; Авзалов Ф.З.,1997; Р.Р.Вафин, 2003; Everett K.D.,1999; Hartley J.C., 2001).
В нашей работе результатом ПЦР со специфичными праймерами к Chlamydia psittaci CPF и CPR проб ДНК штаммов хламидий "СК-89", "МЗ-89" "ЛС-87", "РС-85" явилась амплификация специфичного фрагмента ДНК хламидий длиной 264 пар нуклеотидов. В результате установлена их генетическая однородность. Следовательно, из изученных нами хламидий штаммы "СК-89", "МЗ-89" "ЛС-87", "РС-85" выделенные, соответственно от крупного рогатого скота, свиней и лошадей, обладали наиболее выраженной патогенностью для лабораторных и естественно восприимчивых животных, а также антигенной и иммунногенной активностью.
3. Усовершенствование методики получения эритроцитарного хламидийного антигена для серологической диагностики хламидиозов в РНГА
Одной из задач наших исследований была разработка серологической диагностики хламидиозов с.-х. животных с помощью метода реакции непрямой гемагглютинации (РНГА). С этой целью нами была предложена методика получения эритроцитарного антигена для РНГА с использованием группоспецифического корпускулярного хламидийного антигена.
Для изготовления эритроцитарного хламидийного антигена был отобран наиболее активный для данного метода штамм хламидий "СК-89" обеспечивающий стабильный результат при постановке РНГА с эритроцитарным антигеном.
Антигены, изготовленные из этого штамма, проявляли стабильность результата, выявляя наибольший титр специфической хламидийной сыворотки при отсутствии агглютинации с негативной сывороткой и разбавителем. Результаты этих опытов представлены в таблице 4.
Таблица 4
Сравнительная оценка в РНГА специфичности и чувствительности эритроцитарных антигенов изготовленных из штаммов хламидий, выделенных от крупного рогатого скота и свиней.
№ серии опыта Штамм хлам. Сыв?ки полож .и отриц Активность сывороток в РСК Титры сыв. в РНГА с эритр. хлам. антигеном Контр. с разбавит
1. "250" S 1:160 1:640 полож.
N 0 1:10
"МЗ?89" S 1:160 1:5120 полож.
N 0 1:5120
"СК?89" S 1:160 1:640 полож.
N 0 1:5
"РС?85" S 1:160 1:160 полож.
N 0 1:10
"ЛС?88" S 1:160 1:160 полож.
N 0 1:5
Контр. S 1:160 0 отриц.
N 0 0
2. "250" S 1:320 1:640 полож.
N 0 1:80
"МЗ?89" S 1:320 1:1280 полож.
N 0 1:5120
"СК?89" S 1:320 1:1280 полож.
N 0 1:5
"РС?85" S 1:320 1:320 полож.
N 0 1:10
"ЛС?88" S 1:160 1:160 полож.
N 0 1:5
Контр. S 1:160 0 отриц.
N 0 0
3. "250" S 1:160 1:320 отриц.
N 0 0
"МЗ?89" S 1:160 1:320 отриц.
N 0 1:10
"СК?89" S 1:160 1:640 отриц.
N 0 0
"РС?85" S 1:160 1:320 отриц.
N 0 1:5
"ЛС?88" N 1:160 1:320 отриц.
S 0 0
Контр. S 1:160 1:320 отриц.
N 0 0
Контроль специфических свойств и активность экспериментальных серий эритроцитарного хламидийного антигена проводили в сравнении с РСК путем титрования гомологичных и гетерологичных иммунных сывороток крови против хламидийного антигена. Наряду с этим были использованы "полевые" сыворотки крови различных видов животных: свиней, рогатого скота и лошадей из неблагополучных по хламидиозу хозяйств. Исследования показали высокую чувствительность и групповую специфичность диагностикума для РНГА. Положительная реакция была получена со всеми гомологичными сыворотками крови: контрольной хламидийной сывороткой крупного рогатого скота, стандартной орнитозной сывороткой и с сывороткой иммунизированной против хламидиоза овец. Отрицательная реакция наблюдалась с отрицательной контрольной сывороткой, бруцеллезной и сывороткой, позитивной к вирусу ринотрахеита. При исследовании полевых сывороток различных видов животных хламидийные антитела выявлялись в титрах 1:5 - 1:320. При сравнении результатов РСК и РНГА наблюдалась корреляция полученных данных.
На основе эритроцитарного хламидийного антигена был создан "Набор препаратов для диагностики хламидиозов животных в РНГА".
Производственные испытания этого набора были проведены в 1999-2001 годы в республиканских и областных ветеринарных лабораториях республики Татарстан, Мари-Эл и Пермской области. Было исследовано более 3925 проб сыворотки крови от крупного рогатого скота, свиней и лошадей, полученных из хозяйств, в которых проявлялись клинические симптомы, характерные для хламидиозной инфекции животных. В результате исследований получено 225 положительных результата, что составило 5,6% от общего числа исследованных проб. Результаты обобщены в таблице 5.
Таблица 5
Результаты испытаний опытных серий "Набор препаратов для диагностики хламидиоза животных в РНГА"
№ п.п. С.-х. животные Города Всего Реагировало в РНГА
колво %
1 к.р.с. Казань 2801 84 3
2 свиньи 473 5 1,0
3 овцы 102 5 5
4 лошади Пермь 453 46 10
5 свиньи Йошкар-Ола 75 75 100
6 к.р.с. 19 8 42
Итого 3925 225 5,6
Проведенные испытания 44 наборов для РНГА, показали, что предлагаемый метод прост, удобен позволяет проводить массовые серологические исследования поголовья с.-х. животных на хламидиоз.
4. Разработка и испытание эффективности инактивированной вакцины против хламидиозов крупного рогатого скота
Следующей задачей наших исследований явилась разработка вакцинных препаратов, предназначенных, в первую очередь, для специфической профилактики абортов хламидиозной этиологии у крупного рогатого скота и предупреждения заражения быков-производителей, являющихся основными потенциальными источниками распространения возбудителя инфекции (Курбанов И.А., Авзалов Ф.З. др.,1982; Щербань Г.П.,1986; Хамадеев Р.Х.,1991; Караваев Ю.Д., 2006).
На первоначальном этапе разработки противохламидиозных вакцин для рогатого скота, в экспериментальных опытах выявились преимущества и перспективность эмульгированной вакцины по сравнению с другими формами вакцинных препаратов. При испытании эффективности экспериментальной эмульсионной вакцины против хламидиозного аборта коров в межлабораторном комиссионном опыте на нетелях нами было установлено, что разработанная вакцина является стерильной, безвредной, антигенно активной и иммунногенной. Подкожное введение препарата крупному рогатому скоту в дозе 3 мл защищала его от развития экспериментальной хламидийной инфекции.
В дальнейшем в условиях Херсонской биофабрики с использованием штамма хламидий "250" (И.А. Курбанов, 1971) согласно НТД (утв. ГУВ МСХ СССР от 8 февраля 1990 г.) было изготовлено более 32 тыс. доз опытно-промышленных серий и использованы для производственных испытаний в неблагополучных по хламидиозу регионах РФ.
5. Производственное испытание опытно-промышленных серий вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота и усовершенствование технологии изготовления и способа ее применения
Производственное испытание опытно-промышленных серий вакцины в условиях производства проводили в девяти хозяйствах Татарстана и Владимирской области. Всего было привито 6862 голов крупного рогатого скота, в том числе 3715 коров, 79 быков-производителей и 3068 телят, телок случного возраста. Поствакцинальный и колостральный иммунитет у привитых коров, нетелей и колостральный иммунитет телят изучали в динамике по накоплению специфических комплементсвязывающих антител в крови у вакцинированных животных. Через один месяц после вакцинации была выявлена положительная реакция к хламидийному антигену у 97-100% вакцинированных животных со средним титром антител 1:65-1:87, что соответствовало максимальному уровню накопления специфических антител. Через шесть месяцев положительно реагировали в РСК на хламидийный антиген от 90 до 93,6% вакцинированных животных со средним арифметическим титром 1:12-1:14. В последующие сроки исследования (через 9 и 12 месяцев) установлено постепенное снижение числа положительно реагирующих животных до 41,9-60%. При этом средние арифметические титры специфических антител были в пределах 1:7-1:10, что примерно соответствовало фоновому уровню титров антител в неблагополучных по хламидиозу хозяйствах (1:6-1:1:7).
Следовательно, серологическими исследованиями было установлено, что наиболее высокий уровень специфических противохламидийных антител формируется у животных к месячному сроку после однократной подкожной вакцинации инактивированной эмульсионной вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота. Эти показатели уровня антител сохраняются в течение последующих 6 месяцев, а затем происходит постепенное снижение специфических антител в крови. При исследовании в РСК сывороток крови телят, родившихся от вакцинированных коров и нетелей, была установлена положительная реакция с хламидиозным антигеном в титрах 1:5-1:80 у 63,3% телят в возрасте до 1 месяца, у 40%-возрасте до 2-х месяцев и у 23,3% животных в возрасте до 3-х месяцев. Полученные данные свидетельствуют о передаче телятам колостральных антител вакцинированными животными.
Результаты испытаний показали, что "Вакцина против хламидиоза крупного рогатого скота инактивированная эмульсионная", изготовленная на основе возбудителя хламидиозного аборта крупного рогатого скота "250", проявляет неодинаковую эффективность при различных клинических формах (полиартрите, конъюнктивите, менингоэнцефалите и др.) течения хламидийных инфекций крупного рогатого скота. О существовании различий в индицировании защиты от кишечной и плацентарной формы хламидиоза у овец и наличии неоднородности антигенной структуры хламидий, выделяемых у крупного рогатого скота и свиней сообщали В.А.Бортничук, (1991), F.W.A.Johnson, (1984), J. A. Perez- Martinez и Storz J., (1985). Поэтому в решении задачи по созданию вакцины против хламидиозов крупного рогатого скота с широким антигенным набором, способной индуцировать у них иммунный ответ при различных формах хламидиоза, подбор оптимального антигенного состава активных штаммов для нас являлся приоритетным. Однако, испытания вакцины на начальном этапе показали, что в отдельных неблагополучных по хламидиозу хозяйствах инъекция вакцины вызывает у некоторых животных повышенную чувствительность, которая характеризуется постепенным увеличением гранулемы на месте инъекции вакцины до размеров 6?8 см в течение 2-3 месяцев. Количество животных, проявивших такую реакцию на введение вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота, составило по отдельным хозяйствам от 2 до 10% привитого поголовья и появление ее, по-видимому, объясняется аллергической реакцией замедленного типа у некоторых животных - хламидионосителей, так как серопозитивность поголовья крупного рогатого скота к возбудителю хламидиоза в этих хозяйствах составляла от 10,2 до 47%. Результаты наших наблюдений подтверждаются данными некоторых авторов (RIDGWAYG.L., et.al. 1997) указывающих, что у животных как при естественном переболевании хламидиозом, так и после вакцинации проявляется гиперчувствительность замедленного типа к введению хламидийного антигена. Другой причиной аллергической реакции является содержание в составе вакцины неспецифических компонентов куриного эмбриона. Уменьшение реактогенных свойств вакцины были достигнуты путем введения, в технологический цикл предложенного нами метода по очистки биомассы хламидий от компонента вакцины от неспецифических антигенов, а также подбором оптимальной дозы и способа ее введения. Это позволило оптимизировать концентрацию хламидийного антигена в составе вакцины и дозу иммунизации, соответственно, 8-10 мг/мл и 1-2 мл.
Выше перечисленные изменения в технологии изготовления и применения вакцины нашли свое отражение в НТД, утвержденные ГУВ МСХ СССР от 13 ноября 1991 года.
6. Разработка и изучение эффективности применения полиштаммовой вакцины против хламидиоза крупного и мелкого рогатого скота на лабораторных животных, телятах и овцах
На первоначальном этапе моделирования полиштаммовой вакцины, на белых мышах были сравнительно испытаны шесть вариантов эмульсионной вакцины. Результаты этих опытов приведены в таблице 6.
Таблица 6
Препарат изготовлен из штаммов хламидий После заражения штаммом "250" (М±м %) погибло выжило
В опытах было установлено, что полиштаммовая вакцина, изготовленная на основе штаммов "250", "МЗ-89", "СК-89", при подкожном введении белым мышам имеет оптимальный спектр антигенности и обеспечивает выживаемость их 85±1% случаев после контрольного заражения вирулентной культурой хламидий, при гибели 75±10% интактных мышей.
В дальнейших исследованиях по разработке полиштаммовой вакцины были подобраны компоненты и отработаны технологические приемы получения более жидких эмульсионных вакцин на основе синтетических масел и ланолина.
При подкожном введении белым мышам полиштаммовой вакцины у этих животных формировался напряженный иммунитет, обеспечивающий выживаемость их 76±2% случаев после контрольного заражения вирулентными культурами хламидий, при выживаемости 22±2,4% интактных. Результаты исследований приведены в таблице 7.
В опытах по изучению антигенной и иммунногенной активности вакцины на лабораторных животных было установлено, что биопрепарат при подкожном введении индуцирует в сыворотке крови морских свинок формирование КС-антител в титрах 1:10-1:640, гемагглютинирующих (ГА) -1:80-1:1280 и защищает в среднем 76% вакцинированных белых мышей от экспериментального заражения, при 77% случаев гибели в контрольной группе.
Таблица 7
Номера серии вакцины Штамм, использованный для заражения Наименование групп животных Колво животных в группе Выживаемость белых мышей после контрольного заражения (в %)
Оценка эффективности применения полиштаммовой вакцины на телятах в комиссионном опыте показала, что разработанная полиштаммовая вакцина стерильна, безвредна, иммунногенно активна. Внутримышечное введение препарата телятам в дозе 1 мл защищает их от развития различных клинических форм (менингоэнцефалита, полиартрита, конъюнктивита) экспериментальной хламидиозной инфекции.
Принимая во внимание литературные источники о близком родстве антигенов плацентарных штаммов мелкого и крупного рогатого скота (Johnson F.W., 1984; Storz J. et al., 1964), нами в опытах на суягных овцах была проведена оценка эффективности применения полиштаммовой вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота для специфической профилактики хламидиозного аборта овец.
С этой целью в КП им.Тимирязева Балтасинского района РТ перед осеменением было иммунизировано внутримышечным способом 1500 овцематок в дозе 1,0 мл3.
Для определения антигенной активности вакцины у подопытных овец вакцинированных в дозах 0,5 и 1,0 мл через 80 дней после иммунизации средний титр КС-антител в сыворотке крови составил 1:10 и 1:33 соответственно.
Через 3 месяца после вакцинации 10 овец, в их числе 6 голов вакцинированных (опытные) и 4 не вакцинированные (контрольные), были завезены в виварий института и заражены в условиях лаборатории вирулентной культурой возбудителем хламидиозного аборта овец (штаммом "Ростиново-70").
Животных разделили на 3 группы: первая (№№ 1-3) вакцинирована в дозе 0,5 см3, вторая (№№ 4-6) - в дозе 1,0 мл. Не вакцинированные 4 овцематки (№№7-10) были контрольными.
По результатам исхода беременности вакцинированных (опытных) и невакцинированных (контрольных) овец судили об эффективности вакцины.
В первой опытной группе у одной овцы, родился слабый ягненок, у других овец родились клинически здоровые и жизнеспособные ягнята. В контрольной группе регистрировали аборты и мертворождения.
Таким образом, было установлено, что однократная внутримышечная иммунизация овец полиштаммовой вакциной против хламидиоза крупного рогатого скота в дозе 1,0 мл обеспечивает максимальную защиту подопытных животных от заболевания хламидиозом (штамм "Ростиново-70") в течение 3-4 месяцев после вакцинации.
При разработке технологии изготовления и контроля инактивированной эмульсионной полиштаммовой вакцины против хламидиоза крупного и мелкого рогатого скота на основе штаммов "МЗ-89", "СК-89" и "250" нами был применен разработанный более эффективный способ получения биомассы хламидий на КЭ.
Дополнительно были проведены исследования по усовершенствованию метода инактивации, очистки, концентрации и стандартизации биомассы хламидий, а также был предложен упрощенный метод контроля вакцины.
Наиболее важными этапами в технологии производства полиштаммовой вакцины, изготавливаемой и выпускаемой в ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», составляющую ее научную основу, являются: 1) Разработка способа получения биомассы хламидий, основанного на выращивании патогенных штаммов ("МЗ-89", "СК-89" и "250") хламидий одновременно в желточной и аллантоисной полостях куриного эмбриона, позволяющая увеличить выход хламидий с инфицированного куриного эмбриона по сравнению с существующей технологией;
2) Усовершенствование режима инактивации биомассы хламидий с помощью формальдегида (0,2?0,3%) в течение 48 часов при температуре 370С, с последующей гомогенизацией инактивированных и очищенных хламидийных антигенов в растворе глутарового альдегида (0,2?0,3 %). Подобранный режим инактивации оказался оптимальным.
3) Разработка способа очистки и концентрирования хламидий от неспецифических компонентов, позволяющего повысить иммунногеность полиштаммовой вакцины;
Повышение иммуногенной активности, достигалось также и тем, что полиштаммовая вакцина для специфической профилактики хламидиоза крупного и мелкого рогатого скота содержит инактивированные и очищенные хламидийные антигены из штаммов хламидий вида Chlamydia psittaci: "МЗ?89" - возбудителя менингоэнцефалита, ?250?? возбудителя хламидиозного аборта и "СК-89" - возбудителя хламидиозного конъюнктивита телят, взятых в соотношении 0,25; 0,25; 0,5 соответственно и с концентрацией 16-18 мг/мл, адсорбированных на алюмокалиевых квасцах и эмульгированных в масляно-ланолиновом адъюванте, при следующем соотношении основных компонентов препарата (мл):
1. Инактивированные хламидийные антигены из штаммов вида Chl. psittaci : ?"МЗ-89" с титром ЭЛД50 10-5,5 ? 10-7,7 в 0,3 мл ??250? с титром ЭЛД50 10-5,.5 - 10-7,7 в 0,3 мл мл ?"СК-89" с титром ЭЛД50 10-5,5 - 10-7,7 в 0,3 мл -Масло-ланолиновый адъювант -10% раствор алюмокалиевых квасцов -10% раствор глутарового альдегида 13,7?12,6 13,7?12,6 24-25 48-49 0,4-0,5 0,2-0,3
Детальное описание разработанной нами технологии получения полиштаммовой вакцины, его контроля и применения нашли свое отражение в соответствующих разделах инструкции по изготовлению и контролю вакцины, ТУ на биопрепарат и наставления по применению вакцины.
6. Оценка эффективности инактивированной эмульсионной полиштаммовой вакцины, предназначенной для специфической профилактики хламидиозов крупного и мелкого рогатого скота, в производственных условиях
Испытания полиштаммовой инактивированной эмульсионной вакцины проводили в 10 неблагополучных по хламидиозу крупного и мелкого рогатого скота хозяйствах республик Татарстана, Марий-Эл, Чувашии и Пермской области Российской Федерации. При этом всего было привито 7064 голов крупного рогатого скота, в том числе 4343 коровы, и 2720 телят и телок случного возраста, а также 2675 гол. мелкого рогатого скота, в том числе 1000 овцематок, 70 баранов и 1602 голов ярок. Поствакцинальный и колостральный иммунитет у привитых животных (коров, телят, овец) изучали в динамике по накоплению специфических поствакцинальных комплементсвязывающих антител у вакцинированных животных. Полученные данные свидетельствовали о том, что через месяц после однократной вакцинации положительная реакция к хламидийному антигену выявляется у 100% вакцинированных животных со средним титром антител 1:25, через 6-7 месяцев (после ревакцинации) положительная реакция составила 96% со средним титром антител 1:29. В последующие сроки исследования (через 9 месяцев) серопозитивность у коров перед отелом составляла 96% со средним титром 1:20. В сыворотке крови новорожденных телят от 3 до 32-дневного возраста, родившихся от вакцинированных коров, положительная реакция к хламидиозному антигену в РСК отмечалось у 100% телят со средним титром 1:25. Выборочные исследования сыворотки крови вакцинированных овец через один и три месяца после иммунизации выявили положительную реакцию у 80-100% животных со средним титром комплементсвязывающих антител 1:10 и 1:80 соответственно.
Таким образом, серологические исследования вакцинированных животных показали, что внутримышечная вакцинация инактивированной эмульсионной полиштаммовой вакциной против хламидиоза крупного и мелкого рогатого скота создает достаточно высокий уровень специфических противохламидийных антител у привитых животных и у полученного от них молодняка.
Оценку эффективности применения полиштаммовой вакцины проводили на основании фактических данных по количеству абортов и мертворождаемости, а также падежу и вынужденному убою молодняка в неблагополучных по хламидиозу хозяйствах до и после применения вакцины. Полученные нами данные показали, что до применения вакцины общие потери молодняка в неблагополучных по хламидиозу хозяйствах в республиках Чувашии и Марий-Эл составляют в среднем 22-33%. В первый год применения полиштаммовой вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота отход молодняка сократился до 17-18%.
При этом количество зарегистрированных абортов и мертворождений уменьшилось на 2-8%, падеж и вынужденный убой телят до 2,5-18%. На втором году использования вакцины в этих хозяйствах эти показатели составили соответственно 3-6% и 8-13%. При этом общие потери молодняка сократились на 5-17%. На третий год применения полиштаммовой вакцины отход молодняка сократился в 1,1-2 раза, количество абортов и мертворождений уменьшились 1,4-2,5 раза, а падеж и вынужденный убой телят в некоторых хозяйствах сократился в 2,0 раза.
Следовательно, в результате применения полиштаммовой инактивированной эмульсионной вакцины в системе противохламидиозных мероприятий в течение последующих трех лет существенно сократилось количество абортов и мертворождений хламидиозной этиологии; в 2,0 раза уменьшилась заболеваемость, сократился падеж и вынужденный убой телят.
Таким образом, проведенные широкомасштабные испытания полиштаммовой инактивированной эмульсионной вакцины в неблагополучных по хламидиозу хозяйствах показали, что ее целесообразно применять систематически до полного оздоровления поголовья крупного рогатого скота от этой инфекции.
7. Разработка инактивированной эмульсионной вакцины против хламидиоза свиней и оценка ее эффективности
К настоящему времени накоплен сравнительно большой фактический материал об этиологической роли хламидий в инфекционной патологии свиней в специализированных комплексах и хозяйствах промышленного типа (Г.П.Щербань, 1978; Прудников С.И., 1981; Бортничук В.А., 1991; Leonhard I., 1988). Если при хламидиозе овец разработаны и внедрены в ветеринарную практику эффективные меры борьбы и средства специфической профилактики, то при хламидиозе свиней эти задачи находятся на стадии разработки и апробации.
Приступая к разработке биопрепарата перед нами была цель, получить вакцину, обладающей высокой иммунногенной активностью с широким спектром антигенности для профилактики хламидиоза свиней.
Разработка инактивированной эмульсионной вакцины против хламидиоза свиней проводилась с использованием штаммов хламидий "РС-85 и "ЛС-87", адаптированных к размножению на КЭ с инфекционным титром не ниже 10-5,5-6,5 ЭЛД50 в 0,3 мл. Получение биомассы хламидий, ее инактивация, очистка хламидийного антигена осуществляли по разработанной нами технологии. Биомассу после очистки от тканевых компонентов куриных эмбрионов концентриро
Список литературы
1. Авторское свидетельство, №1641883 СССР. Способ получения биомассы. / Ф.М.Хусаинов, Р.Х.Хамадеев, А.З.Равилов - №1641883; заявл.24.10.88.
2. Авзалов, Ф.З. Изучение иммуноморфогенеза при вакцинации свиней противохламидиозной вакциной /Ф.З.Авзалов, Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов //Матер. по актуальные проблемы живот. и ветеринарии.-Казань, 1999.-С.45-47
3. Евстифеев, В.В. Разработка средств специфической профилактики хламидиоза свиней/ В.В.Евстифеев, Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов //Матер. Международной научно-практической конференции, "Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов" посвященной 35-летию института- Щелково, 2005.-С.382-384.
4. Евстифеев, В.В. Разработка средств специфической профилактики хламидиоза свиней /В.В.Евстифеев, Ф.М.Хусаинов, [и др.] //Матер.Международного симпозиума "Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний", посвященного 45-летию образования института-Казань, 2005.- С. 382-386
5. Пат. № 2092188. Российская Федерация, МПК А61К39/Хусаинов Ф.М.; заявитель и патентообладатель Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт№5008246; заявл.29.10.91; опубл.27.04.92.Бюл.№18.-3с.
6. Пат. 2247577 Российская Федерация, МПК А61К39/Хусаинов Ф.М. [и др.]; заявитель и патентообладатель Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт (RU) №2002135, заявл. 20.12.2002; публ.27.04. 2002, Бюл.№18.-3с.
7. Равилов, А.З. Разработка биологических препаратов и методов диагностики, лечения и профилактки хламидиозов сельскохозяйственных животных, пушных зверей и птиц/ А.З.Равилов, Ф.М.Хусаинов, [и др.] / Материалы на соискание Государственной премии РТ 1995 года в области науки и техники.- Казань, 1995.-165 с.
11. Хамадеев, Р.Х. Изучение поствакцинального иммунитета у коров, вакцинированных против хламидиоза крупного рогатого скота /Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов, [и др.]//Тез. Докл. ІІІ Всесоюзной конференции по эпизоотологии. - Новосибирск., 1991.-С.412-413.
12. Хамадеев, Р.Х. Экспериментальная оценка инактивированной вакцины против хламидиозного аборта крупного рогатого скота / Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов, [и др.] // Матер. ІУ Всесоюзн. конф.- Москва, 1991. -С.26-28.
14. Хамадеев, Р.Х. Оценка иммуногенной активности полиштаммовой вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота/ Р.Х. Хамадеев, Ф.М.Хусаинов,[и др.] //Матер. науч.-произв. конф. по проблеме ветеринарии и животноводства.- Казань, 1995.-С.42-44.
15. Хусаинов, Ф.М. Клинико-эпизоотологическое проявление хламидиозов крупного рогатого скота и свиней в хозяйствах Среднего Поволжья / Ф.М.Хусаинов, Р.Х.Хамадеев, [и др.]//Матер.науч.-произв. конф. по проблеме ветеринарии и животноводства.- Казань, 1995.-С.41-43.
16. Хусаинов, Ф.М. Диагностика хламидиоза свиней и крупного рогатого скота методом ИФА / Ф.М.Хусаинов, Р.Х.Хамадеев, [и др.]// Матер. науч.-произв. конф. по проблеме ветеринарии и животноводства.- Казань, 1995.-С.46-48.
17. Хамадеев, Р.Х. Разработка диагностикума для РНГА при хламидиозах / Р.Х. Хамадеев, Ф.М.Хусаинов, [и др.]//Матер. науч.-произв. конф. по проблеме ветеринарии и животноводства.- Казань,1995.-С.47-49.
18. Хусаинов, Ф.М. Использования иммуноферментного анализа для диагностики хламидиоза свиней / Ф.М.Хусаинов, Р.Х.Хамадеев, [и др.]// Вирусные болезни с.-х. животных. - Владимир, 1995.-С.67-68.
19. Хамадеев, Р.Х. Использования РНГА для оценки поствакцинального иммунитета при хламидиозах / Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов, [и др.]// Вирусные болезни с.-х. животных.- Владимир, 1995.-С.132-133.
20. Хамадеев, Р.Х. Разработка инактивированной эмульсионной вакцины против хламидиоза свиней/ Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов, [и др.]//Вирусные болезни с.-х. животных. - Владимир, 1995.-С.151.
21. .Хамадеев, Р.Х. Вакцина против хламидиоза крупного рогатого скота / Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов, [и др.]// Ветеринария, 1996. №6 -С.22-24.
22. Хусаинов, Ф.М. Сравнительная оценка серологических методов РСК, РНГА и ИФА при диагностике хламидиозной инфекции крупного рогатого скота и свиней/ Ф.М.Хусаинов, Р.Х.Хамадеев, [и др.]//Всерос.науч.конф. Инфекц.болезни молодняка с.-х. животных. Тез докл..-М., 1996.-С.12-14.
23. Хамадеев, Р.Х. Клинико-эпизоотическое проявление хламидиозов крупного рогатого скота и свиней в зоне Среднего Поволжья/ Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов, [и др.]//Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов, Матер. V Всероссийской конференции.- Щелково, 1996.- С.153-154.
24. Хусаинов, Ф.М. Деконтаминация спермы при генитальном хламидиозе быков-производителей/ Ф.М.Хусаинов, Р.Х.Хамадеев, [и др.]// ІІ Респуб. Тез.докл. Науч. конф. молодых ученых и специалистов., - Казань, 1996.-С.59.
25. Хамадеев, Р.Х. Клинико-эпизоотическое проявление хламидиозов крупного рогатого скота и свиней в зоне Среднего Поволжья / Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов, [и др.]//Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов. Тезисы докладов V Всероссийской конференции.- Щелково, 1996, С.153-154.
26. Хамадеев, Р.Х. Получение эритроцитарного диагностикума для выявления антител при хламидиозе/ Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов, [и др.]//Науч. основы технологии пром. пр-ва вет. биол.препаратов -Щелково, 1996 -С.153-154.
27. Хамадеев, Р.Х. Эффективность полиштаммовой вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота / Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов, [и др.]/Науч.основы технологии пром.пр-ва вет.биол.препаратов-Щелково, 1996 - С.178-179.
28. Хамадеев, Р.Х. Профилактика хламидиоза в условиях промышленного свиноводства./ Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов, [и др.] //Матер. Всерос. научно-метод.конф. по патологической анатомии с.-х.животных. Казань. 1998.-С.99-100.
29. Хамадеев, Р.Х. Эпизоотологические особенности хламидиоза в условиях промышленного свиноводства./ Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов, [и др.]//Матер. Всерос. научно-метод. конф. по патологической анатомии с.-х.животных. Казань. 1998.-С.100-101.
30. Авзалов, Ф.З. Иммуноморфологическая перестройка организма телят при введении полиштаммовой вакцины против хламидиоза/ Ф.З.Авзалов, Ф.М.Хусаинов, [и др.]//Матер. Всерос. научно-метод. конф. по патологической анатомии с.-х. животных. Казань. 1998.-С44-48.
31. Хусаинов, Ф.М Хламидиозы свиней и крупного рогатого скота в Среднем Поволжье/ Ф.М.Хусаинов, Р.Х.Хамадеев [и др.]// Матер.науч.конф. посвященной 125-летию академии Ч.1.- Казань, 1998,-С.113-114.
32. Хамадеев, Р.Х. Распространение, диагностика хламидиозов сельскохозяйственных животных и меры борьбы / Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов, [и др.]// Диагностика, лечение и профилактика опастных инфекционных заболеваний. Матер. юбил. научн.-произв.конф., посвященные 70 летию НИИ микробиологии МО РФ.-Киров, 1998.-С.249-250.
33. Хамадеев, Р.Х Диагностика хламидиоза лошадей/ Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов, [и др.] / Матер. по актуальные проблемы живот. и ветеринарии. - Казань, 1999.-С.56-57.
34. Хамадеев, Р.Х. Эритроцитарный диагностикум для обнаружения и идентификации возбудителя хламидиоза// Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов [и др.]// Матер. по актуальные проблемы живот. и ветеринарии.-Казань, 1999.-С.68-69.
35. Хусаинов, Ф.М. Разработка эритроцитарного диагностикума для обнаружения и идентификации возбудителя хламидиоза /Ф.М.Хусаинов, Р.Х.Хамадеев, [и др.]// Матер. юбилейной научной конференции посвященной 50-летию Центра военно-технических проблем биологической защиты НИИ Микробиологии МО РФ. Диагностика, лечение и профилактика инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария.-Екатеринбург ,1999.-С.259-260.
36. Хусаинов, Ф.М. Профилактика и лечение хламидиоза крупного рогатого скота и свиней / Ф.М.Хусаинов, Р.Х.Хамадеев, [и др.]//Ж. «Ветеринарный врач», №4, 2000г.
37. Хамадеев, Р.Х. Эпизоотологические факторы хламидиоза и основные принципы противохламидиозных мероприятий /Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов, //Матер. Межрегиональной научно-практической конф. По актуальным проблемам исследований в области зоотехнии и ветеринарной медицины в современных условиях.-Чебоксары, 2000.-С.129.
38. Хусаинов, Ф.М. Профилактика хламидиозного аборта овец полиштаммовой инактивированной вакциной против хламидиоза крупного рогатого скота/Ф.М.Хусаинов, Р.Х.Хамадеев, [и др.]/ Матер. Международной научн. конф. посвященной 70-летию образования зооинженерного факультета "Инфекционные и инвазионные болезни"- Казань.-2000.-С.8.
39. Хамадеев, Р.Х. Противоэпизоотические мероприятия при хламидиозе свиней / Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов, [и др.]//Матер. Международной научн.конф. посвященная 70-летию образования зооинженерного факультета "Инфекционные и инвазионные болезни".-Казань.-2000.-С.78.
40. Хамадеев, Р.Х. Эпизоотические особенности хламидиоза у животных и основные принципы противохламидиозных мероприятий / Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов, [и др.] // Матер. Международной научн.конф. посвященная 70-летию образования зооинженерного факультета "Инфекционные и инвазионные болезни".-Казань.-2000.-С.99.
41. Хусаинов, Ф.М. Профилактика хламидиозного аборта овец полиштаммовой инактивированной вакциной против хламидиоза крупного рогатого скота / Ф.М.Хусаинов, Р.Х.Хамадеев, [и др.] Матер.// Международной научн.конф. посвященная 70-летию образования зооинженерного факультета "Инфекционные и инвазионные болезни".-Казань.-2000.-С.100-101.
42. Хамадеев, Р.Х. Течение хламидиоза и его профилактика на свинокомплексе / Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов, [и др.] // Ветеринария, №2, 2000г. С.14-17.
43. Хамадеев, Р.Х. Разработка и испытание набора препаратов для диагностики хламидиоза животных в РНГА/ Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов [и др.] /Матер. Всеросс. научн. практ. конф., посвященной 30-летию института. Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов. - Щелково.-2001.-С.56-58.
44. Хусаинов, Ф.М. Изучение хламидиоза сельскохозяйственных животных в зоне Среднего Поволжья/ Ф.М.Хусаинов, Р.Х.Хамадеев [и др.]// Матер. Всеросс. научн.- производственной конференции по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии Ч.1.-Казань.-2002.-С.130.
45. Хусаинов, Ф.М. Испытание на овцах в производственных условиях полиштаммовой вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота/Ф.М.Хусаинов, Р.Х.Хамадеев [и др.] // - Матер. Всеросс. научн.- производственной конференции по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии Ч.1.-Казань.-2002.-С.126.
47. Хамадеев, Р.Х. Основные факторы эпизоотического процесса и разработка средств специфической профилактики хламидиоза/ Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов, [и др.] /Сельскохозяйственная биология - М.,2004.- С.70-77.
48. Хусаинов, Ф.М. Разработка ассоциированной инактивированной вакцины против парвовирусной и хламидийной инфекции свиней и оценка ее эффективности/ Ф.М.Хусаинов, Р.Х.Хамадеев, [и др.] // Матер. Международного симпозиума "Научные основы обеспечения защиты от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний", посвященного 45-летию образования института - Казань, 2005.- С.388-393.
49. Хусаинов, Ф.М. Разработка средств специфической профилактики хламидиоза сельскохозяйственных животных/ Ф.М.Хусаинов, Р.Х.Хамадеев, [и др.] // Матер. Международного симпозиума "Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний", посвященного 45-летию образования института - Казань, 2005- С. 393-395.
50. Хусаинов, Ф.М. Изучение распространения хламидиоза голубей, обитающих на территории г.Казани/ Ф.М.Хусаинов, Р.Х.Хамадеев, [и др.] //Материалы Международного симпозиума "Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний", посвященного 45-летию образования института - Казань, 2005.- С.385-387.
51. Хусаинов, Ф.М. Клинико-эпизоотологическое проявление хламидиозов крупного рогатого скота в хозяйствах Среднего Поволжья и Предуралья//Ф.М.Хусаинов, Р.Х.Хамадеев, [и др.]// Ж.«Ветеринарный врач». №1-2006, С.32-37.
Размещено на .ru
Вы можете ЗАГРУЗИТЬ и ПОВЫСИТЬ уникальность своей работы
