Особливості морфогенезу при культивуванні недостиглих зародків ярого ячменю, оптимізація умов. Генетичний контроль морфогенезу в культурі недостиглих зародків, оцінка ознаки "регенерація рослин". Особливості андрогенезу в культурі пиляків ячменю.
При низкой оригинальности работы "Генотипові особливості морфогенетичних реакцій в культурі тканин ячменю", Вы можете повысить уникальность этой работы до 80-100%
Оскільки реалізація складних ознак, до яких відносять і здатність до регенерації, знаходиться в сполученій взаємозалежності з експресією інших кількісних ознак організму, то при їх вивченні надто важливим є зясування структурної системи кореляції, зумовленої генотиповими особливостями. Робота виконувалася в період з 1996 р. по 2001 р. в лабораторії біотехнології відділу генетики Селекційно-генетичного інституту - Національного центру насіннєзнавства та сортовивчення УААН, та в лабораторії культури тканин Південного біотехнологічного центру у рослинництві УААН та МОН у рамках Державної науково-технічної програми 03.04-МВ/322-97 “Теоретичні основи селекції та насінництва сільськогосподарських культур”, затвердженої Міністерством України в справах науки і технологій, науково-технічної програми УААН “Біотехнологія культурних рослин. Вперше проведено вивчення впливу ряду маркерних генів ячменю на здатність до морфогенезу в культурі недостиглих зародків і пиляків. На основі порівняльного вивчення морфогенетичних реакцій в культурі недостиглих зародків ізогенних ліній сорту Одеський 100 вперше показано вплив мутації в гомеобокс-гені ячменю на здатність до регенерації в умовах in vitro. Генотип визначає кількісні відмінності за здатністю до регенерації, тоді коли спрямованість регенераційних процесів залежить від стадії розвитку експлантів та умов вирощування рослин-донорів.При доданні до живильного середовища для індукції калюсу 16 мг/л 2,4-Д пригнітити проростання цілком не вдалося, але практично у всіх експлантів (поза залежності від генотипу) ріст пагона супровождувався формуванням пухкого первинного калюсу, утвореного подовженими вакуолізованими клітинами. Вивчення впливу сольового складу живильного середовища на індукцію калюсогенезу та регенерації показало, що на середовищі Гамборга В5 маса неморфогенного щиткового калюсу перевершувала аналогічний показник на середовищі MS. Як показали гістологічні дослідження, проростання експлантів на середовищі для індукції калюсу призводило до формування у основі проростка вузла кущіння, і в подальшому меристеми кущіння були джерелом регенерації. Серед ізогенних ліній сорту Одеський 100 найбільшою здатністю до морфогенезу in vitro відзначалася фуркатна (К) лінія: цей генотип достовірно перевершував контрольну лінію як за частотою утворення морфогенних культур, так і за показником регенерації рослин (табл. Ми вважаємо, що підвищена регенераційна здатність, яка спостерігається в культурі недостиглих зародків фуркатної лінії сорту Одеський 100, як і підвищена в порівнянні з контрольним генотипом здатність до кущіння в польових умовах, є результатом підвищеної експресії гена Hvknox3 внаслідок дуплікації в інтроні даного гена, яка звичайно асоціюється з мутацією фуркатності.У популяції сортів та ліній ярого ячменю, що вивчалися, ківлькісні відмінності за здатністю до індукції регенераційних процесів при культивуванні недостиглих зародків і пиляків обумовлені генотипом рослини-донора. В запропонованих нами умовах культивування недостиглих зародків ячменю (MS з доданням 16 мг/л 2,4-Д та 1 г/л гідролізату казеїну для індукції калюсу, та середовище MS з доданням 6 мг/л 2,4-Д, 1 мг/л ХФО та 1 г/л гідролізату казеїну для проліферації калюсу) регенерація рослин здійснюється внаслідок проліферації меристем експлантів; при цьому спостерігається як прямий органогенез, так і регенерація з морфогенного калюсу шляхом стеблового морфогенезу і соматичного ембріогенезу. Зародки розміром 1 - 1,7 мм знаходяться в оптимальній стадії розвитку для індукції морфогенного калюсу з меристематичних осередків експланта, проте межі оптимуму можуть змінюватися залежно від умов вирощування рослин донорів. Оптимізовано умови одержання морфогенного калюсу та регенерації рослин при культивуванні ізольованої щиткової тканин (середовище Гамборга В5 з доданням 1 мг/л 2,4-Д та 30 г/л мальтози, освітлення 2 клк). У практиці масового одержання регенерантів у культурі недостиглих зародків ячменю пропонується використовувати середовище MS з доданням 16 мг/л 2,4-Д та 1 г/л гідролізату казеїну з подальшим переносом калюсних культур на середовище MS з доданням 6 мг/л 2,4-Д, 1 мг/л ХФО та 1 г/л гідролізату казеїну.
Вывод
Вивчення особливостей морфогенезу при культивуванні недостиглих зародків ярого ячменю
Для оптимізації умов культивування недостиглих зародків ячменю провели вивчення впливу гормонального та сольового складу живильного середовища на морфогенетичні реакції експлантів. При висадженні зародків розміром 1-2 мм на середовище MS з доданням 1-5 мг/л 2,4-Д, а також ІМК, ІОК та ХФО в різних концентраціях, експланти активно проростали без формування калюсу. При доданні до живильного середовища для індукції калюсу 16 мг/л 2,4-Д пригнітити проростання цілком не вдалося, але практично у всіх експлантів (поза залежності від генотипу) ріст пагона супровождувався формуванням пухкого первинного калюсу, утвореного подовженими вакуолізованими клітинами. На середовищі MS первинний калюс формувався в основі зародкової осі та з колеоризи, щиток при цьому некротизувався. В той же час на середовищі Гамборга В5 клітини щитка брали активну участь в утворенні первинного калюсу, який не проявляв в подальшому здатність до морфогенезу. В окремих випадках на поверхні або на краях щитка експлантів, розміщених на середовищі Гамборга В5, формувався щільний компактний калюс кремового забарвлення, здатний до регенерації шляхом соматичного ембріогенезу. Вивчення впливу сольового складу живильного середовища на індукцію калюсогенезу та регенерації показало, що на середовищі Гамборга В5 маса неморфогенного щиткового калюсу перевершувала аналогічний показник на середовищі MS. Оскільки на середовищі MS експланти проростали не так інтенсивно, як на середовищі Гамборга В5, а показники регенерації були вищими, для подальших експериментів ми використовували сольову основу MS.
Як показали гістологічні дослідження, проростання експлантів на середовищі для індукції калюсу призводило до формування у основі проростка вузла кущіння, і в подальшому меристеми кущіння були джерелом регенерації. При цьому спостерігався як прямий органогенез, так і формування внаслідок клонування клітин меристематичного типу морфогенного калюсу. В подальшому такий калюс проявляв здатність до стеблового морфогенезу, а також до регенерації шляхом соматичного ембріогенезу.
Зрушення морфогенетичних реакцій в тому чи іншому напрямку залежало від розміру експланта і умов вирощування рослин-донорів. Так, в умовах 1997 року утворення морфогенного калюсу та регенерація з нього найчастіше відбувалися в культурі зародків розміром 1-1,7 мм. При культивуванні експлантів довжиною понад 2 мм спостерігався переважно прямий органогенез. Незначне проростання експлантів на середовищі для індукції калюсу стимулювало утворення морфогенного калюсу, тоді коли при більш інтенсивному проростанні також спостерігався переважно прямий органогенез. Слід зазначити, що розміри експлантів корелювали з інтенсивністю їхнього проростання. Проте відмічено чітку залежність частоти індукції регенераційних процесів від генотипу експланта. Серед ізогенних ліній сорту Одеський 100 найбільшою здатністю до морфогенезу in vitro відзначалася фуркатна (К) лінія: цей генотип достовірно перевершував контрольну лінію як за частотою утворення морфогенних культур, так і за показником регенерації рослин (табл. 2). Рослини фуркатної лінії значно перевищували чисту лінію сорту також за числом погонів, довжиною головного пагона та довжиною колосоносного міжвузля (табл. 3). Як відомо, домінантний маркерний ген К є тотожний гомеобокс-гену Hvknox3 (K.J. Muller et al., 1995). Гомеобокс-гени кодують серію регуляторних білків, що виконують роль чинників транскрипції (L. Reiser et al., 2000).
Таблиця 2. Морфогенез в культурі недостиглих зародків ізогенних ліній сорту Одеський 100
Генотип Число калюсів, шт. Частота утворення морфогенних калюсних культур, % Частота регенерації від загального числа калюсів, %
Одеський 100 50 40,00±6,87 16,00±5,21
K 100 56,00±4,11** 46,00±4,52** yst2 119 34,48±4,37 12,58±3,03 nec1a 154 47,41±4,00 28,64±3,61 v gs3 144 43,11±4,15 29,88±3,79 v log1 28 35,72±9,13 21,37±7,80 v r 88 43,22±5,28 28,41±4,77
B o 75 37,26±5,59 14,74±4,13 v li 196 36,15±3,41 18,92±2,76 ari-a12 66 34,88±5,86 18,19±4,75
Примітка. Розбіжності з сортом Одеський 100 достовірні при **Р ? 0,01
Таблиця 3. Порівняння рослин фуркатної та контрольної ліній сорту Одеський 100 за морфометричними показниками
Ознака
Генотип Число пагонів, шт. Продуктивна кущистість, шт. Довжина головного пагона, см Довжина головного колоса, см
Примітка. Розбіжності з сортом Одеський 100 достовірні при *Р ? 0,05 та **Р ? 0,01
Експресія гомологічного гену Hvknox3 гена кукурузи kn1 є маркером формування стеблової меристеми у перебігу зиготичного ембріогенезу (N. Sentoku et al., 1999). В нашому досліді фуркатна лінія сорту Одеський 100 в порівнянні з контролем відрізнялася підвищеною здатністю до формування стеблових меристем, що знайшло відображення в підвищених показниках кущіння в польових умовах та регенерації при культивуванні недостиглих зародків in vitro. Як відомо, фенотиповим проявом мутації фуркатності є невластиве дикому типу формування меристематичного вузла внаслідок поділу клітин субепідермального шару зачатка ості (K.J. Muller et al., 1995). Подібне явище повязане зі збільшенням в 2,5 рази акумуляції продукту гена Hvknox3 в ділянці формування меристематичного вузла в порівнянні з диким типом, що викликано дуплікацією в четвертому інтроні даного гена. Ми вважаємо, що підвищена регенераційна здатність, яка спостерігається в культурі недостиглих зародків фуркатної лінії сорту Одеський 100, як і підвищена в порівнянні з контрольним генотипом здатність до кущіння в польових умовах, є результатом підвищеної експресії гена Hvknox3 внаслідок дуплікації в інтроні даного гена, яка звичайно асоціюється з мутацією фуркатності.
Умови вирощування рослин-донорів визначали сезонні коливання показників калюсоутворення та регенерації у одних і тих же генотипів. В нашому експерименті відмічено вплив умов вирощування рослин донорів не тільки на частоту регенерації, але й на спрямованість регенераційних процесів. У 1996 році посівний період був жарким і посушливим, у 1997 - дощовим і прохолодним. При використанні недостиглих зародків розміром 1-2 мм погодні умови 1997 року в більшій мірі сприяли індукції морфогенного калюсу: в культурі зародків контрольної та короткоостої ліній сорту Одеський 100 прямий органогенез того року не спостерігався взагалі. Причиною цьому, на наш погляд, є дещо уповільнений розвиток зародків за таких погодних умов, що розширює часові межі оптимальної для індукції морфогенного калюсу і соматичного ембріогенезу стадії розвитку експлантів. Такі зародки, очевидно, чутливіші до токсичного ефекту 2,4-Д у порівнянні з експлантами такого ж розміру, отриманими в жарких та сухих умовах, про що свідчить зниження в 1997 році загальних показників регенерації.
У звязку з тим, що проростання недостиглих зародків на середовищі для індукції калюсу перешкоджає утворенню морфогенного калюсу з щиткової тканини, ми провели вивчення можливості культивування ізольованої щиткової тканини з попереднім вилученням зародкової осі. В експерименті використовувались зародки сорту Геліос і середовище Гамборга В5 з різними концентраціями 2,4-Д. Встановлено, що найоптимальнішим варіантом є культивування експлантів при освітленні 2 клк на середовищі Гамборга В5 з доданням 1 мг/л 2,4-Д. Таку методику можна рекомендувати для генотипів, у яких ускладнена регенерація з меристематичних ділянок експлантів.
Отже, у перебігу роботи виявлено різноманітність морфогенетичних реакцій у рамках регенераційних процесів при культивуванні недостиглих зародків. Спрямованість регенераційних процесів залежала від фізіологічного стану експлантів, тоді коли генотип визначав переважно кількісні відмінності за здатністю до регенерації. Підвищити частоту утворення морфогенного калюсу можна шляхом відбору для висадки на середовище для індукції калюсу недостиглих зародків довжиною 1-1,7 мм з подальшим вилученням з культури інтенсивно прорастаючих експлантів (довжина проростка понад 1,5 см). Запропонована методика культивування ізольованої щиткової тканин може бути рекомендована для генотипів, у яких ускладнена регенерація з меристематичних зон експлантів. Фуркатна лінія сорту Одеський 100 характеризується найбільшою частотою індукції морфогенного калюсу і регенерації рослин. Встановлено, що рослини фуркатної лінії перевершують контроль за здатністю до кущіння в польових умовах, довжиною головного пагона, колосоносного міжвузля та головного колоса.
Генетичний контроль морфогенезу в культурі недостиглих зародків
Для оцінки генетичного контролю ознаки “регенерація рослин” проведені схрещування за повною діалельною схемою з використанням як батьківські форми сортів Геліос, Golden promise, Одеський 115 та фуркатної лінії сорту Одеський 100. Дисперсійний аналіз показав достовірність відмінностей між генотипами за рівнем розвитку ознаки, що дало змогу провести розкладання дисперсії варіантів на її компоненти, зумовлені адитивною та неадитивною дією алельних генів. Значення компонентів генетичної варіації наведено в таблиці 4. Оцінки успадковуваності в широкому та вузькому сенсі склали 0,86 та 0,43 відповідно, що свідчить про зумовленість генотипової мінливості головним чином домінантними ефектами. Оцінка Н1, яка вимірює домінантні ефекти, значно більша оцінки D, що вимірює адитивні ефекти. Це свідчить про переважання ефектів наддомінування при успадкуванні регенераційної здатності у групи сортів, що вивчалися. Величина середнього ступеня домінування дорівнює 1,59 і вказує на наддомінування в кожному локусі. З нерівності оцінок Н1 та Н2 випливає, що в даному наборі сортів позитивні та негативні алелі розподілені нерівномірно. Асиметрічність розподілупідтверджується відхиленням величини балансу негативних та позитивних алелей від 0,25. Позитивний знак величини F, як і оцінка частки домінантних алелей, свідчить про переважання домінантних алелей над рецесивними. Близьке до нуля (r=-0,252) значення коефіцієнта кореляції між середньою батьків та відповідними значеннями (Wr Vr) свідчить про неспрямований характер домінування. Асиметрія між домінантними та рецесивними алелями при неспрямованому домінуванні призводить до викривлення параметрів, що характеризують тип успадкування.
Таблиця 4. Оцінки компонентів генетичної дисперсії
Генетичні параметри Значення
D 124,95
F 51,97
H1 314,26
H2 232,70
E 31,26
Середній ступінь домінування 1,59
Частка домінантних алелей 1,30
Баланс домінантних та рецесивних алелей 0,19
Успадковуваність в широкому сенсі 0,86
Успадковуваність в вузькому сенсі 0,43
Крім діалельного аналізу було здійснено визначення типів ефектів генів за ознаками “довжина проростка” (дана ознака характерізує інтенсивність проростання експлантів на середовищі для індукції калюсу) та “регенерація рослин” на основі середніх значень генерацій F1, F2 та перших беккросів, одержаних від реципрокних схрещувань фуркатної лінії сорту Одеський 100 і сорту Геліос. Оцінки параметрів генетичних моделей, адекватних одержаним даним для ознак, що досліджувались, наведено в таблиці 5.
Для ознаки “регенерація рослин” була адекватна проста модель, що враховує лише адитивні [d] та домінантні [h] ефекти. Включення до генетичної моделі параметрів, які характеризують неалельні взаємодії ([i], [j] та [l]), а також параметрів материнського ефекту ([dm], [dh]) та/або цитоплазматичних параметрів ([c], [cd] та [ch]) призвело лише до втрати адекватності. Хоча за даною ознакою і спостерігається деякий незначний рівень реципрокних відмінностей, здійснений аналіз не дає змогу зробити висновок про причину їхнього виникнення.
За ознакою “довжина проростка” значущими виявилися оцінки всіх ядерних параметрів, за винятком параметра [l], що характеризує домінантно-домінантну взаємодію між гетерозиготними локусами. Крім того, достовірність параметра [c] свідчить про суттєвий вплив цитоплазми на експресію даної ознаки. Таким чином, ознаки, які вивчаються, контролюються різними генетичнимим системами і тому інтенсивність проростання недостиглих зародків на середовищі для індукції калюсу фактично не може розглядатися як індикатор їхньої регенераційної здатності.
Таблиця 5. Достовірні (Р < 0,05) значення параметрів, які характеризують генетичні ефекти за ознаками, що вивчаються
Параметри Ознаки
Довжина проростка Частота регенерації
M 2,40±0,07 0,69±0,06
[d] 0,17±0,04 0,14±0,06
[h] 0,60±0,08 0,60±0,10
[i] 0,53±0,10 -
[j] -0,88±0,15 -
[l] - -
[c] 0,07±0,01 -
[cd] 0,15±0,06 -
[ch] - -
[dm] - -
[dh] - - c2[3] 0,5 c2[7] 5,8
В нашому експерименті гібридні зародки значно перевершували експланти батьківських форм за здатністю до регенерації, про що свідчить значне переважання величини домінантних [h] ефектів над адитивними [d]. Спостережуване явище цілком імовірно є не специфічним феноменом in vitro, а проявом загальної гібридної потужності. Таке припущення підтвердилося при вививченні кореляції між здатністю до регенерації в культурі недостиглих зародків фуркатної лінії сорту Одеський 100, сорту Геліос, а також отриманих від їх схрещування зародків генерацій F1, F2, B1, та морфобіологічними ознаками рослин цих генерацій. Висока достовірна кореляція на 0,01 рівні спостерігалася між частотою регенерації та такими ознаками, як число пагонів (r=0,95) і довжина головного колоса (r=0,97). Виявлено також високу кореляцію між частотою регенерації і висотою рослини (r=0,89) та довжиною бокового колоса (r=0,91), доостовірну на 0,05 рівні. Наявність кореляції між регенераційною здатністю і загальною кущистістю не викликає подиву, оскільки основним джерелом регенерації у нашому експерименті є меристеми кущіння, та дозволяє прогнозувати регенераційну здатність in vitro різних генотипів ячменю.
Отже, у групі генотипів ячменю, що вивчалися, ознака “регенерація рослин” у культурі недостиглих зародків ячменю контролюється адитивно-домінантною системою з переважанням ефектів наддомінування. Виявлено достовірну позитивну кореляцію між даною ознакою та ознаками вегетативної потужності рослин ячменю.
Особливості андрогенезу в культурі пиляків ячменю
Для оцінки здатності до андрогенезу сортів місцевої селекції нами використано високоефективну технологію культивування пиляків, яка запропонована A. Jahne-Gдrtner та H. Lorz [1995]. У перебігу удосконалення даної методики ми підвищили концентрацію мальтози у середовищі для індукції калюсу до 120 г/л. Також було проведено вивчення впливу строків холодової обробки пиляків на частоту індукції новоутворень. Найоптимальнішою в нашому експерименті була двотижнева холодова обробка пиляків при 4 0С.
Загальну схему морфогенетичних процесів, що спостерігалися в культурі пиляків, зображено на рис. 3.
При аналізі індукції морфогенезу вже протягом першого тижня культивування пиляків на середовищі для індукції калюсу після холодової обробки можна було спостерігати появу багатоядерних структур. Подібні структури, що зупинилися в розвитку, виявлено і в неморфогенних пиляках на шестидесяту добу культивування. Основна частина новоутворень через три-шість тижнів після початку культивування пиляків in vitro була представлена глобулярними структурами розміром 0,5-1,5 мм, які в подальшому слугували джерелом калюсоутворення. Прямий ембріоїдогенез спостерігався дуже рідко; формування ембріоїдів прямим шляхом відбувалося беспосередньо на середовищі для індукції калюсу, ще до перенесення культур на безгормональне середовище. Таке явище в незначній мірі характерне для всіх генотипів. При перенесенні глобулярних структур у рідке безгормональне середовище в більшості випадків також відмічалася поява калюсних агрегатів.
Рис.3. Шляхи морфогенезу і культурі пиляків
Безпосереднє формування ембріоїдів в цих умовах, як і на твердому середовищі, було досить рідким явищем. Як і в культурі недостиглих зародків, джерелом регенерації слугували ділянки калюсу, які не мали безпосереднього контакту з живильним середовищем. На поверхні таких калюсних структур відбувалося формування ембриоїдів. Утворення зародків можна було спостерігати і на середовищі для індукції калюсу, ще до переносу на середовище для регенерації, також з ділянок калюсу, які не мали безпосереднього контакту з живильним середовищем. В таких калюсних агрегатах, цілком імовірно, виникали гормональні градієнти, сприятливі для ембріоїдогенезу, які тяжко відтворити штучним шляхом.
Серед генотипів, що вивчалися, найбільша частота індукції новоутворень була характерна для контрольної лінії сорту Одеський 100 (табл. 6). Виявлено чимале зниження здатності до андрогенезу ізогенних ліній даного сорту. Умови вирощування рослин-донорів не мали особливого впливу на частоту індукції новоутворень. Істотне збільшення даного показника в польових умовах у порівнянні з умовами фітотрона спостерігалося лише для сортів Адапт і Геліос. В цілому ж зміна умов вирощування не внесла істотних змін у розподіл генотипів за показником, що вивчається: більшість сортів слід віднести до групи генотипів з низькою здатністю до гаплопродукції. При цьому всі гібридні комбінації, використовувані в експерименті, значно переважали батьківські генотипи за частотою індукції новоутворень.
Таблиця 6. Ефективність індукції новоутворень та регенерації рослин в культурі пиляків ярого ячменю
Умови вирощування Высаджено пиляків, Частота індукції новоутворень, Одержано регенерантів, рослин- шт. % шт. донорів Зелених Альбиносів
К фітотрон 445 3,80±0,91 3 2 поле 92 8,72±2,94 4 7 ari-a12 фітотрон 212 0,0 0 0 поле 195 0,0 0 0 nec1a фітотрон 87 27,60±4,79 1 4 поле 135 23,74±3,66 2 2 v r фітотрон 60 21,69±5,32 2 5 поле 98 39,62±4,61 3 9
B o фітотрон 173 16,75±2,84 3 4 поле 120 25,80±4,00 4 1 v log1 фітотрон 83 16,92±4,11 2 3 поле 75 13,33±3,92 6 11
Сталкер х Мішка фітотрон 502 57,40±2,21 19 35
Сталкер х Південний фітотрон 548 67,68±3,99 12 47
Адапт х Мішка фітотрон 310 25,81±2,49 0 12
Геліос х К фітотрон 141 42,63±4,16 9 13
Примітка. Внутрішньогенотипові відмінності між показниками індукції новоутворень при різних умовах вирощування рослин-донорів достовірні при ** Р < 0,01.
Показники регенерації в нашому експерименті значно поступалися показнику індукції новоутворень у кількісному відношенні, хоча в цілому кількість морфогенних пиляків корелювала з кількістю отриманих регенерантів (r=0,72). Співвідношення зелених регенерантів та альбіносів в середньому за генотипами склало 1:2. При оцінці впливу на кількісний вихід альбіносів генотипу та умов вирощування рослин-донорів, а також спільного впливу цих чинників методом двофакторного дисперсійного аналізу нульова гіпотеза спростовується лише стосовно першого чинника з імовірністю P ? 0,95. Проте сила впливу даного чинника - 7 %, тобто незначна. Отже, якщо індукція новоутворень в значній мірі визначається генотипом, вплив цього чинника на появу регенерантів-альбіносів в запропонованих умовах культивування незначний.
Для визначення взаємозвязку між здатністю до індукції новоутворень у культурі пиляків та низкою ознак рослин ячменю (довжина головного колоса, щільність головного колоса, маса тисячи зерен, час виходу флагового листа, довжина колосоносного міжвузля, число пагонів, число зерен в колосі, довжина головного пагона, продуктивна кущистість) використовували сорти Адапт, Галатея, Сталкер, Мішка, Південний, Одеський 100 та Одеський 115. Спостерігається висока достовірна негативна кореляція (r=-0,79) між показником, що вивчається, та часом виходу флагового листа (дана ознака є індикатором стадії розвитку мікроспор), тобто чим менший часовий інтервал між появою паростків і виходом флагового листа, тим вища частота індукції новоутворень. Не виключено, що гени, які контролюють індукцію новоутворень в культурі пиляків ячменю, зчіплені з генами, які контролюють швидкість проходження етапів органогенезу, або дані ознаки контролюються одними й тими ж генами. Величини інших коефіцієнтів кореляції свідчать про незначний звязок індукції новоутворень з морфобіологічними ознаками рослин ячменю. Наявність високої негативної кореляції між часом виходу флагового листа і частотою індукції новоутворень в культурі пиляків дає змогу очікувати більш високі показники регенерації при культивуванні пиляків ранньостиглих сортів ячменю.1. У популяції сортів та ліній ярого ячменю, що вивчалися, ківлькісні відмінності за здатністю до індукції регенераційних процесів при культивуванні недостиглих зародків і пиляків обумовлені генотипом рослини-донора. В той же час спрямованість регенераційних процесів у культурі недостиглих зародків залежить від фізіологічного стану експлантів.
2. В запропонованих нами умовах культивування недостиглих зародків ячменю (MS з доданням 16 мг/л 2,4-Д та 1 г/л гідролізату казеїну для індукції калюсу, та середовище MS з доданням 6 мг/л 2,4-Д, 1 мг/л ХФО та 1 г/л гідролізату казеїну для проліферації калюсу) регенерація рослин здійснюється внаслідок проліферації меристем експлантів; при цьому спостерігається як прямий органогенез, так і регенерація з морфогенного калюсу шляхом стеблового морфогенезу і соматичного ембріогенезу. Зародки розміром 1 - 1,7 мм знаходяться в оптимальній стадії розвитку для індукції морфогенного калюсу з меристематичних осередків експланта, проте межі оптимуму можуть змінюватися залежно від умов вирощування рослин донорів.
3. Підвищена здатність до регенерації недостиглих зародків фуркатної лінії сорту Одеський 100 повязана з мутацією в гомеобокс-гені ячменю, що впливає на проліферацію меристем. Плейотропний ефект даної мутації проявляється в підвищенні здатності до кущіння, а також у збільшенні довжини головного пагона, головного колоса та колосоносного міжвузля.
4. Ознака “регенерація рослин” в культурі нодостиглих зародків контролюється адитивно-домінантною генетичною системою з переважанням ефектів домінантних генів. Здатність до регенерації в культурі недостиглих зародків тісно повязана з низкою ознак вегетативної потужності рослин.
5. Оптимізовано умови одержання морфогенного калюсу та регенерації рослин при культивуванні ізольованої щиткової тканин (середовище Гамборга В5 з доданням 1 мг/л 2,4-Д та 30 г/л мальтози, освітлення 2 клк). Така методика може бути використана у випадку низької частоти індукції морфогенного калюсу в культурі інтактних зародків.
6. Встановлено оптимальні терміни холодової обробки пиляків (2 тижні при 4 °С). Серед сортів, що вивчалися, Одеський 100 характеризується найвищою частотоюіндукції новоутворень та регенерації рослин у культурі пиляків.
7. Гібридні комбінації, що досліджувалися, перевершували батьківські сорти за частотою індукції новоутворень у культурі пиляків, що має особливе практичне значення у звязку з використанням у селекційному процесі в якості матеріалу для гаплопродукції пиляків гібридних рослин. Проте вплив генотипу на співвідношення “зелені регенеранти/альбіноси” в культурі пиляків є незначним, що ускладнює прогнозування ефективності гаплопродукції при використанні даного методу в селекції ячменю.
ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ
1. У практиці масового одержання регенерантів у культурі недостиглих зародків ячменю пропонується використовувати середовище MS з доданням 16 мг/л 2,4-Д та 1 г/л гідролізату казеїну з подальшим переносом калюсних культур на середовище MS з доданням 6 мг/л 2,4-Д, 1 мг/л ХФО та 1 г/л гідролізату казеїну. Індукція калюсогенезу повинна відбуватися в темряві при 25 °С, а проліферація калюсу - в умовах освітлення (2 клк).
2. Для підвищення ефективності утворення морфогенних калюсних культур слід використовувати недостиглі зародки довжиною 1-1,7 мм з подальшим вилученням із культури інтенсивно прорастаючих на середовищі для індукції калюсу експлантів (довжина проростка понад 1,5 см).
3. Культура ізольованої щиткової тканини може бути використана як альтернативне джерело утворення морфогенного калюсу у разі низької частоти індукції морфогенетичних процесів при культивуванні недостиглих зародків.
4. Для одержання гаплоїдів пропонується вирощувати рослини-донори в польових умовах з подальшою холодовою обробкою пиляків протягом двох тижнів при 4 °С. Як донор високої гаплопродукційної здатності рекомендується використовувати ярий сорт Одеський 100.
5. Для підвищення ефективності культури недостиглих зародків і пиляків доцільно використовувати як вихідний матеріал відповідно генотипи з високою здатністю до кущіння і скоростиглі сорти ячменю.
Список литературы
1. Литовкин К.В., Игнатова С.А., Бондарь Г.П. Морфогенез в культуре незрелых зародышей ячменя // Цитология и генетика. - 1999. - Т.33, №5. - С. 89-96.
2. Літовкін К.В., Ігнатова С.О., Бондар Г.П. Генетичний аналіз морфогенезу в культурі недостиглих зародків ячменю // Вісник Одеського державного університету. - 2000. - Т.5, вип. 1. - С. 103-107.
3. Літовкін К.В. Ігнатова С.О., Бондар Г.П. Кореляції між регенераційною здатністю в умовах in vitro та агрономічними ознаками рослин ячменю // Аграрний вісник Причорноморя. Біологічні та сільськогосподарськи науки. - 2001. - Вип. 12. - С. 25-29.
4. Литовкин К.В., Игнатова С.А. Влияние генотипа на морфогенез в культуре тканей ячменя // Матер. 2 межд. конф. “Биотехнология в растениеводстве, животноводстве, ветеринариии”. - Москва, 2000. - С. 31-33.
5. Litovkin K.V. Morphogenic response in tissue culture of barley near-isogenic lines // Abstr. Intern. Symp. “ Biotechnology approaches for exploitation and preservation of plant resources”. - Yalta, 2002. - P. 21-22.
Вы можете ЗАГРУЗИТЬ и ПОВЫСИТЬ уникальность своей работы
