Характеристика мутантів із порушеннями етапів біосинтезу ландоміцину Е та виявлення зміни в спектрі синтезованих мутантами ландоміцинів. Розгляд процесу локалізації генів біосинтезу ландоміцину Е за допомогою гібридизаційного скринінгу бібліотеки генів.
При низкой оригинальности работы "Генетичний контроль окремих етапів біосинтезу ландоміцину Е в Streptomyces globisporus 1912", Вы можете повысить уникальность этой работы до 80-100%
Ландоміцини - родина ангуциклічних полікетидних антибіотків, що володіють протипухлинною активністю. Вивчення біосинтезу ландоміцинів дозволить зясувати, як регулюється продукція цих сполук, шляхи еволюції генів полікетидсинтаз, яким чином контролюються згортання лінійних попередників ангуциклінів, їхнє окиснення, відновлення та глікозилювання. Вивчення біосинтезу ландоміцину Е виконувалось у межах держбюджетних науково-дослідних тем Бг-12б “Розробка методів генетичного та генно-інженерного конструювання штамів-продуцентів протиракових антибіотиків” (2000-2002, номер держреєстрації - 0197U018080), Бг-117б „Генетичний контроль біосинтезу протипухлинних антибіотиків ландоміцинової групи”(2003-2005, номер держреєстрації - 0197U011132). Ці дослідження також були підтримані міжнародним грантом INTAS-Україна 95-20 “Біотехнологічне вдосконалення продуцента нового потенційного протипухлинного антибіотика” (1997-2000), BMBF 0311308 „Резистентність до власних антибіотиків у продуцентів антибіотиків” (1996-1998) та індивідуальним грантом INTAS-YSF 00-208 (2001-2003 рр.). Це гени, роль яких у біосинтезі ландоміцину Е є найменш зрозумілою, і які можуть бути далі використані для генно-інженерного конструювання продуцентів нових антибіотиків.В експериментах з клонування генів біосинтезу ландоміцину Е (lnd-гени) використали векторні молекули ДНК PUC18/19, PBLUESCRIPTIIKS-[Sambrook et al., 1989], для спрямованого руйнування lnd-генів - PTNK, для експресії lnd-генів - плазміди PKC1218E, PSET152 [Bierman et al., 1992]. Конюгацію E.coli-Streptomyces, інфекцію E.coli, визначення стійкості штамів до антибіотиків виконували як в [Лужецький та ін.,2001, Kieser et al., 2000]. біосинтез ландоміцин ген гібридизаційний Предметом дослідження були гени біосинтезу LAE (lnd-гени), зокрема гени циклаз LNDF та LNDL, ген глікозилтрансферази LNDGT4, та ген оксигенази LNDM. Гени оксигеназ LNDE, LNDM, LNDZ5 контролюють окиснення циклізованого попередника ландоміцинону, а гени LNDGLNDHLNDQLNDRLNDSLNDT, LNDZ1, LNDZ3 кодують білки біосинтезу дезоксицукрів. Ген LNDJ кодує ймовірний транспортер, а LNDI - транскрипційний активатор lnd-генів.В результаті виконаної роботи виявлено і секвеновано кластер генів біосинтезу протипухлинного антибіотика ландоміцину Е (lnd-кластер) Streptomyces globisporus 1912. Зясовано функції шести структурних lnd-генів і регуляторну функцію гену LNDI. Гени LNDZ6LNDALNDBLNDCLNDDLNDLLNDF LNDELNDMLNDZ4LNDZ5LNDNLNDOLNDVLNDP контролюють синтез полікетидної частини ландоміцину Е, LNDGLNDHLNDQLNDRLNDSLNDTLNDZ1LNDZ3 - синтез дезоксицукрів, LNDGT2LNDGT1LNDGT4 - їхнє приєднання до аглікону, ген LNDJ кодує імовірний детермінант стійкості до ландоміцину Е, LNDI - позитивний регулятор структурних lnd-генів. Ген LNDM кодує оксигеназу третього кільця, LNDGT4 кодує родинозилтрансферазу, що приєднує залишок L-родинози під час синтезу ландоміцину Е. Інактивація гену LNDGT4 призводить до продукції рекомбінантним штамом GT4.1 нових ландоміцинів F та Н, а комплементація генетичних порушень у цьому штамі геном LNDGT4 - до продукції ландоміцину G.
План
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ
Вывод
В результаті виконаної роботи виявлено і секвеновано кластер генів біосинтезу протипухлинного антибіотика ландоміцину Е (lnd-кластер) Streptomyces globisporus 1912. Зясовано функції шести структурних lnd-генів і регуляторну функцію гену LNDI. Вперше отримано нові ландоміцини із зміненою структурою аглікону.
Кластер генів біосинтезу ландоміцину Е (lnd-кластер) знаходиться у ділянці хромосоми S.globisporus 1912 розміром 36 т.п.н. Виявлено 30 генів, що контролюють біосинтез ландоміцину Е. Гени LNDZ6LNDALNDBLNDCLNDDLNDLLNDF LNDELNDMLNDZ4LNDZ5LNDNLNDOLNDVLNDP контролюють синтез полікетидної частини ландоміцину Е, LNDGLNDHLNDQLNDRLNDSLNDTLNDZ1LNDZ3 - синтез дезоксицукрів, LNDGT2LNDGT1LNDGT4 - їхнє приєднання до аглікону, ген LNDJ кодує імовірний детермінант стійкості до ландоміцину Е, LNDI - позитивний регулятор структурних lnd-генів. Роль генів LNDX та LNDU у біосинтезі LAE невідома.
В трьох із девяти Lnd- - мутантів S.globisporus 1912 виявлені делеції які призводять до повного припинення біосинтезу ландоміцину Е. Ці делеції охоплюють райони клонованого lnd-кластеру, що містять регуляторний ген LNDI та гени мінімальної полікетидсинтази LNDA, LNDB, LNDC.
Гени LNDL та LNDF кодують циклазу-ароматазу першого кільця і циклазу третього-четвертого кілець ландоміцинону, відповідно. Ген LNDM кодує оксигеназу третього кільця, LNDGT4 кодує родинозилтрансферазу, що приєднує залишок L-родинози під час синтезу ландоміцину Е.
Інактивація гену LNDGT4 призводить до продукції рекомбінантним штамом GT4.1 нових ландоміцинів F та Н, а комплементація генетичних порушень у цьому штамі геном LNDGT4 - до продукції ландоміцину G. Усі три нові ландоміцини не містять гідроксильної групи у позиції С11. Ландоміцини Н та F містять у своїй структурі моно- та дисахаридний залишки, відповідно, ландоміцин G - трисахаридний залишок.
В гетерологічних господарях S.coelicolor CH999 та S.fradiae Tu2717 lnd-гени експресуються за наявності специфічного регуляторного гену LNDI, або під контролем сильного конститутивного промотора.
ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА МАТЕРІАЛАМИ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Ostash B.O., Luzhetskiy A.M., Gromyko O.M., Fedorenko V.O. Transfer of plasmids from Escherichia coli to mutant strain S. globisporus LND900 with altered biosynthesis of antitumor antibiotic landomycin E // Наук. Вісн. Ужгород. Нац. Ун-ту, Сер. Біол. -2001.-Т.10.-С.147-149.
2. B. Ostash, L. Basiliya, O. Gromyko, Yu. Rebets, V. Fedorenko. Streptomyces globisporus 1912 mutants with altered landomycin E biosynthesis // Вісник Львів. ун-ту, сер. біол. - 2001. -Т.27.-С.106-112.
3. А.Н.Лужецкий, Б.Е.Осташ, В.А. Федоренко. Межродовая конъюгация Escherichia coli - Streptomyces globisporus 1912 с использованием интегративной плазмиды PSET152 и ее производных // Генетика. -2001.-Т.37, №10.-С.1340-1347.
4. Y. Rebets, B.Ostash, A. Luzhetskyy, D.Hoffmeister, A. Brana, C.Mendez, J.A. Salas, A. Bechthold, V. Fedorenko. Production of landomycins in strains Streptomyces globisporus 1912 and S. cyanogenus S136 is regulated by genes encoding putative transcriptional activators // FEMS Microbiol. Lett.-2003.-V.222(1).-P.149-153.
6. Федоренко В.О., Басілія Л.І., Заворотна С.А., Голець Л.М., Кириченко Н.В., Настасяк І.М., Демидчук Ю.О., Дубицька Л.П., Мазепа А.Й., Марїна О.В., Панькевич К.О., Осташ Б.О., Лужецький А.М., Громико О.М., Самбір М.В. Генетичний контроль біосинтезу антибіотиків та стійкості до антибіотиків у актиноміцетів. „Генетика і селекція в Україні на межі тисячоліть”. K.: Логос.-2002.- Т.1. - С.469-476.
7. K. Pankevych, J. Demydchuk, A. Luzhetskiy, B. Ostash, L. Basiliya, K.Weber, V. Fedorenko, H. Saluz and H. Krugel. Pathway alignment and analysis of the landomycin E biosynthetic gene cluster from Streptomyces globisporus 1912. Dresden, VAAM-Workshop " Biologie der Actinomyceten" - Theses. - 1999.-26-28 September. -P. V18.
8. M.V. Sambir, O.M. Gromyko, B.O. Ostash. Molecular analysis of Streptomyces globisporus 1912 mutants deficient in production of putative anticancer polyketide Landomycin E. 2nd international medical conference for students and young doctors-Gdansk-April 28-30, 2000.-Theses-P.134.
9. Ostash B.O. Genetic approaches to studying the landomycin E biosynthesis in Streptomyces globisporus 1912 // Conference on genetics and molecular biology for students and young scientists devoted to 100th anniversary of genetics: Proc. (Lviv, Ukr., 20 -22 April 2000). - Львів, 2000. - С. 69.
10. Ostash B.O., Pankevych K.O., Luzhetskiy A.M., Basiliya L.I., Gromyko O.M., Kruegel H., Fedorenko V.O. Studying of genes involved in landomycin E biosynthesis by S. globisporus 1912 // 12th Int. Symp. on the biology of actinomycetes; Vancouver, Canada, August 5-9, 2001. Abs.-P.133.
11. Luzhetskiy A.M., Ostash B.O., Gromyko O.M., Fedorenko V.O. Conjugative transfer of plasmid DNA into Streptomyces - producers of antitumor antibiotics //12th Int. Symp. on the biology of actinomycetes; Vancouver, Canada, August 5-9, 2001. Theses.-P.80.
12. V.O.Fedorenko, B.O.Ostash, A. M.Luzhetskiy, L.I. Basiliya, K.O. Pankevych, O.M.Gromyko, Yu. V.Rebets, H. Kruegel. Genetic control of antitumor landomycin E biosynthesis in S. globisporus 1912 // Mat. Ogolnopol. Symp. Mikrobiol. Krakow, Poland, 6-8 Wrzesien 2001. Abs.-P.17-18.
13. Yu. Rebets, B. Ostash. Using of different vector systems for heterologous expression of genes for angucycline antibiotic landomycin E biosynthesis // Conf. for students, PHD students and young scientists on molecular biology and genetics, September 20-22, 2001, Kyiv, Ukraine. Abstract. P.119.
14. V. Yuskevych, B. Ostash. Characterization of recombinant strain Streptomyces fradiae Tu 2717 carrying plasmid PSET152 and its derivatives // Conf. for students, PHD students and young scientists on molecular biology and genetics, September 20-22, 2001, Kyiv, Ukraine. Abstracts book. P.129.
16. Rebets Y., Ostash B., Luzhetskyy A., Bechthold A., Fedorenko V. Pathway-specific regulatory genes for landomycins E and A biosynthesis of Streptomyces globisporus 1912 and Streptomyces cyanogenus S136, a new member of SARP family// VAAM - Workshop “Biologie bakterieller Naturstoffproduczenten” 29.Sept.-1 Okt.2002, Freiburg. - P.28.
17. Rebets Yu., Ostash B. Heterologous expression of landomicyn E biosynthesis genes in model strains of streptomycetes//6-th School-Conf. of young scientists “Biology - science of XXI century” : Proc. (Puschino, Russia, 20-24 May 2002). - Theses.- V.1.-P.308.
18. Юськевич В., Осташ Б. Гетерологічна експресія генів біосинтезу ландоміцину Е в штамі-продуценті урдаміцинів S.fradiae Tu 2717 // Мат. ІІ-ої Всеукр. Конф. студентів та аспірантів „Біологічні дослідження молодих вчених на Україні”(Київ, 23-26 квітня 2002р.). Тези.- C. 46-47.
19. Юськевич В., Осташ Б, Федоренко В. Використання генів оксигеназ, що задіяні у біосинтезі ангуциклічних полікетидів, для конструювання продуцентів нових антибіотиків // Тези доповідей учасників І-ої Всеукр. Наук.-практ. Конф. студентів, аспірантів та молодих учених (10-11 лютого 2003р., м. Київ). С. 137-138.
20. Лужецький А., Грек М., Федоришин М., Осташ Б., Басілія Л., Бехтольд А., Федоренко В. Використання конюгації для створення рекомбінантних штамів Streptomyces cyanogenus S136 // Тези доповідей учасників І-ої Всеукраїнської науково-практичної конференції студентів, аспірантів та молодих учених (10-11 лютого 2003р., м. Київ). С. 127-128.
21. Ребець Ю., Осташ Б., Лужецький А., Хофмейстер Д., Брана А., Мендез К., Салас Х.А., Бехтольд А., Федоренко В. Гени, що контролюють біосинтез ландоміцинів у Streptomyces globisporus 1912 та Streptomyces cyanogenus S136 // Тези доповідей учасників І-ої Всеукр. наук.-практ. конф. студентів, аспірантів та молодих учених (10-11 лютого 2003р., м. Київ). С. 135-136.
22. Ребець Ю., Мік У., Дутко Л.О., Осташ Б., Басілія Л., Федоренко В. Клонування та вивчення генів LNDJ та LNDW Streptomyces globisporus 1912, що кодують білки транспортери // Тези доповідей учасників І-ої Всеукр. Наук.-практ. конф. студентів, аспірантів та мол. учених (10-11 лютого 2003р., м. Київ).С.133-134.
23. Осташ Б., Лужецький А., Громико О., Ф. Ломбо, Салас Х.А., Федоренко В. Генетичний контроль глікозилювання протипухлинного антибіотика ландоміцину Е: вивчення гену LNDGT4 Streptomyces globisporus 1912 // Тези доповідей учасників І-ої Всеукраїнської науково-практичної конференції студентів, аспірантів та молодих учених (10-11 лютого 2003р., м. Київ). С. 130-131.
Вы можете ЗАГРУЗИТЬ и ПОВЫСИТЬ уникальность своей работы
