Способы получения иммуноглобулинов изотипов G, М, А рогатого скота. Методы изучения растворимых и мембранных форм белков суперсемейства иммуноглобулинов, х сравнительная характеристика и эффективность. Изменения клеток, несущих рецепторные белки IgSF.
При низкой оригинальности работы "Идентификация и характеристика биологических свойств белков суперсемейства иммуноглобулинов животных", Вы можете повысить уникальность этой работы до 80-100%
Среди мембраносвязанных белков IGSF большой интерес представляют рецепторы, находящиеся на поверхности Т-клеток (CD2, CD4, CD8 и др.), макрофагов (Fc - рецепторы) и В-лимфоцитов (BCR - антигенный рецептор В-клетки). Вместе с тем, следует отметить, что закономерности формирования иммунного ответа на молекулярном уровне у животных, в частности, механизмы перекрестного связывания антигена с рецепторами В-клеток, роль адгезивных молекул Т-лимфоцитов и макрофагов в трансдукции сигнала при иммунизации, изучены недостаточно. Разработать методы исследования В-клеток крупного рогатого скота с использованием моноклональных антител к IGM. Диссертация выполнена в соответствии с планом НИР ВИЭВ задание 01.01.05 М МП «Разработать и освоить производство моноспецифических антисывороток и моноклональных антител для количественного определения уровня иммуноглобулинов в биологических жидкостях организма животных», этап Н.02.2 «Провести комплексные исследования по оценке функционального состояния гуморальных и клеточных факторов иммунной системы у мышей в процессе иммуногенеза»; задание 01.01.09 М МП «Разработать и освоить производство набора компонентов для оценки иммунного статуса организма животных»; задание 02.02.11 РНТП «Изучить механизмы формирования иммунного ответа у животных в процессе онто-и иммуногенеза, разработать и усовершенствовать методы иммунологического мониторинга». разработан метод иммунопероксидазного окрашивания клеток для количественной оценки В-лимфоцитов крупного рогатого скота на основе моноклональных антител к иммуноглобулину М (патент на изобретение №2293330 от 10 февраля 2007 г.).На основе этой реакции был разработан иммуноцитохимический метод определения поверхностных иммуноглобулинов В-клеток крупного рогатого скота с использованием МКА к IGM и поликлональные антитела к IGG, IGA крупного рогатого скота, полученные нами на первых этапах работы. Таким образом, в иммунопероксидазной реакции с использованием моноклональных антител, полученных к молекуле IGM, определяли SIGM-клетки, а при обработке поликлональными антисыворотками - лимфоциты, несущие на своей поверхности иммуноглобулины различных изотипов. Таким образом, на изменение адгезивной активности макрофагов вследствие введения вакцины против рожи свиней, Т-клетки реагируют повышением уровня экспрессии CD2-рецепторов, играющих важную роль не только в адгезии клеток при распознавании антигена, но и в передаче антигенного сигнала Т-лимфоциту. Значительное повышение уровня многорецепторных клеток в костном мозге в первые сутки свидетельствует об усилении адгезивной активности Т-клеток, направленной на контакт с В-клетками, а возможно, и для генерирования дополнительного активационного сигнала. В результате проведенных исследований установлено, что в первые сутки после инъекции вакцины в селезенке достоверно повышается количество В-клеток и уровень IGG1, тогда как количество Т-клеток увеличивается только на 7-е сутки иммуногенеза.A (S-IGA) крупного рогатого скота из молозива и носовых секретов животных и унифицирована технология получения и контроля моноспецифических реагентов к иммуноглобулинам крупного рогатого скота. С использованием реакции непрямой иммунофлуоресценции на основе моноклональных антител установлено, что число SIGM-клеток в крови крупного рогатого скота составляет от 0,97±0,5 х109/л до 1,0±0,7 х109/л. Методом иммунопероксидазного окрашивания определено количество SIGM-клеток в крови телят 30-дневного возраста, находящееся в пределах 16,6±4,5% - 19,2±0,8%. Разработан способ идентификации В-лимфоцитов крупного рогатого скота с применением иммунопероксидазного окрашивания клеток на основе моно-и поликлональных антител. Установлено, что мембранные иммуноглобулины В-клеток крови коров распределяются по периметру лимфоцита в форме «петч»/эндоцитоз на 68,9±3,9% клеток, «петч» (неоднородные скопления рецепторов) - 15,0±3,3%, «ринг» (равномерное распределение рецепторов по периметру клетки) - 10,5±3,3%, «кэп» (скопление рецепторов на одном из полюсов клетки) - 5,6±1,9%.
Вывод
Одними из самых распространенных белков иммунной системы являются гликопротеины IGSF, участвующие в гуморальном и клеточном иммунном ответе. При этом гуморальные механизмы иммунной системы обеспечивают растворимые формы иммуноглобулинов, а клеточные - мембраносвязанные ILT - рецепторы иммунокомпетентных клеток. Задачей первого этапа нашей работы была разработка и оптимизация методов количественной оценки IGG, IGM, IGA и лейкоцитов с ILT-рецепторами.
Выделение IGG из сыворотки крови и молозива крупного рогатого скота
Учитывая, что основным иммуноглобулином сыворотки крови и молозива крупного рогатого скота является IGG, для его получения использовали эти биологические жидкости. В результате гель-фильтрации ?-глобулинов сыворотки крови и молозива на Sephacryl S-300 и Sepharose 6B были получены препараты IGG с примесями.
В связи с этим, для выделения иммуноглобулинов G использована ионообменная хроматография, основанная на различиях в соотношении и распределении заряженных групп на поверхности белка. Для десорбции иммуноглобулинов использовали повышение ионной силы элюирующего раствора с применением градиента концентрации NACL от 0,1 М до 0,4 М.
Осажденные ?-глобулины из сыворотки крови и молозива наносили на колонки с DEAE Sepharose 6B. В качестве элюирующего раствора использовали 0,02 М Tris-HCL, РН 7,2 с 0,1М, 0,15М, 0,25М и 0,4М NACL.
Методом иммуноэлектрофореза установлено, что IGG элюировался в первом белковом пике при 0,1 M NACL, IGA во втором при 0,15 M NACL, а IGM в третьем при 0,25 M NACL. Элюаты концентрировали в ПЭГ 40000. Степень чистоты полученных препаратов иммуноглобулинов проверяли методом электрофореза в ПААГ-ДСН.
Образцы подвергали термоденатурации в присутствии 2-меркаптоэтанола, в объеме 2 мкл наносили на пластины с полиакриламидным гелем. Предварительно в образцах определяли концентрацию белка по методу Лоури. Из 2 мл ?-глобулинов крупного рогатого скота, нанесенных на колонку с DEAE Sepharose 6B, получали 1,0 мл IGG с содержанием белка 10-15 мг/мл.
Разработка способа получения IGA из носовых секретов и молозива крупного рогатого скота
Иммуноглобулины А в биологических жидкостях находятся в нескольких полимерных формах. В сыворотке крови IGA встречается как в виде мономера с молекулярной массой 160 KDA, так и в полимерной форме, в основном, как димер. Присутствие различных полимерных форм IGA и незначительная его концентрация затрудняют его выделение из сыворотки крови крупного рогатого скота. Поэтому, для получения IGA использованы носовые секреты и молозиво, концентрация IGA, в которых является максимальной.
Для выделения S-IGA сыворотку молозива животных обрабатывали 0,1 М раствором сернокислого цинка и этилендиаминтетрауксусной кислотой, а затем проводили разделение глобулинов на колонке с Sephacryl S-400 (в качестве элюанта использовали 0,1 М Трис-HCL буфер РН 8,0 с 1,0 М NACL). Для выделения S-IGA из носовых секретов крупного рогатого скота, данную биологическую жидкость в количестве 5,0-6,0 мл центрифугировали при 1000 об/мин в течение 15 мин. и диализовали против 0,02 М Tris-HCL буфера РН 8,0 два часа. Затем диализат фракционировали на колонке с Sephacryl S-300-HR. Иммунохимическую чистоту S-IGA подтверждали иммуноэлектрофоретическим анализом белковых фракций.
Анализ проведенных исследований показал, что лучшим источником для выделения S-IGA являются носовые секреты, поскольку концентрация данного изотипа в них достаточно велика (2,81 мг/мл) по сравнению с IGM (0,04 мг/мл) и IGG (1,56 мг/мл) (Butler, 1986).
Иммунохимические свойства моноклональных антител к IGM и SIGA рогатого скота
В результате проведенной работы по гибридизации клеток лимфоцитов иммунных мышей BALB/c с клетками миеломы Sp 2/0 получены гибридомы-продуценты МКА к иммуноглобулинам классов M и A крупного рогатого скота. В процессе экспериментов получено и протестировано более 10000 первичных гибридных клеточных клонов. Получен набор асцитических препаратов, с помощью иммуноблоттинга и различных серологических тестов определена иммунохимическая характеристика МКА. Проведены исследования и показана возможность использования полученных МКА для количественного определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях организма животных методами «сэндвич» - ИФА и РИД.
В результате проведенных исследований установлено, что моноклональные антитела С 2, С4, G9, С11, В3 взаимодействуют только с IGM, не реагируя IGG и IGA, а МКА 4G11, 1F3, 7E7, 6B8 только с IGA. По результатам иммуноблоттинга, МКА клонов С2, С4 и G9 реагируют только с нативной молекулой IGM, что свидетельствует о конформационном характере антигенных детерминант на молекуле IGM, распознаваемыми полученными антителами. Моноклональные антитела клонов С11 и В3 взаимодействуют не только с нативной молекулой, но и с ? - цепью IGM, что свидетельствует о линейном характере эпитопов, которые распознают МКА (табл. 1). иммуноглобулин рецепторный белок суперсемейство
Таблица 1. Иммунохимическая характеристика моноклональных антител к IGM и IGA крупного рогатого скота и овец
МКА IGG IGA IGM Тип эпитопа
Димер Цепи Пента мер Цепи ? L ? L
С2 - - - - - - конформационный
С4 - - - - - - конформационный
G9 - - - - - - конформационный
С11 - - - - - линейный
В3 - - - - - линейный
4G11 - - - - - - конформационный
1F8 - - - - - линейный
7Е7 - - - - - линейный
6B8 - - - - - - конформационный
В результате проведенных исследований были отобраны клоны С2 и G9, продуцирующие МКА, которые взаимодействуют с нативной молекулой IGM и сохраняют титр в реакции диффузионной преципитации (1:32) после лиофилизации. Использование моноклональных антител в РИД предполагает наличие преципитирующих свойств Ig. МКА к IGM клонов С2 и G9 обладали такими свойствами, а вот МКА к IGA только при сочетании нескольких МКА различных клонов. Анализ иммунохимических свойств МКА показал, что наиболее эффективными для использования в РИД являются моноклональные антитела, распознающие антигенную детерминанту конформационного типа.
Для определения минимальных концентраций IGA в биологических жидкостях крупного рогатого скота (молоко, моча) оптимизированы условия постановки «сэндвич» - ИФА с использованием МКА. Испытаны сочетания МКА, где одни из них использовали в качестве иммобилизирующих антител, а другие, конъюгированные с пероксидазой, для определения связанного антигена. В результате проведенных экспериментов подобран вариант, позволяющий идентифицировать и количественно определять уровень как мономерного сывороточного IGA, так и SIGA в различных секретах (слезы, слюна, молозиво, молоко, носовые секреты).
На основе полученных МКА к IGM и IGA рогатого скота приготовлены реагенты для количественного определения уровня иммуноглобулинов классов М и А в РИД и ИФА.
Разработка метода идентификации Ig-рецепторов В-лимфоцитов
К важнейшим рецепторам В-клеток относят поверхностные иммуноглобулины, специфичные к одному определенному антигену. Известно, что на поверхности В-лимфоцита экспрессируется мембранный IGM (SIGM), являющийся неотъемлемой частью рецепторного комплекса В-клетки для антигена. Изучение форм локализации SIG на поверхности В-клеток крупного рогатого скота, плотности распределения мембранных иммуноглобулинов лимфоцитов крови у молодых и взрослых животных является перспективным направлением исследований механизмов клеточной активации и анергии в процессах онто- и иммуногенеза. С использованием поли- и моноклональных антител к иммуноглобулинам, возможно изучение локализации SIG клетки и определение количества В-лимфоцитов.
Несмотря на очевидный интерес к данной теме (Murakami K. et al, 2004, Usui T., 2006 и др.), в доступной отечественной литературе очень мало данных по исследованию поверхностных иммуноглобулинов лимфоцитов у крупного рогатого скота. Поверхность является своеобразным «паспортом» клетки, по которому можно идентифицировать тип и функции лимфоцита. Основные мембранные молекулы, участвующие в распознавании антигенов, принадлежат к IGSF. Мембранные Ig и антитела образуют своеобразную систему иммунного контроля за клеточной мембраной лимфоцитов, являясь сигнальными молекулами, с помощью которых осуществляются основные адаптивные иммунные реакции организма. Следует отметить, что многие механизмы экспрессии s-Ig лимфоцитов, влияния внешних и внутренних факторов на формирование рецепторного профиля клетки мало изучены и до сих пор неизвестны. В связи с этим следующим этапом работы был поиск адекватного метода для изучения Ig-рецепторов клетки.
Известно, что иммуноглобулины в организме могут быть в мембранной (SIG), цитоплазматической (CIG) и секретируемой (Ig) формах, которые являются также и показателем уровня дифференцировки В-лимфоцитов.
Для определения соотношения первых двух форм иммуноглобулинов В-клеток лимфоидных органов у интактных мышей использовали иммунопероксидазный метод.
Относительное содержание Ig-клеток в костном мозге распределялось следующим образом: 22,3% - IGM, 27,5% - IGG и 20,5% - IGA в цитоплазматической форме, что подтверждает важную роль этого органа в синтезе антител. Зафиксировано 10,3% лимфоцитов с SIGM. В тимусе обнаружено 18,2% тимоцитов с SIGM, 1,0% мононуклеарных клеток с SIGG, 2,1% лимфоцитов c CIGA. В селезенке зарегистрировано 7,5% лимфоцитов с SIGM, 7,1% - SIGG и 6,3% - CIGA. Как вторичный лимфоидный орган селезенка является главным источником циркулирующих В-лимфоцитов. По-видимому, лимфоциты, на мембране которых выявлены IGG, являются В-клетками памяти. В лимфатических узлах наблюдалось 25,2% клеток с SIGM и 40,5% - с IGG. Мембранный IGG распределялся в клетках лимфатических узлов следующим образом 5,0% - равномерное распределение окраски по периметру клетки, 20,3% - неравномерное распределение окраски, 5,2% - образование скопления окраски на одном из полюсов клетки и 10,0% - неравномерное распределение окраски с поглощением скоплений окраски внутрь клетки. Разнообразие форм Ig-рецепторов свидетельствует об интенсивных процессах секреции антител в лимфатических узлах. Установлено, что большинство антител лимфатических узлов относятся к IGG-изотипу. В лимфоидной ткани кишечника зафиксировано 8,3% клеток с SIGM; 2,6% с SIGG и 3,8% с цитоплазматической формой IGA.
На основе этой реакции был разработан иммуноцитохимический метод определения поверхностных иммуноглобулинов В-клеток крупного рогатого скота с использованием МКА к IGM и поликлональные антитела к IGG, IGA крупного рогатого скота, полученные нами на первых этапах работы.
На рис. 4 показано, что при обработке клеток 1%-ной лимонной кислотой (ЛК), количество иммуноглобулинов на поверхности клетки значительно уменьшается (рис. 4-б). Большая плотность экзогенных иммуноглобулинов (рис. 4-а) на поверхности клетки, по-видимому, обусловлена способностью молекул Ig к образованию поперечных сшивок. FC?RII-рецептор В-лимфоцитов связывает только IGG и с довольно низким сродством (<107М-1). В кислой среде нековалентные взаимодействия между Fc-рецептором клетки и Fc-фрагментом антитела ослабевают, и экзогенные IGG диссоциируют с поверхности лимфоцита.
Мембранные IGM ориентированы Fab-областью по направлению к внешней среде, тогда как Fc-фрагмент находится в контакте с клеточной поверхностью. S-IGM содержит на С-концах тяжелых цепей домены, образованные гидрофобными аминокислотами, которые удерживают молекулу Ig на наружной поверхности мембраны.
Таким образом, в иммунопероксидазной реакции с использованием моноклональных антител, полученных к молекуле IGM, определяли SIGM-клетки, а при обработке поликлональными антисыворотками - лимфоциты, несущие на своей поверхности иммуноглобулины различных изотипов. Используемые в данном исследовании антисыворотки к IGG и S-IGA крупного рогатого скота, представляют собой набор антител ко всем антигенным детерминантам Ig, в том числе, и к эпитопам легких цепей, которые у всех изотипов иммуноглобулинов являются идентичными. Поэтому при добавлении к лимфоцитам данных антител, происходит их взаимодействие со всеми изотипами Ig, находящимися на поверхности клетки. С другой стороны, моноклональные антитела к IGM крупного рогатого скота, полученные к одной антигенной детерминанте на молекуле IGM, соответственно, взаимодействуют только с ней. На фотографиях (рис. 5) отчетливо видно, как располагаются SIG по периметру лимфоцита.
Поликлональные антитела, образовавшие иммунные комплексы с поверхностными иммуноглобулинами различных изотипов, в том числе и с s-IGM, распределяются диффузно по всей мембране клетки (рис. 5-а).
Моноклональные антитела взаимодействуют только с одним эпитопом IGM и, поэтому специфическое окрашивание не так интенсивно, как при использовании поликлональных антисывороток (рис. 5-б).
В результате проведенных исследований установлено, что количество SIGM-клеток в периферической крови телят в возрасте одного месяца составляет 16,6%, у коров в возрасте 5-7 лет - 22,8%. Уровень клеток с мембраноассоциированными молекулами IGG и IGA в крови коров находится в пределах 10,7%. - 12,9%
Представленные данные свидетельствуют о том, что все изотипы иммуноглобулинов (IGM, IGG, IGA) экспрессируются на поверхности клеток периферической крови крупного рогатого скота.
Таким образом, в результате проведенных исследований был оптимизирован иммунопероксидазный метод для его дальнейшего использования при определении поверхностных структур лимфоцитов крупного рогатого скота.
Изменения ILT-рецепторного профиля иммунокомпетентных клеток после вакцинации
В процессе иммунного ответа осуществляется множество межклеточных взаимодействий, среди которых наиболее важным является распознавание чужеродного антигена Т-клетками, основанное на специфичности связывания пептидов молекулами МНС, расположенными на поверхности антигенпрезентирующих клеток (АПК). Для характеристики функционально-рецепторных свойств мембраносвязанных IGSF в процессе поствакцинального иммунного ответа определяли рецепторную активность Т-клеток и антигенпрезентирующих клеток (перитонеальные макрофаги). Т-лимфоциты дифференцировали на высокоаффинные - многорецепторные (МРОК) - и неполные - малорецепторные (МРОК). В качестве модельных антигенов использовали живые вакцины бактериальной (производственная вакцина против рожи свиней из штамма ВР-2) и вирусной (ассоциированная вакцина против трансмиссивного гастроэнтерита («ТМК») и ротавирусной инфекции («К») свиней - опытная серия, ВИЭВ) этиологии.
Повышение адгезивной активности перитонеальных макрофагов зарегистрировано на 2-е, 10-е и 14-е сутки иммунного ответа на бактериальную вакцину и только на 3-и сутки после введения вирус-вакцины (табл. 2), что обусловлено различными путями презентации эндогенных и экзогенных антигенов макрофагами.
Таблица 2. Показатели реакции контактного взаимодействия в процессе поствакцинального иммунного ответа
Неактивированные макрофаги содержат незначительное количество молекул МНС. Их экспрессия начинается только после захвата антигена и образования фагосом или протеасом. Как следует из приведенных материалов, в первый день после вакцинации адгезивная активность макрофагов не отличалась от контроля. Если макрофаги, находящиеся в непосредственной близости от места внедрения антигена, не справляются с его уничтожением, то антиген распространяется по всему организму, в том числе, в перитонеальную полость. На 2-е сутки иммунного ответа на бактериальный антиген наблюдалось резкое увеличение числа тимоцитов, контактирующих с макрофагами, что связано с возросшей функциональной активностью макрофагов, которая сопровождалась морфологическими и биохимическими изменениями клеток.
В результате повышается адгезивная активность мембран макрофагов, представляющих фрагменты антигена на своей поверхности. Второй пик повышения функциональной активности ПМ (10-14-е сутки) обусловлен выполнением макрофагами роли эффекторных клеток.
В первые сутки после введения вакцины ВР-2 установлено значительное повышение количества высокоаффинных Т-клеток в костном мозге (75%, контроль - 15%), число которых на 2-е сутки снижается вдвое (рис. 6). На 7-е сутки поствакцинального иммунного ответа, их уровень возрастает в лимфатических узлах (50,2%, контроль - 11%) и тимусе (60,0%, контроль - 27,0%), что характеризует активизацию клеточных реакций, как в первичных, так и во вторичных лимфоидных органах. Усиление экспрессии адгезивных CD2-молекул улучшает межклеточный контакт для обеспечения эффекторных функций иммуноцитов. В тимусе высокий уровень экспрессии CD2-рецепторов сохраняется до 14-ти суток поствакцинального иммунного ответа (71,0%).
В отличие от формирования иммунного ответа на бактериальную вакцину, иммуногенез на вирус-вакцину сопровождается увеличением экспрессии CD2-рецепторов на Т-клетках только в костном мозге на 14-е сутки после вакцинации. Это подтверждает различие в механизмах формирования иммунного ответа на вирусные и бактериальные антигены.
Таким образом, на изменение адгезивной активности макрофагов вследствие введения вакцины против рожи свиней, Т-клетки реагируют повышением уровня экспрессии CD2-рецепторов, играющих важную роль не только в адгезии клеток при распознавании антигена, но и в передаче антигенного сигнала Т-лимфоциту.
Возрастание CD2-белков вначале на Т-клетках костного мозга, затем в тимусе и лимфатических узлах обуславливает достаточно высокую аффинность связывания комплексов молекулы МНС класса II и линейного пептида бактериальной клетки.
Анализ полученных результатов показал, что при увеличении числа тимоцитов на 1-е и 7-е сутки иммунного ответа, адгезивная активность макрофагов была на уровне контроля. И наоборот, повышение числа тимоцитов, прикрепленных к поверхности макрофагов на 2-е сутки при введении бактериальной вакцины и на 3-и - вирусной, сопровождалось только незначительным повышением уровня Т-лимфоцитов. Обратно пропорциональная связь между уровнями тимоцитов и макрофагов в определенные периоды иммуногенеза, по нашему мнению, обусловлена компенсаторными механизмами иммунной системы.
Таблица 3. Коэффициенты корреляции показателей реакции розеткообразования в процессе иммунного ответа (r)
Источники клеток Тимус Костный мозг Лимфатические узлы Селезенка Кровь Макрофаги
Тимус - 0,07 0,63 0,4 0,62 -0,32
Костный мозг 0,07 - 0,65 -0,61 -0,04 -0,44
Лимфатические узлы 0,63 0,65 - -0,03 0,36 -0,64
Селезенка 0,4 -0,61 -0,03 - 0,39 0,45
Кровь 0,62 -0,04 0,36 0,39 - 0,37
Макрофаги -0,32 -0,44 -0,64 0,45 0,37 -
В процессе иммуногенеза установлена прямая корреляционная взаимосвязь между показателями Т-клеток в тимусе и крови (r=0,62), тимуса и лимфатических узлов (r=0,63) и костного мозга и лимфатических узлов (r=0,65). Сопряженность между данными параметрами объясняется развитием иммуногенеза, а именно введение антигена служит началом цепных иммунных реакций, где главную роль играет рецепторная активность CD2-рецепторов Т-клеток костного мозга, тимуса и лимфатических узлов.
Значительное повышение уровня многорецепторных клеток в костном мозге в первые сутки свидетельствует об усилении адгезивной активности Т-клеток, направленной на контакт с В-клетками, а возможно, и для генерирования дополнительного активационного сигнала. Корреляция между показателями в костном мозге и лимфатических узлах (r=0,65) свидетельствует о прямой зависимости рецепторной активности лимфоцитов первичных и вторичных лимфоидных органов в процессе иммунного ответа. Отсутствие корреляционных взаимосвязей между уровнем экспрессии CD2-рецепторов на клетках костного мозга и лимфоцитах крови косвенно подтверждает теорию отрицательной селекции антигеннеспецифичных лимфоцитов, которые погибают в результате апоптоза и не попадают в циркуляцию. Корреляционный анализ иммунологических данных показал прямую зависимость рецепторной активности CD2-антигена от функций активированных Т-клеток на разных этапах иммунного ответа.
Оценка функциональной активности В-клеток в процессе поствакцинального иммунного ответа
Наряду с методами ИПО и РИФ, для идентификации поверхностных Ig-рецепторов клеток использовали лимфоцитотоксический тест. Подопытной группе мышей вводили подкожно вакцину против рожи свиней (штамм ВР-2) в дозе 0,2 мл, ревакцинировали через 30 дней по аналогичной схеме.
Контрольным животным вводили 0,2 мл физиологического раствора. Процент погибших клеток (В-лимфоциты) определяли на 1-е, 7-е и 14-е сутки первичного и вторичного иммунного ответа.
При первичном иммунном ответе увеличение В-лимфоцитов наблюдалось в первые сутки после введения вакцины (23,0%, контроль - 12,0%), и на 1-е и 14-е сутки после повторной инъекции, что свидетельствует также и о повышении экспрессии SIG на клетках. Помимо количественного определения В-лимфоцитов, методом РИД в надосадочной жидкости МНК селезенки мышей определяли концентрацию IGG1.
В результате проведенных исследований установлено, что в первые сутки после инъекции вакцины в селезенке достоверно повышается количество В-клеток и уровень IGG1, тогда как количество Т-клеток увеличивается только на 7-е сутки иммуногенеза.
В процессе иммунного ответа первичные фолликулы селезенки превращаются во вторичные фолликулы с зародышевым центром. В первые сутки иммунного ответа увеличивается число фолликулярных В-клеток, затем эти клетки превращаются в первичные В-бласты и центробласты, которые являются Ig-негативными. На следующей стадии активации В-клеток и образования центроцитов, экспрессия иммуноглобулинов возобновляется. Реакция в зародышевом центре селезенки продолжается около 20 суток. Полученные нами результаты подтвердили цикличность активации В-клеток селезенки и зависимость SIG-рецепторной активности от стадии дифференцировки лимфоцита в процессе иммуногенеза.
Корреляция уровней иммуноглобулинов в сыворотке крови крупного рогатого скота
Антитела к различным антигенным детерминантам являются растворимыми формами мембранных иммуноглобулинов. Таким образом, антитела в разной степени - гомологи антигенсвязывающих участков клеточного рецептора В-лимфоцита.
Уровень иммуноглобулинов в биологических жидкостях организма имеет важное прогностическое значение при вакцинации стельных коров, так у животных с низкими показателями возможен неадекватный иммунный ответ, проявляющийся в отсутствии формирования специфических протективных антител, которые обеспечивают защиту новорожденных телят
В оценке функциональных возможностей иммунной системы играют важную роль корреляционные взаимосвязи. (Михайленко А.А. и соавт., 2000). Положительная корреляция уровней ранних (IGM) и поздних (IGG) иммуноглобулинов, служит критерием нормального функционирования иммунной системы и ее адаптивных возможностей как в норме, так и при различных физиологических состояниях, в том числе при плодоношении.
Как видно из данных таблицы 4, корреляционные взаимосвязи между различными изотипами иммуноглобулинов в сыворотке крови нестельных коров являются слабо положительными (r=0,24-0,35).
Отсутствие корреляции (r=0,07) между показателями IGG и IGA косвенно подтверждает данные об относительной независимости системного и местного иммунитета у нестельных коров.
Таблица 4. Коэффициенты корреляции уровня иммуноглобулинов в сыворотке крови стельных и нестельных коров
В соответствии с представленными результатами, следует отметить, что принцип мозаичности функционирования органов и систем организма, подтверждается деятельностью иммунной системы: многочисленные структурные компоненты, которой при каком-либо воздействии на нее функционируют не одновременно. С повышением специфической нагрузки - возрастает количество компонентов, участвующих в реализации ее функций; при снижении - число активно функционирующих элементов иммунной системы сокращается (Михайленко А.А. и соавт., 2000). Указанный принцип реализован в наших экспериментах. Динамика коэффициентов корреляции IGG /IGM с 0,24 до 0,49 и IGA /IGM с 0,35 до 0,51 показывает тенденцию к усилению взаимосвязи иммунологических показателей с увеличением срока стельности.
Корреляция между показателями циркулирующего IGG и местно секретируемого IGA (r=0,76) характеризует высокую степень сопряженности этих классов иммуноглобулинов у стельных коров.
Анализ взаимосвязи основных изотипов иммуноглобулинов в периферической крови овец в онтогенезе
Для оценки состояния иммунной системы (ИС) определяют количественные и функциональные показатели ее структурных компонентов. Но значения этих показателей, ввиду индивидуальной вариабельности, не всегда отражают нормальное состояние иммунной системы. Так уровень иммуноглобулинов у животных подвержен значительным колебаниям, обусловленным возрастом, полом, генетическими особенностями, внешними факторами, различными периодами онтогенеза, например, периодом плодоношения и лактации. Вместе с тем, различные компоненты ИС могут компенсировать функции друг друга, изменяя тем самым значения показателей, соответствующих статистическому определению нормального состояния иммунной системы.
В связи с этим, появляется проблема определения статистической нормы для показателей иммунного статуса. Измерять ли средние величины и возможные отклонения для каждого возраста, породы животного, периода онтогенеза, места обитания или охарактеризовать в динамике взаимосвязи основных иммунологических показателей, необходимых для нормального функционирования иммунной системы.
По нашему мнению, для адекватной оценки иммунного статуса животных, а также механизма формирования поствакцинального иммунного ответа, необходимо использовать как традиционное определение нормы, так и корреляционный анализ взаимосвязей между показателями уровня IGSF. Одной из основных характеристик состояния иммунной системы является уровень иммуноглобулинов в периферической крови. Положительная корреляция уровней сывороточных иммуноглобулинов G и M в периферической крови человека, служит критерием нормального функционирования иммунной системы и ее адаптивных возможностей при различных физиологических состояниях организма.
На примере определения коэффициента корреляции между количественными показателями иммуноглобулинов обосновывается диагностический критерий для оценки нормального состояния иммунной системы у овец. В эксперименте использовали образцы периферической крови и носовых секретов овец. При проведении эксперимента животные были разделены на две группы, сформированных по принципу аналогов. Первая группа состояла из овец (№1-5) романовской породы в возрасте 5 лет. Вторая группа (№6-10) из овец в период 4-5 мес. суягности и последующей лактации. В третью группу (n=5) вошли ягнята, родившиеся от овец второй группы. Образцы крови и носовых секретов брали однократно в середине месяца в течение 10 месяцев у овец и 6 месяцев у ягнят. У животных определяли количество иммуноглобулинов M, G, A в сыворотке крови и концентрацию IGA в носовом секрете методом радиальной иммунодиффузии.
В результате проведенных исследований в первой группе животных отмечалась положительная корреляционная связь между показателями концентрации иммуноглобулинов изотипов G и М (r=0,29), М и А (r=0,1) слабой силы, а между IGG и IGA - средней силы (r=0,5). Слабая связь также наблюдалась между уровнями IGM в сыворотке крови и секреторного IGA (SIGA) в носовом секрете. Слабая отрицательная корреляция установлена между количеством сывороточных IGG и IGA, и уровнем SIGA.
Изучение спектра основных изотипов сывороточных иммуноглобулинов в первой группе овец подтверждает их взаимосвязь в процессе функционирования. Отсутствие корреляции между уровнями IGA в сыворотке крови и носовом секрете, как в первой, так и во второй группе животных, показывает относительную независимость системного и местного иммунитета.
Вторая группа животных представлена овцами в период поздней суягности и лактации. Как видно из данных таблицы 5, корреляция между показателями сывороточных иммуноглобулинов не отличаются от коэффициентов корреляции у овец первой группы. Таким образом, зависимость между количественными показателями циркулирующих Ig изотипов G, M и A у клинически здоровых животных, в том числе в период суягности и лактации, является конституционной и выражается положительным значением коэффициента корреляции.
Однако, коррелятивная связь между сывороточными Ig и секреторными IGA отсутствует у животных первой группы, а у овец второй группы коэффициент корреляции между IGM и SIGA (r=0,49*±0,02) свидетельствует о средней степени сопряженности этих показателей.
Таблица 5. Коэффициенты корреляции между количественными показателями иммуноглобулинов в крови и носовых секретах у овец (n=10)
Появление коррелятивной связи данных показателей перед родами и в течение лактации, свидетельствует о большем функциональном напряжении иммунной системы в этот период за счет необходимости включения большего количества ее структурных компонентов. В лактационный период данные Ig передаются с молозивом и молоком новорожденному ягненку и являются первым иммунным барьером на пути проникновения антигена в его организм. SIGA и SIGM присутствуют на поверхности слизистых оболочек, блокируя первую фазу прилипания энтеропатогенных бактерий к энтероцитам, маскируя поверхностные рецепторы этих клеток. Данные иммуноглобулины являются протективными изотипами иммунной системы слизистых оболочек. Механизм иммунного исключения является основным при защите слизистых оболочек от внешних антигенов.
Также колостральные, абсорбированные IGA и IGM поступают в системную циркуляцию новорожденных, способствуют нейтрализации бактериальных энтеротоксинов и энтеротропных вирусов и оказывают агглютинирующее действие на большое количество энтеропатогенных микроорганизмов.
По нашему мнению, средняя степень сопряженности показателей IGM в сыворотке крови и SIGA в носовом секрете у овец в период лактации подтверждает их важную роль в защите молодого организма от широко распространенных патогенов в первые 6 месяцев жизни.
В таблице 6 представлены данные о корреляции уровней основных изотипов иммуноглобулинов у ягнят в первые 6 месяцев жизни, полученных от овец второй группы. Установлена положительная корреляция между уровнями IGG и IGM (r=0,67), что подтверждает теорию корреляционных констант, являющиеся обязательным условием адекватного функционирования иммунной системы. Отсутствие данной корреляции или смена ее направленности показывает неустойчивое состояние ИС и возможность ее функционального срыва.
Таблица 6. Коэффициенты корреляции между количественными показателями иммуноглобулинов в крови и носовых секретах у ягнят.
Различные по направленности и величине коэффициенты корреляции между уровнями IGG и IGA, IGM и IGA, IGM и SIGA, IGA и SIGA свидетельствуют о нестабильности иммунной системы у молодых животных в данный период. Это может быть связано с механизмами индивидуального процесса развития и формирования иммунореактивности организма. Отрицательная корреляция между концентрациями IGG в сыворотке крови и секреторного IGA показывает относительную независимость системного иммунитета и иммунной системы слизистых оболочек.
На основании корреляционного анализа уровней основных изотипов иммуноглобулинов у клинически здоровых животных на различных этапах онтогенеза показана устойчивая корреляция между иммуноглобулинами G и М у всех исследуемых групп животных. Этот показатель может служить диагностическим критерием для оценки здоровья животного и качества иммунопрофилактики, так как изменение направленности корреляции между IGM-антителами первичного и IGG-антителами вторичного иммунного ответа является признаком нарушения иммунореактивности организма.
Представленные данные позволяют наметить перспективные пути в направлении поиска новых устойчивых корреляционных взаимосвязей между иммунологическими показателями с целью понимания механизмов, регулирующих работу иммунной системы животных.
Формы локализации SIG-рецепторов В-лимфоцитов в периферической крови коров и овец
В онтогенезе дифференцировка в зрелые Т- и В-клетки сопровождается изменением фенотипа поверхности лимфоцита, определяемого с помощью моно- и поликлональных антител методами иммуноцитохимии. Так экспрессия CIGM на поверхность клетки играет решающую роль в В-клеточном онтогенезе. Модуляция количества SIG или блокировка их антителами приводит к изменению характера иммунных реакций, поскольку именно SIG связывают антиген на поверхности В-лимфоцита для дальнейшего его процессирования в эндосомах и представления Т-клеткам.
В рамках исследования механизмов клеточной активации в процессе онтогенеза изучены формы локализации SIG на поверхности В-клеток в крови у телят и коров. В опытах использовали кровь крупного рогатого скота черно-пестрой породы в возрасте 4-5 лет.
Иммунопероксидазное окрашивание клеток позволяет определить количество SIG-клеток, изучить модуляцию рецепторного аппарата в процессе дифференцировки В-лимфоцита в плазматическую клетку.
Исследование форм локализации SIG представляет теоретический и практический интерес (Новиков В.В., 2007). Анализ литературных данных по изучению поверхностных рецепторов клеток показал, что под влиянием различных факторов, в том числе патогенных микроорганизмов, изменяется локализация рецепторов на поверхности клетки. По перераспределению рецепторов на мембране клетки можно судить о способности связывать антигены, т.е. характеризовать функциональную активность лимфоцита. (Артюхов В.Г.и др., 2006).
Изменение локализации рецепторов, их перераспределение в мембране, определяет роль В-лимфоцита, как антигенпредставляющей клетки в иммунном ответе. Поверхностные Ig взаимодействуя с антигеном, посредством эндоцитоза включают его в цитоплазматический компартмент, где он подвергается деградации.
В результате проведенных исследований нами установлено, что В-клетки в крови коров с окрашенной мембраной в форме «петч»/эндоцитоз составляют 68,9±3,9%, «петч» (неравномерное распределение SIG по периметру клетки) - 15,0±3,3%, «ринг» (равномерное распределение SIG по периметру клетки) - 10,5±3,3%, «кэп» - 5,6±1,9%. («кэппинг» - эффект - скопление SIG на одном из полюсов клетки) (рис. 9)
Следовательно, можно сделать вывод, что петч-эндоцитоз, а именно, перераспределение Ig - рецепторов в мембране с их погружением в цитоплазму клетки, является основным механизмом контроля поверхности В-лимфоцитов, т.е. таким образом, происходит считывание информации о микроокружении клетки.
Также при иммуноцитохимическом анализе в крови обнаружены клетки с цитоплазматическими I. Эти клетки не окрашиваются по периметру клетки, т.е. мембранные иммуноглобулины отсутствуют. Вероятно, что CIG-клетки являются плазматическими клетками, секретирующими IGG.
Таким образом, установлено, что в крови овец в возрасте одного года присутствуют В-клетки на разных стадиях дифференцировки.
В результате проведенных исследований показана возможность использования иммунопероксидазного метода для определения форм локализации Ig-рецепторов и количества В-лимфоцитов крупного рогатого скота и овец.
SIGM-клетки и IGM-антитела в развитии иммунной системы у телят
Важной задачей наших исследований являлась разработка специфичного метода для количественного определения В-лимфоцитов крупного рогатого скота и изучения механизма дифференцировки лимфоцитов из общей лимфоидной клетки-предшественницы, поскольку первыми IGSF, появляющимися в цитоплазме В-клетки, являются тяжелые цепи IGM (?-цепи). Распределение IGM в В-лимфоцитах крови у телят в возрасте 1 мес. определяли методом иммунопероксидазного окрашивания с использованием в качестве первых антител МКА к IGM крупного рогатого скота. Уровень иммуноглобулинов в сыворотке крови определяли методом простой радиальной иммунодиффузии по Манчини, используя для определения IGG и IGA моноспецифические антисыворотк
Список литературы
1. Ездакова И.Ю. Рецепторы иммунного узнавания у животных /И.Ю. Ездакова. - М.: Компания Спутник , 2008. - 88 с.: ил.; Библиогр.:с. 72-73. - 500 экз. - ISBN 978-5-364-01149-7.
2. А.с. 1560549 СССР. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus.musculus, используемый для получения моноклональных антител к IGM рогатого скота / Федоров Ю.Н., Сологуб В.К., Феоктистова Т.А., Ездакова И.Ю. и др. - №4229427; заявл. 15.04.87; опубл. 3.01.90.
3. Оценка естественной резистентности сельскохозяйственных животных: методические рекомендации /П.Н. Смирнов, М.И. Гулюкин, Ю.Н. Федоров,… И.Ю. Ездакова… и др. - Россельхозакадемия, Сиб. отд-ние, ГНУ ИЭВС и ДВ, ГНУ ВИЭВ, ФГОУ НРИПК АПК МСХ РФ, НГАУ. - Новосибирск, 2003. - 32 с.
4. Пат. 2277421 Российская Федерация, МПК А61К 35/12, А61К 35/20. Способ получения секреторного иммуноглобулина А из молозива рогатого скота / Федоров Ю.Н., Ездакова И.Ю., Чеботарева Т.А.; заявитель и патентообладатель ГНУ ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко. - №2005109539/15; заявл. 05.04.05; опубл. 10.06.06, Бюл. №16.-5 с.
5. Пат. 2288008 Российская Федерация, МПК А61К 39/395, А61К 35/12. Способ получения секреторного иммуноглобулина А из биологической жидкости животных / Федоров Ю.Н., Ездакова И.Ю., Чеботарева Т.А.; заявитель и патентообладатель ГНУ ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко. - №2005109538/15; заявл. 05.04.05; опубл. 27.11.06, Бюл. №33.-4 с.
6. Федоров Ю.Н. Методические рекомендации по количественному определению и оценке функциональной активности иммунокомпетентных клеток животных / Федоров Ю.Н., Ездакова И.Ю. // Сборник «Новые методы исследований по проблемам ветеринарной медицины». - 2008. - 4. - С. 144-158
7. Пат. 2293330 Российская Федерация, МПК G01N 33/53. Способ определения антител/ Ездакова И.Ю.; заявитель и патентообладатель ГНУ ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко. - №2005120538/15; заявл. 04.07.05; опубл. 10.02.07, Бюл. №4.-5 с.
8. Определение специфичности моноклональных антител к отдельным классам иммуноглобулинов крупного рогатого скота и свиньи методом «вестерн-блоттинга»/ Верховский О.А., Федоров Ю.Н., Феоктистова Т.А., Ездакова И.Ю. и др. // Сельскохозяйственная биология. - 1993. - №6. - С. 135-141.
9. Использование моноклональных антител для оценки антигенных свойств иммуноглобулинов животных / Верховский О.А., Федоров Ю.Н., Сологуб В.К. Феоктистова Т.А., Федорова И.П., Ездакова И.Ю. // Сельскохозяйственная биология. - 1995.- №4.-С. 94-99.
10. Изотипспецифические антителосекретирующие клетки у мышей в процессе иммуногенеза. /Жаданов А.И., Ездакова И.Ю., Верховский О.А., Федоров Ю.Н. // Ветеринария. - 2000. - №11. - С. 22-26.
11. Кинетика синтеза различных типов антителосекретирующих клеток костного мозга мышей в процессе иммуногенеза / Федоров Ю.Н., Верховский О.А., Жаданов А.И., Ездакова И.Ю. // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2000.- №5.-С. 42-44.
12. Ездакова И.Ю. Динамика количества Т-клеток и их взаимодействие с антигенпредставляющими клетками в процессе иммунного ответа / Ездакова И.Ю., Федоров Ю.Н., Жаданов А.И. // Цитология. - 2001. - Т. 43. - №9- С. 858.
13. Количественное определение иммуноглобулинов А-класса в биологических жидкостях крупного рогатого скота методами иммуноферментного анализа и радиальной иммунодиффузии / Ездакова И.Ю., Борзенко Е.В., Феоктистова Т.А., Федоров Ю.Н. // Сельскохозяйственная биология. - 2002.- №2.-С. 118-122.
14. Ездакова И.Ю. Влияние Trypanosoma sp. на иммунокомпетентные клетки серебряного карася /Ездакова И.Ю., Борисова М.Н., Дьяконов Л.П. // Ветеринария. - 2005.- №12.-С. 28-31.
15. Ездакова И.Ю. Влияние зимозана на клетки крови серебряного карася (Carassius auratus gibelio)/ Ездакова И.Ю., Борисова М.Н. // Ветеринарная патология. - 2007.- №2. - С. 205-207.
17. Ездакова И.Ю. Изучение морских млекопитающих - новое направление экологической иммунологии / Ездакова И.Ю., Соколова О.В. // Веткорм. - 2008.- №4. - С. 14-15.
21. Ездакова И.Ю. Динамика SIGM-клеток и IGM-антител в периферической крови коров в период плодоношения / Ездакова И.Ю. // Аллергология и иммунология. - 2009. - Т. 10. - №2.-С. 295.
22. Ездакова И.Ю. Взаимосвязи между основными изотипами иммуноглобулинов у овец/ Ездакова И.Ю., Степнова С.Н. // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2010. - №5.-С. 44-47 (Russian agricultural science. - 2010. - Vol.36. - №5).
23. Иммуноферментный метод количественного определения IGA-изотипа в биологических жидкостях крупного рогатого скота / Феоктистова Т.А., Ездакова И.Ю., Федоров Ю.Н., Борзенко Е.В. // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: Сб. науч. тр. - Щелково: ВНИИТИБП. - 2000. - C. 279-281.
24. Разработка и совершенствование методов оценки В-системы иммунитета у животных / Верховский О.А., Феоктистова Т.А., Федоров Ю.Н, Ездакова И.Ю. и др. // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: Сб. науч. тр. - Щелково: ВНИИТИБП. - 2000. - C. 273-275.
25. Quantitation of total IGG-, IGM-, and IGA-secreting cells in mice immunized with live erysipelas vaccine and challenged with the virulent strain of Erysipelothrix rhusiopathiae/ Fedorov Yu.N., Zhadanov A.I., Verkhovsky O.A., Ezdakova I. Yu. //Sixth International Veterinary Immunology Symposium: Abstracts book. - 2001. - 206. - Р.174.
26. Количественная характеристика иммуноглобулинов А-класса в биологических жидкостях крупного рогатого скота методами иммунохимического анализа /Борзенко Е.В., Ездакова И.Ю., Федоров Ю.Н., Феоктистова Т.А. // Труды ВИЭВ. - 2003. - Т. 73. - С. 217-221.
27. Ездакова И.Ю. Оценка иммуномодулирующей активности вакцины против рожи свиней (ВР-2) в процессе иммуногенеза / Ездакова И.Ю., Федоров И.Ю., Третьякова И.В. // Труды ВИЭВ. - 2003. - Т.73. - С. 200-204.
28. Моноклональные антитела к иммуноглобулинам класса А рогатого скота: получение, характеристика, применение / Феоктистова Т.А., Федоров Ю.Н., Ездакова И.Ю., Сологуб В.К. // Труды ВИЭВ. - 2003. - Т. 73. - С. 197-200.
29. Ездакова И.Ю. Динамика показателей клеточного иммунитета при введении препаратов с иммунотропной активностью / Ездакова И.Ю., Третьякова И.В. // Материалы Международной учебно-методической и научно-практической конференции, посвященной 85-летию МГАВМ и Б им. К.И. Скрябина. - М: МГАВМИБ. - 2004.-С. 190-194.
30. Влияние иммунотропных препаратов на иммуногенез при вакцинации. / Ездакова И.Ю., Федоров Ю.Н., Ханис А.Ю., Боряев Г.И. // «Ветеринарная биотехнология: настоящее и будущее»: Сб.науч. тр. - Щелково: ВНИИТИБП. - 2004. - С. 47-52.
31. Sokolova O.V. Adaptive changes of the serum immunoglobulins level in the black sea bottlenose dolphin (Tursiops truncates)/ Sokolova O.V., Denisenko T.E., Ezdakova I. Yu. // Marine Mammals and man in coastal ecosystem: Can they coexist?: Abstracts book.-Gdynia:ECS. - 2006. - P.180.
32. Ездакова И.Ю. Динамика мембранных s-Ig лимфоцитов мышей в процессе иммуногенеза /Ездакова И.Ю. // «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных»: Сб. науч. тр.-М:ВИЭВ. - 2006. - С. 472-474.
33. Ездакова И.Ю. Фагоцитарная активность иммунокомпетентных клеток серебряного карася / Ездакова И.Ю. // «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных»: Сб. науч. тр.-М:ВИЭВ. - 2006. - С. 475-477.
34. Ездакова И.Ю. Выявление иммуноглобулинов на мононуклеарных клетках лимфоидных органов мышей / Ездакова И.Ю. // «Актуальные проблемы ветеринарии в современных условиях»: Сб. науч. тр.-Краснодар. - 2006. - С. 400-403.
35. Ездакова И.Ю. Определение уровня адгезивной активности лимфоцитов периферической крови крупного рогатого скота / Ездакова И.Ю. // «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов»: Сб. науч. тр. - Щелково: ВНИИТИБП. - 2006. - С. 157-160.
36. Ездакова И.Ю. Изучение иммунного статуса лабораторных мышей под влиянием пробиотиков / Ездакова И.Ю., Субботин В.В. // «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов»: Сб. науч. тр. - Щелково: ВНИИТИБП. - 2006. - С. 182-187.
37. Данилевская Н.В. Фармакологические эффекты пробиотика Лактобифадол при его назначении глубокостельным коровам / Данилевская Н.В., Ездакова И.Ю., Кудинов В.В. // Веткорм. - 2006.- №6. - С. 24-25.
38. Ездакова И.Ю. Динамика иммунокомпетентных клеток в процессе иммунного ответа на Т-независимые и Т-зависимые антигены / Ездакова И.Ю. // Ветеринарная медицина. - 2007.- №1.-С. 11-12.
40. Ездакова И.Ю. Поверхностные иммуноглобулины В-клеток крови крупного рогатого скота / Ездакова И.Ю. // Ветеринарная медицина. - 2007.- №4.-С. 11-13.
41. The cross-reactivity of the blood serum albumens from Steller sea lion pups (EUMETOPIAS JUBATUS) / Ezdakova I. Yu., Sokolova O.V., Denisenko T.E., Burkanov V.N. // Marine mammals in time: past, present and future: Abstract book.-Egmond aan Zee:ECS - 2008. - P. 191-192.
42. The Ladoga ringed seal (Pusa hispida ladogensis) as a species - indicator of the influence of global warming on the wild population of the marine mammals/ Sokolova O.V., Lisitsina T. Yu., Ezdakova I. Yu., Denisenko T.E. // Marine mammals in time: past, present and future: Abstract book. - Egmond aan Zee:ECS. - 2008. - P. 151-152.
43. Ездакова И.Ю. Иммуноцитохимический метод определения В-лимфоцитов / Ездакова И.Ю. // «Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел»: Сб. науч. тр.-М:ВИЭВ. - 2008. - С. 329-332.
44. Ездакова И.Ю. Динамика адгезивной активности перитонеальных макрофагов мышей при вакцинации/ Ездакова И.Ю. // Труды ВИЭВ. - 2009. - Т. 75. - С. 235-238
45. Ездакова И.Ю Фагоцитарная активность клеток крови рыб семейства карповых / Ездакова И.Ю., Дьяконов Л.П. // Труды ВИЭВ. - 2009. - Т. 75. - С. 239-241
Размещено на .ru
Вы можете ЗАГРУЗИТЬ и ПОВЫСИТЬ уникальность своей работы
