Генна інженерія в тваринництві - Реферат

В даний час використовуються кілька підходів в отриманні трансгенних тварин. Інтеграція декількох копій (від 1 до кількох сотень) екзогенної ДНК в геном відбувається, як правило, в одному сайті в орієнтації "голова до хвоста" або "голова до голови". При інєкції декількох рекомбінантних конструкцій, їх вбудовування в геном, також відбувається в одному сайті. Інший підхід в отриманні трансгенних тварин полягає в інфікуванні ранніх ембріонів ссавців рекомбінантів-ниміретровірусамі.Така інформація представляє собою або окрему ділянку ДНК з власними (гомологічними) регуляторними послідовностями (еукаріотична транскрипційних одиниця), або сконструйований з різних молекул ДНК гібридний (рекомбінантний) ген.Суть методу мікроінєкції полягає у введенні розчину генних конструкцій в чоловічій пронуклеус зигот. Зазвичай інєцирують 1-2 ПКЛ розчину ДНК в концентрації, що відповідає 1000 копій в 1 ПКЛ мікроінєкціонного розчину. При цьому виходять з того, що кількість 1000 копій / ПКЛ приблизно відповідає концентрації X нг / мкл, де X - довжина генної конструкції в тисячах парах нуклеотидів (т.п. н). Наприклад, якщо довжина генної конструкції дорівнює 10 т.п. н., то кількість 1000 копій в 1 ПКЛ буде досягатися при концентрації рівної 10 нг / мкл. Для більш точного розрахунку концентрації генних конструкцій використовують наступну формулу: Кількість копій (копій ПЛК) = 6,023 * 10 23 * З * 10 - 9/Mr, де 6,023 * 10 23 - число копій в 1 М розчині;Віруси складаються покритих липопротеїдною оболонкою вірусних частинок діаметром 70-120 нм і внутрішньої капсули ікосаедричної форми, яка містить дві копії геномної РНК довжиною 5-10 тисяч пар нуклеотидів у формі рибонуклеопротеїни. Ген кодує pol вірусну реверсивну транскриптазу й інші повязані з вірусом нуклеази. Геноми РНК ретровірусів містять на своїх кінцях повторюваних послідовностей, які залежно від типу вірусу мають довжину від 10 до 80 нуклеотидів. В одних вірусів кор, що складається з білка gag, РНК-залежної ДНК-полімерази (реверсивної транскриптази), інтегрази і двох копій ретровірусної РНК, переноситься в ядро, де і відбувається транскрипція, а в інших вірусів транскрипція здійснюється безпосередньо в цитоплазмі. Якщо транскрипція має місце в цитоплазмі клітини, то дволанцюжкова ДНК вірусу транспортується в ядро, де відбувається її циркуляція з подальшою інтеграцією однієї або декількох копій в геном клітини.Вперше експресія генних конструкцій в соматичних тканинах химерних мишей, отриманих з використанням трансформованих клітин ембріональної карциноми, була доведена Stewart з співавторами [1985]. Частка химерних мишей була дуже високою, причому частина з них передавала Трансген у спадок. Це означає, що кожен ембріон, який розвинувся в культурі після пересадки ядер, буде трансгенним і подальша селекція трансгенних ембріонів не потрібно. Використання для одержання трансгенних тварин трансформованих ЕСК робить можливим у ряді випадків проводити оцінку експресії трансгенів, що має важливе значення. Тестування експресії в культурі зробить можливим використання для пересадки ядер, а отже і для отримання трансгенних тварин тільки тих клітинних ліній, в яких трансгени є транскрипційно і трансляційної активними.Векторами для перенесення генних конструкцій у ембріональні лінії ссавців можуть служити ліпосоми [Rottmann et al, 1985], однак опосередкований ними перенесення генів не отримали широкого розповсюдження 1.5 Використання статевих клітин сімяників (спермії і сперматогонії) Сперматозоїди є природним вектором, що приносять ДНК у клітину. Аналіз 1300 мишей, народжених in vitro обробленої ДНК спермою, не виявив Трансгенні в жодній з досліджуваних особин [Brinster, 1989), Недавнє дослідження показали, що при застосуванні методу переносу ДНК за допомогою сперматозоїдів в одній і тій же лабораторії дае пра використанні однакової схеми досліджень можуть бути отримані суперечливі результати [Maiore et al, 1998]. ДНК інєктувати в проксимальну область сімяних канальців, після чого через 6 годин витягували сперматозоїди. Також було показано, що екзогенна ДНК може бути ефективно доставлена в ооцити мікроінєкцированими сперматозоїдами. Була доведена можливість успішного перебігу сперматогенезу після пересадки кріоконсервованих клітин семенника і після їх тривалого консервування, пересадки в насінники мишей клітин з сімяників пізніх стадій сперматогенезу статевих клітин донорів виявлено не було / Dobnnski et al., 1999].Крім того, обмежені знання регуляторних послідовностей більшості генів призводять до використання часто повністю не охарактеризованих геномних фрагментів, що і є причиною низької ефективності експресії в експериментах з перенесення генів [Palmlter, Brinster, 1986]. Для того щоб подолати позиційний ефект і таким чином збільшити ймовірність оптимальної експресії трансгенів, інтегрованих у випадковій локалізації, був застосований цілий ряд різних стратегій. Першим таким підходом, що дозволив збільшити рівень експресії, було введення в генні конструкції гомологі

Зміст

Вступ

1. Методи трансгенеза у тваринництві

1.1 Метод мікроінєкції

1.2 Використання ретровірусних векторів

1.3 Метод пересадки ядер клітин, культивованих in vitro

1.4 Ліпосоми як переносники ДНК

2. Фактори підвищення експресія трансгенів в організмі тварин

3. Перспективи генно-інженерних робіт у тваринництві