Генотипові та фенотипові ознаки вірулентності вірусів ЕСНО - Автореферат

На сучасному етапі серед ентеровірусів набувають великого значення в підтримці епідемічного процесу віруси ЕСНО (Enteric cytopathogenic human orphan). У літературі є повідомлення про визначення нових властивостей вірусів ЕСНО: доведена здатність вірусів ЕСНО-11 та 19 викликати увеїти та некроз печінки з блискавичним перебігом, що закінчується летально (Лашкевич В.А., Королева Г.А., 2005, Лукашев А.Н., 2007). Зясувати сорбційні властивості вірусів ЕСНО на бентоніті, з урахуванням типу вірусу. вірулентність вірус мутаційний нуклеотид Вперше встановлено актуальні в епідеміологічному плані типи вірусів ЕСНО, які циркулюють на території України, а саме віруси ЕСНО 3,6,11,13,24,30 типів. Дисертантом самостійно проведено ідентифікацію вірусів ЕСНО, визначення сорбційної здатності виділених вірусів до бентоніту та придатність використання маркеру rct40, полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР), ампліфікацію геному вірусів ЕСНО та гену vp1 штамів вірусів ЕСНО 6 типу, передсіквенсову обробку РНК вірусів ЕСНО, підбір і одержання праймерів для секвенування фрагменту геному, безпосередньо секвенування гену vp1, вирівнювання отриманих хроматограм, а також порівняння результатів секвенування за допомогою програм “Omiga”, “Vector NTI” з прототипними штамами вірусів ЕСНО 6 типу Charles і Lytic та між собою.Доведено, що вірусам ЕСНО притаманна дисоціація за бентонітовим генетичним маркером після їх репродукції в культурі клітин з утворенням двох популяцій, одна з яких сорбується на бентоніті (Абент ), інша - не сорбується (Абент-). Встановлено, що серед досліджених перещеплювальних культур клітин RD, HEP-2, Vero найбільшу чутливість до вірусів ЕСНО проявляла лінія RD. Визначено придатність використання маркеру rct40 для диференціації авірулентних і вірулентних штамів вірусів ЕСНО при культивуванні їх на лінії НЕР-2. При досліджені нуклеотидних послідовностей гену vp1 штамів вірусів ЕСНО 6 типу, встановлено 13 точкових мутаційних замін у штамів, виділених від здорових осіб, у порівнянні зі штамами, виділеними від хворих осіб. Штами вірусів, виділені від хворих осіб з асептичним менінгітом, переважно мають маркер Абент-(63,16 % штамів), штами, виділені від здорових осіб - маркер Абент (66,67 % штамів).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У дисертаційній роботі розвязано актуальне наукове завдання - диференціація вірусів ЕСНО за вірулентністю з використанням генотипових та фенотипових маркерів вірулентності. Вперше встановлено епідеміологічно актуальні типи вірусів ЕСНО, які циркулюють на території України. Доведено, що вірусам ЕСНО притаманна дисоціація за бентонітовим генетичним маркером після їх репродукції в культурі клітин з утворенням двох популяцій, одна з яких сорбується на бентоніті (Абент ), інша - не сорбується (Абент-). Встановлено, що серед досліджених перещеплювальних культур клітин RD, HEP-2, Vero найбільшу чутливість до вірусів ЕСНО проявляла лінія RD. Визначено придатність використання маркеру rct40 для диференціації авірулентних і вірулентних штамів вірусів ЕСНО при культивуванні їх на лінії НЕР-2. При досліджені нуклеотидних послідовностей гену vp1 штамів вірусів ЕСНО 6 типу, встановлено 13 точкових мутаційних замін у штамів, виділених від здорових осіб, у порівнянні зі штамами, виділеними від хворих осіб. Визначення даних мутацій запропоновано використовувати як молекулярний маркер для генотипової диференціації вірусів.

Створена колекція вірусів ЕСНО 3, 6, 11, 13, 24, 30 типів, що циркулюють на території України. Паралельно охарактеризовані фенотипові і генотипові характеристики 18 штамів, виділених від здорових осіб та 19 штамів - від хворих осіб. На основі одержаних результатів розроблені критерії диференціації авірулентних і вірулентних штамів.

Доведено, що вірусам ЕСНО після репродукції вірусів в культурах клітин притаманна дисоціація на дві популяціі після сорбції на бентоніті. Штами вірусів, виділені від хворих осіб з асептичним менінгітом, переважно мають маркер Абент- (63,16 % штамів), штами, виділені від здорових осіб - маркер Абент (66,67 % штамів). Особливо чітко ця ознака виявляється для вірусів ЕСНО 6 і 30 типів, які є найбільш актуальними в епідемічному відношенні.

Серед досліджених перещеплювальних культур клітин (HEP-2, RD, Vero) найбільшу чутливість до вірусів ЕСНО проявляла лінія RD. Інфекційна активність штамів, виділених від хворих, виявилася більшою у порівнянні зі штамами виділеними від здорових осіб.

Визначено придатність маркеру rct40 для диференціації вірулентних і авірулентних штамів вірусів ЕСНО за умов використання культури клітин НЕР-2. Показано, що серед вірусів ЕСНО, виділених від здорових осіб переважають штами з характеристикою rct40- (72,22 %), серед штамів, виділених від хворих- rct40 (73,68 %). Найбільш придатним цей маркер виявився для диференціації вірулентності вірусів ЕСНО 6 та 30 типів.

При порівняльному вивченні шляхом секвенування нуклеотидної послідовності гену vp1 штамів вірусів ЕСНО 6 типу, виділених від здорових та хворих осіб, виявлено 13 точкових мутацій. Для штамів, виділених від здорових осіб, в позиціях нуклеотидної послідовності №№ 2494, 2549, 2574, 2577, 2605, 2621, 2622, 2626, 2638, 2663, 2686, 2787, 2916 характерні нуклеотиди T, C, A, A, C, G, T, G, T, T, C, T, T. Для штамів, виділених від хворих осіб, у вище зазначених позиціях, характерні нуклеотиди C, T, G, G, T, A, С, A, C, A, T, C, A.

Гриценко Л.М. Порівняльна чутливість перещеплювальних клітинних культур до вірусів ЕСНО / Л.М.Гриценко // Сучасні аспекти військової медицини. - 2010. - вип.16. - С. 73 - 76.

Гриценко Л.М. Генетичний аналіз вірусів ЕСНО 6 типу, ізольованих на території України / Л.М.Гриценко, В.П.Широбоков // Військова медицина. - 2009. - т.9, № 1. - С. 54 - 56. (* - проведення секвенування вірусів ЕСНО 6 типу для вивчення генетичних ознак вірулентності, підготовка статті до публікації).

Гриценко Л.М. Фенотипові та генетичні ознаки вірулентності вірусів ЕСНО, ізольованих на території України / Л.М.Гриценко, В.П.Широбоков // Клінічна фармація. - 2008. - т. 12. - № 4. - С. 40 - 42. (* - проведення лабораторних досліджень по вивченню генетичних та фенотипових ознак вірулентності вірусів ЕСНО, підготовка статті до публікації).

Гриценко Л.М. ЕСНО-вірусні внутрішньотипові маркери вірулентності / Л.М.Гриценко // Актуальні проблеми сучасної медицини - 2008. - т. 8, вип. № 4/ 24.- С. 159-160.

Гриценко Л.М. Вірусологічні та епідеміологічні аспекти ЕСНО-вірусної інфекції / Л.М. Гриценко // Актуальные проблемы медицины и биологии. - 2007. - т. 35. - № 2. - С. 127 - 133.

Доан С.І. Серопейзаж циркулюючих ентеровірусів в Україні / С.І. Доан, Л.М. Гриценко, В.І.Задорожна, В.П.Широбоков // Актуальные проблемы медицины и биологии. - 2005. - т. 33. - № 1. - С. 97 - 122. (* - лабораторні дослідження з встановлення маркерів вірулентності вірусів ЕСНО, підготовка статті до друку).

Бондаренко В.І. Гострі вялі паралічі в Україні у 1999 році / В.І.Бондаренко, В.І.Задорожна, Е.А.Лауген, Н.Л.Зубкова, С.І.Доан, Л.М.Гриценко, Т.О.Бура, І.Л.Маричев // Дитячі інфекції. Українська міжвідомча збірка. - Київ, 2001.- Вип. 28. - С.100 - 104. (* - проаналізовані результати даних ролі неполіомієлітних ЕВ у виникненні гострих вялих паралічів у 1999 р., статистична обробка результатів, підготовка до друку).

Задорожна В.І. Серозні менінгіти ентеровірусної етіології / В.І.Задорожна, В.Ю.Мартинюк, Л.М.Мухарська, Л.М.Гриценко, І.Л.Маричев, В.В.Торбенко, Н.Л.Зубкова, С.І.Доан, Т.О.Бура, Л.І.Єктова, В.В.Куцева // Український медичний альманах. - 2000. - т.3, № 2. - С.56 - 60. (* - проаналізовано та статистично оброблені дані спалахів серозних менінгітів на Україні, оформлення статті до друку).

Задорожна В.І. Захворюваність на ентеровірусні інфекції населення різних вікових груп / В.І.Задорожна, В.І.Бондаренко, К.І.Ліпатнікова, Т.О.Бура, С.І.Доан, Н.Л.Зубкова, Л.М.Гриценко // Дитячі інфекції. Українська міжвідомча збірка - 1999. - Вип. 26. - С.140-145 (* - узагальнено дані щодо розповсюдженості ЕВ інфекції населення, статистична обробка результатів, оформлення статті до друку).