Генетика и биохимия микробного синтеза полигидроксиалканоатов - Курсовая работа

Полиэфиры гидроксипроизводных жирных кислот, полигидроксиалканоаты (ПГА), активно изучаются в настоящее время в связи с их биодеградируемостью, относятся к резервным макромолекулам и образуются прокариотами при несбалансированном росте [2]. Актуальность данной темы заключается в том, что сейчас ведутся активные исследования ПГА, в связи с тем, что биополимеры используются для производства биоразлагаемых материалов, таких как пленки, на основе целлюлозы, хитина и хитозана, желатина, полипептидов и др. Существенное внимание различными авторами уделяется бактериям Ralstonia eutropha (бывшее систематическое название Alcaligenes eutrophus) в связи со способностью этих бактерий аккумулировать ПГА с высокими выходами на различных субстратах, в том числе различного состава (гомогенный полигидроксибутират, более технологичные сополимеры гидроксибутирата с гидроксивалератом, а также трехкомпонентные полимеры).Полигидроксиалканоаты (ПГА) представляют семейство полиэстеров, имеющих термопластические и резиновые свойства, которые синтезируют прокариотические организмы в специфических условиях несбалансированного роста в качестве эндогенного депо энергии и углерода, используя для этого различные субстраты (сахара, органические кислоты, спирты и другое). Среди них хемоорганотрофный организм Ralstonia (до недавнего времени известный как Alcaligenes), способный использовать различные источники углерода и гетеротрофные микроорганизмы, относящиеся к трем таксонам - Methylotrophus, Methylobacterium и Pseudomonas [9]. К настоящему времени идентифицировано свыше 100 различных ПГА, которые по химической структуре подразделяют на три группы: «short-chain-lenght», (SCL), состоящие из кислот с длиной углеродной цепи от С3 до С5; «medium-chain-lenght», (MCL) - от С6 до С14; и «long-chain-lenght», (LCL) с содержанием кислот С17 и С18. Данное технологическое свойство имеет большую коммерческую ценность, так как позволяет с использованием различных методов (прессования, экструзии и др.) получать из ПГА разнообразные изделия и материалы. Преимущества разработки ПГА заключается в том, что они нетоксичны и биосовместимы; разрушаются в биологических средах до конечных продуктов (СО2 и Н2О); обладают антиоксидантными свойствами и пьезоэлектрическим эффектом; термопластичны, перерабатываются в изделия (пленки, полые формы, нити) из порошков, растворов и расплавов; не требуют технологических добавок; подлежат стерилизации общепринятыми методами; для синтеза используют доступные и дешевые отечественные реагенты.На примере наиболее изученного из ПГА - полимера ?-оксимасляной кислоты установлено, что пути его синтеза практически одинаковы у различных микроорганизмов (Alkaligenes, Azotobakter, Pseudomonas). В биосинтезе полигидроксиалканоатов ключевыми являются три фермента: ?-кетотиолаза, ацетоацетил-КОА-редуктаза и ПГА-синтаза, которые кодируются соответственно генами PHBA, PHBB, PHBC (Рис.3). Регуляция процесса синтеза ПГА может осуществляться на нескольких уровнях: на уровне экспрессии генов специфическими факторами среды (например, недостаток питательных элементов) или на уровне регуляции активности ферментов специфическими клеточными компонентами, являющимися их субстратами или ингибиторами. В самых первых работах, посвященных изучению механизма синтеза ПГА, было показано, что регуляция синтеза ПГА у R.eutropha осуществляется метаболитами на ферментативном уровне при ведущей роли внутриклеточной концентрации свободного коэнзима А, который ингибирует кетотиолазную реакцию у Схематичное изображение генов ферментов синтеза ПГА и продуктов их экспрессии. ?-кетотиолаза является первым ферментом синтеза полимера и катализирует конденсацию двух молекул ацетил-КОА, фермент также катализирует последнюю реакцию в процессе эндогенной деградации полимера.Наибольшее сродство фермент имеет по отношению к кислотам с ОН-группой в ?-положении. Перемещение ОН-группы к метильному концу снижает способность субстрата связываться с ферментом, однако не влияет на скорость синтеза полимера. Разница в субстратной специфичности фермента in vivo и in vitro может быть связана со сроками наблюдения за включением субстратов в ПГА, или разницей в специфической среде окружения фермента. Рекомбинант оказался способным синтезировать фермент с высоким выходом, но так как в среде отсутствовали субстраты, в клетках накапливалась только растворимая форма фермента. Кинетический анализ показал, что реакция полимеризации 3-ОН-С4-КОА с этим ферментом начинается после достаточно продолжительной лаг фазы, которая увеличивалась при снижении концентрации фермента в реакционной смеси.К настоящему моменту гены синтеза ПГА клонированы из нескольких десятков бактерий, что позволило получить разнообразные в таксономическом отношении продуценты полимеров, а также организмы, обладающие способностью синтезировать совершенно новые типы ПГА. Первый phb ген, выделенный из бактерии Z. ramigera, был интересен для биополимерной инженерии тем, что продуцировал P(3HB) и внеклеточный полисахарид. При ис

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Физико-химические свойства биополиэстеров

1.2 Метаболические пути синтеза

1.3 Свойства и структура ПГА - синтазы, выделенной из R.eutropha

1.4 Организация генов биосинтеза ПГА

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

SUMMARY