Ознайомлення з процесом підбору інформативних молекулярно-генетичних маркерів для порівняльного вивчення внутрішньовидового поліморфізму геномів. Дослідження та аналіз поліморфізму у міжвидовій диференціації зубрів, бізонів та великої рогатої худоби.
При низкой оригинальности работы "Генетична диференціація геномів за маркерами ISSR-PCR та RAPD-PCR", Вы можете повысить уникальность этой работы до 80-100%
Молекулярні-генетичні методи досліджень набувають дедалі більшої популярності у прикладних галузях біологічних наук. З великої кількості існуючих напрямів аналізу поліморфізму геномів на особливу увагу заслуговують методи так званого мультилокусного ДНК-профілювання (або ДНК-фінгерпринту) на основі полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Широкого розвитку ці методи набули завдяки своїй простоті, високій чутливості та швидкості проведення досліджень. Дослідження виконувалися згідно плану науково-дослідних робіт Інституту агроекології та біотехнології УААН за темою: “Вивчення генофондів рідкісних та зникаючих порід великої рогатої худоби, овець і коней України в різних еколого-географічних умовах розведення” (номер державної реєстрації 0197U014671), а також наукової тематики Білоцерківського національного аграрного університету “Інформативність маркерів ISSR-PCR та RAPD-PCR для дослідження геномів рослин та тварин” (номер державної реєстрації 0108U001634). Використано наступні методи аналізу біологічного матеріалу: біохімічні - для екстракції геномної ДНК; полімеразної ланцюгової реакції, електрофоретичного розділення продуктів ампліфікації ПЛР в агарозному гелі - для аналізу поліморфізму маркерів RAPD-PCR та ISSR-PCR; незважений парногруповий метод кластерного аналізу (UPGMA) - для побудови дендрограм генетичних взаємовідносин між досліджуваними видами; методи статистичної обробки результатів досліджень.Однак під час ампліфікації препарату ДНК, виділеного цими методами, було виявлено відмінності в якісному та кількісному складі отриманих спектрів за використання однієї і тієї самої проби. Враховуючи зазначені вище особливості виділення ДНК, для оптимізації цього процесу було використано комплексний підхід - спочатку проводили лізис за стандартними методиками, осаджували клітинний дебріс центрифугуванням, відбирали рідину над осадом і після цього застосовували метод сорбції ДНК за використання силіцій оксиду. Найважливішими чинниками, що впливали на якість ISSR-та RAPD-спектрів, виявилися концентрація ДНК-матриці, температура відпалу праймерів та концентрація праймерів у реакційній суміші. Проведені дослідження дали змогу визначити оптимальні діапазони концентрацій реагентів реакційної суміші та умов ПЛР, в яких такі зміни мінімально впливають на відтворення результатів методів ДНК-фінгерпринту на основі ПЛР, і розроблено загальний алгоритм оптимізації методів мультилокусного ДНК-профілювання. Для аналізу молекулярно-генетичного поліморфізму трьох видів тварин (зубра, бізона та великої рогатої худоби) загалом було використано 8 праймерів: 4 RAPD-та 4 ISSR-праймери.На прикладі представників підродини Bovinae та підродини Phaseoleae теоретично обґрунтовано і практично доведено високу інформативність ISSR-та RAPD-маркерів для генетичної диференціації геномів вищих організмів, а також можливість їхнього використання для генетичної паспортизації. Найважливішим етапом екстракції ДНК, що впливає на якісні та кількісні характеристики препарату ДНК, є початковий лізис біологічного матеріалу. Додаткове очищення препарату ДНК методом сорбції на силіцій оксиді уможливлює отримання чітких та відтворюваних спектрів ампліфікації ISSR-та RAPD-PCR. Одомашнений (Bos taurus) і дикі види тварин підродини бичачих (Bison bison, Bison bonasus), а також сорти культурної (Glycine max L.) та популяції дикої уссурійської сої (Glycine soja) характеризуються високим і порівнянним рівнем генетичної мінливості за маркерами ISSR-та RAPD-PCR. Так, середня гетерозиготність сірої української породи за маркерами ISSR-та RAPD-PCR становила відповідно 0,278 та 0,213, бізона - 0,274 та 0,221, зубра - 0,177 та 0,169.
Вывод
Тестування та оптимізація методів виділення геномної ДНК. У роботі було тестовано два найпоширеніші методи виділення геномної ДНК - метод фенол/хлороформної екстракції та метод за використання катіонного детергенту СТАБ. Під час порівняння цих методів загальна кількість виділеної ДНК з листових дисків рослин та крові досліджуваних тварин була однаковою - в середньому 1-3 мкг з 100 мг листя чи проростку та 0,5-1 мкг ДНК з 1 см3 крові. Однак під час ампліфікації препарату ДНК, виділеного цими методами, було виявлено відмінності в якісному та кількісному складі отриманих спектрів за використання однієї і тієї самої проби. Найчастіше це траплялося у випадку тривалого зберігання проб у морозильній камері (мінус 20?С). Крім того, виявлено великі коливання концентрації ДНК, виділеної цими методами з окремих проб біологічного матеріалу. Найважливішим етапом, який впливав на ступінь деградації препарату ДНК та концентрацію геномної ДНК, нами було визначено етап початкового лізису біологічного матеріалу. Враховуючи зазначені вище особливості виділення ДНК, для оптимізації цього процесу було використано комплексний підхід - спочатку проводили лізис за стандартними методиками, осаджували клітинний дебріс центрифугуванням, відбирали рідину над осадом і після цього застосовували метод сорбції ДНК за використання силіцій оксиду.
Використаний підхід уможливив оптимізацію етапу виділення ДНК і отримання однакових спектрів ампліфікації за застосування різних первинних протоколів виділення ДНК та умов зберігання проб біологічного матеріалу.
Оптимізація умов проведення ISSR- та RAPD-PCR. Варіювання концентрацій компонентів реакційної суміші та умов проведення RAPD- і ISSR-PCR зумовлюють зміну якості та кількості ПЛР-смуг. Зазвичай найчутливішими до змін умов ампліфікації виявлялися амплікони з високою молекулярною масою (понад 1,5 т.п.о.) за використання високих концентрацій іонів Mg2 (понад 2,5 ММ). Зміна спектрів ампліфікації (поява чи зникнення ампліконів) відбувалася за рахунок продуктів ПЛР низької інтенсивності світіння. Мажорні смуги відтворювалися в усіх проведених експериментах.
Найважливішими чинниками, що впливали на якість ISSR- та RAPD-спектрів, виявилися концентрація ДНК-матриці, температура відпалу праймерів та концентрація праймерів у реакційній суміші. Зміна інших умов ПЛР зумовлювала лише різну інтенсивність світіння продуктів ампліфікації в ультрафіолетовому світлі і не впливала на якість спектрів.
Проведені дослідження дали змогу визначити оптимальні діапазони концентрацій реагентів реакційної суміші та умов ПЛР, в яких такі зміни мінімально впливають на відтворення результатів методів ДНК-фінгерпринту на основі ПЛР, і розроблено загальний алгоритм оптимізації методів мультилокусного ДНК-профілювання.
Загалом ці діапазони виявилися подібними для ISSR- та RAPD-PCR за винятком температури відпалу праймерів та кількості циклів ампліфікації Узагальнені результати визначених оптимальних діапазонів представлено в таблиці 2.
Таблиця 2. Оптимальні концентрації реагентів та параметри ПЛР для проведення ISSR- та RAPD-PCR
Компоненти реакційної суміші та параметри ПЛР Діапазон оптимальних концентрацій
ISSR-PCR RAPD-PCR
Геномна ДНК 30-60 нг/20 мкл 40-60 нг/20 мкл
Іони магнію 1,8-2,2 ММ 1,8-2,2 ММ
Праймер 0,3-0,6 МКМ 0,4-0,7 МКМ
ДНТФ 200 МКМ 200 МКМ
Taq-полімераза 0,8-1,2 од. 0,8-1,2 од.
Кількість циклів 32 35-37
Температура відпалу 52-58?С 45?С
Для аналізу відтворюваності маркерів ISSR- та RAPD-PCR, що повязана з особливостями роботи різних ампліфікаторів (спосіб програмування, швидкість досягнення температури та ін.), ми порівняли спектри ампліфікації, отримані за використання трьох різних моделей термоциклерів: “Терцик” (ДНК-технологія, Росія), “GENEAMP 2400” (Applied Biosystems, США) та “Master Cycler Gradient” (Eppendorf, Німеччина). Отримані мультилокусні спектри продуктів ПЛР виявилися ідентичними за умови дотримання визначених оптимальних концентрацій хімічних реагентів реакційної суміші.
Внутрішньовидовий поліморфізм геномів за маркерами ISSR- та RAPD-PCR. За використання методів мультилокусного профілювання було досліджено рівень генетичної мінливості у деяких доместикованих і споріднених з ними диких видів тварин і рослин.
Для аналізу молекулярно-генетичного поліморфізму трьох видів тварин (зубра, бізона та великої рогатої худоби) загалом було використано 8 праймерів: 4 RAPD- та 4 ISSR-праймери. Молекулярна маса продуктів ампліфікації варіювала від 2400 п.о. до 400 п.о. залежно від праймера. Максимальну кількість поліморфних ПЛР-продуктів (12) було отримано з RAPD-праймером UBC-14. Сумарно за використання 8 праймерів отримано 82 продукти ампліфікації, 51 (62,19 %) з яких були поліморфними. При цьому RAPD-праймери характеризувалися більшою кількістю поліморфних ампліконів (70,45 %), ніж ISSR-праймери (52,63 %). Значення маркерних індексів (МІ) для ISSR- та RAPD-праймерів за диференціації досліджених видів тварин достовірно не відрізнялися (р<0,05). Найбільше значення МІ (4,12) спостерігали для RAPD-праймера UBC-10 (табл. 3). Отже, загальний рівень поліморфізму, який виявили використані у роботі ДНК-маркери, у диких і одомашненого видів був порівнянним.
Показники середньої гетерозиготності (Hav) та частки поліморфних локусів (Р) як у випадку ISSR-PCR, так і RAPD-PCR, розраховані для бізона та великої рогатої худоби також достовірно не відрізнялися (р<0,05). Це свідчить про близький рівень генетичної мінливості цих видів за дослідженими ДНК-маркерами. Тимчасом значення Hav та Р для трьох RAPD- та всіх ISSR-праймерів у зубра були достовірно нижчими. Таким чином, ступінь генетичної спорідненості між особинами в стаді зубрів унаслідок тісного інбридингу був вищий, ніж у стаді бізонів та великої рогатої худоби.
Порівняння аналогічних показників здійснили також для популяцій дикої уссурійської та сортів культурної сої. Серед отриманих продуктів ампліфікації було виявлено 53,33 % поліморфних. Рівень поліморфізму, розрахований окремо для кожного методу ДНК-фінгерпринту, виявився порівнянним: 55,17 % для ISSR-PCR та 51,95 % для RAPD-PCR.
Таблиця 3. Показники генетичної мінливості диких та домашніх представників родини бичачих за ISSR- та RAPD-маркерами
Праймер ВРХ Зубр Бізон МІ
Hav Р Hav Р Hav Р
(GA)9C 0,348 0,72 0,212 0,72 0,346 0,43 3,44
(AG)9C 0,198 0,42 0,126 0,42 0,189 0,34 3,86
(AC)9C 0,232 0,23 0,134 0,17 0,228 0,13 3,26
(AC)9T 0,335 0,67 0,236 0,68 0,332 0,47 3,17
UBC-10 0,246 0,48 0,212 0,34 0,318 0,24 4,12
UBC-13 0,187 0,35 0,146 0,26 0,164 0,21 3,93
UBC-14 0,286 0,42 0,192 0,36 0,264 0,32 3,84
UBC-15 0,134 0,13 0,126 0,24 0,137 0,20 3,63
Певні відмінності було виявлено і в структурних особливостях спектрів ISSR- та RAPD-PCR, притаманних кожному з досліджених видів сої. У випадку ISSR-PCR популяції дикої сої мали більше продуктів ампліфікації та більшу кількість поліморфних ПЛР-локусів на праймер, ніж сорти. Було виявлено 8 амліконів, представлених лише у генотипах дикої сої та удвічі меншу кількість видоспецифічних ампліконів у сортів сої. RAPD-спектри диких популяцій сої мали меншу “різноманітність”. Отримано три унікальних локуси, що зустрічалися лише у дикої сої. Не виявлено ПЛР-продуктів, представлених тільки у культурних сортів, тобто спектри культурної сої репрезентували окрему сорт-специфічну частину спектрів дикої сої. Разом з тим, рівень генетичної мінливості за показниками середньої гетерозиготності та частини поліморфних локусів суттєво не різнилися у сортів культурної та популяцій дикої сої як за використання RAPD-PCR-, так і ISSR-PCR-праймерів. Аналогічну картину спостерігали в разі порівняння маркерних індексів (МІ).
Інформативність маркерів ISSR-PCR та RAPD-PCR у міжвидовій диференціації геномів. Побудовані на основі отриманих спектрів ампліфікації маркерів RAPD-PCR дендрограми генетичних взаємовідносин між великою рогатою худобою (ВРХ), зубром та бізоном не збігалися з дендрограмами для маркерів ISSR-PCR.
За даними RAPD-аналізу, генетично найближчими виявилися бізон та зубр, а найвіддаленішими - пара ВРХ - бізон. За даними поліморфізму ISSR-маркерів, генетично найближчими виявилися ВРХ та зубр. Генетичні дистанції, розраховані на основі індексів генетичної подібності у випадку RAPD-аналізу, були дещо більшими.
На нашу думку, на характер кластеризації одомашненого виду та представників дикої фауни вплинули особливості застосованих методів ПЛР (з випадковими праймерами). І якщо у випадку RAPD-PCR розташування видів повністю узгоджується з уявленнями про їхню еволюцію, то результати оцінки генетичної спорідненості видів за ISSR-маркерами з динуклеотидними мікросателітними послідовностями не збігаються з сучасними уявленнями щодо філогенетичних взаємовідносин між цими видами тварин. При цьому кластеризація видів, виконана окремо за кожним із ISSR-праймерів, також різнилась. Це можна пояснити особливістю методу ISSR-PCR - ампліфікації послідовності ДНК, безпосередньо повязаної з мікросателітами, швидкість мутацій яких може коливатися, що істотно ускладнює тлумачення отриманих результатів. Очевидно, що високий рівень поліморфізму маркерів ISSR- та RAPD-PCR зручний і незамінний у разі вирішення завдань внутрішньовидового аналізу, але може призводити до певних помилок під час міжвидових порівнянь.
Таким чином, залежно від типу маркерів та нуклеотидної послідовності праймерів оцінка генетичної спорідненості трьох видів - зубрів, бізонів та великої рогатої худоби - може бути різною. Відтак, у випадку ДНК-аналізу необхідна індивідуальна оцінка інформативності та ефективності використання окремих маркерів для виконання конкретних завдань.
Генетична паспортизація сортів сої за використання поліморфних спектрів ампліфікації RAPD- та ISSR-PCR. Для генетичної паспортизації 14 сортів культурної сої за допомогою RAPD-PCR було використано 5 декануклеотидних праймерів - UBC-1, UBC-2, UBC-3, UBC-6 та UBC-9, спектри яких мали поліморфні та чіткі амплікони. У випадку ISSR-PCR було застосовано 2 тринуклеотидні праймери - (AGC)6G та (CTC)6A - і один динуклеотидний - (АС)9С. Під час аналізу до уваги брали поліморфні продукти ампліфікації, що стабільно відтворювалися не менш ніж у трьох незалежних експериментах і легко типувалися.
Дані спектрів електрофоретичного розділення продуктів ампліфікації записували, використовуючи бінарний код: 1 - наявність, 0 - відсутність відповідної смуги (амплікону) на треку. На основі бінарного коду реєстрували генотип рослини у вигляді “генетичної формули” - кожному праймеру присвоювали відповідну літеру латинського алфавіту, а поліморфному локусу - порядковий номер (табл. 4).
Таблиця 4. Генетичні формули досліджуваних сортів культурної сої за даними RAPD- та ISSR-аналізу
Загалом за участі пяти RAPD-праймерів було використано 19, а трьох ISSR-праймерів - 16 поліморфних продуктів ампліфікації ПЛР. Їх виявилось достатньо для точної паспортизації досліджених сортів. Генетичну ідентифікацію окремого сорту проводили шляхом порівняння отриманої генетичної формули з формулами усіх проаналізованих сортів.
Дискримінаційна здатність ISSR-праймерів з ди- та тринуклеотидними мікросателітними мотивами. Структурні особливості ISSR-маркерів аналізували за спектрами ампліфікації, отриманими для великої рогатої худоби та сортів сої. Сумарні результати проведеного дослідження наведено у таблиці 5.
Таблиця 5. Характеристика використаних у роботі ISSR-праймерів
Праймер Bos taurus Glycine max L. кількість ампліконів маркерний індекс тип реакції* кількість ампліконів маркерний індекс тип реакції
(TG)9C - - 2 - - 2
(TG)9A - - 2 - - 2
(GT)10C 14 2,82 3 - - 1
(GT)9C 12 3,22 3 - - 2
(AC)9G 8 1,12 3 9 3,12 3
(AC)9C 11 3,26 3 13 2,94 3
(AC)9T 7 3,17 3 13 2,86 3
(GA)9C 8 3,44 3 10 2,78 3
(AG)9C 9 3,86 3 13 3,26 3
(CT)9G 10 2,34 3 - - 2
(AGC)6G 32 4,86 3 42 4,18 3
(AGC)6C 18 4,12 3 - - 3
(AGC)6T 16 3,98 3 - - 2
(TCG)6G 16 3,46 3 14 3,24 3
(GCT)6A 12 4,42 3 - - 1
(CAC)7T - - 2 26 3,42 3
(CAC)7A - - 2 - - 1
(GTG)7A 19 4,22 3 28 3,95 3
(GTG)7C 14 3,16 3 - - 2
(CTC)6A 12 2,96 3 12 2,89 3
(CTC)6C 10 2,24 3 - - 1
(GAG)6C - - 2 15 3,14 1
Примітка:* тип реакції: 1 - відсутність ампліконів, 2 - дифузні спектри без чітких дискретних смуг, 3 - чіткі продукти та інформативні спектри ПЛР
На основі одержаних спектрів ISSR-праймери розділили на три групи. До першої належали праймери, за використання яких ПЛР-продукти були відсутні. Таку картину спостерігали лише за аналізу рослинної ДНК з праймерами (GT)10C, (GCT)6A, (CAC)7A, (CTC)6C та (GAG)6C. Поясненням цього може бути відсутність у геномі сої мікросателітних локусів з такою кількістю повторів або особливістю їх утворення та еволюції (існування недосконалих повторів). генетичний поліморфізм бізон худоба
До другої групи належали праймери, для яких були характерні дифузні спектри без чітких дискретних смуг: (TG)9C, (TG)9A, (GT)9C, (CT)9G, (AGC)6T та (GTG)7C - у випадку ПЛР-аналізу сої та (TG)9C, (TG)9A, (CAC)7T, (CAC)7A та (GAG)6C - з пробами ДНК великої рогатої худоби. З огляду на те, що ПЛР дає змогу ефективно ампліфікувати локуси, відстань між якими становить не більше 3 т.п.о., така картина може свідчити про розташування інвертованих локусів на більшій відстані один від одного або з їх великою кількістю у досліджених геномах. У такому разі для успішного застосування цих праймерів доцільно збільшувати кількість якірних нуклеотидів з метою підвищення специфічності реакції.
Для третьої групи, до якої належала більшість використаних у роботі олігонуклеотидів, одержано чіткі продукти та інформативні спектри ампліфікації. Загальна кількість ампліконів варіювала залежно від мікро- сателітного мотиву праймеру, якірного нуклеотиду та досліджуваного геному.
Під час аналізу геному великої рогатої худоби було отримано більшу кількість поліморфних локусів (8 з динуклеотидною послідовністю та 9 - з тринуклеотидною), ніж за аналізу рослинної ДНК (5 з динуклеотдною послідовністю та 6 - з тринуклеотидною). При цьому показники середньої кількості та частки поліморфних локусів для тринуклеотидних праймерів були достовірно вищими (табл. 6). Значення маркерних індексів тринуклеотидних праймерів, які дають змогу оцінити поліморфність окремих праймерів у разі дослідження того чи іншого геному, також були вищими як за аналізу рослин, так і тварин.
Таблиця 6. Середня кількість (Ncp) та частка поліморфних локусів (Рср) за використання маркерів ISSR-PCR
Праймери Glycine max L. Bos taurus
Ncp Рср Ncp Рср
Динуклеотидні 11,60 6,40 11,25 6,80
Тринуклеотидні 22,83 10,17 16,50 12,40
Таким чином, отримані в роботі результати засвідчили, що тестовані методи мультилокусного ДНК-профілювання - ISSR- та RAPD-PCR, характеризуються достатнім рівнем генетичного поліморфізму для вирішення практичних та теоретичних завдань сільськогосподарської генетики (генетичної паспортизації, визначення рівня генетичного поліморфізму та ін.). Проведення полімеразної ланцюгової реакції за чітким алгоритмом та за оптимальних умов зумовлює отримання відтворюваних та інформативних ПЛР-спектрів.
Одержані результати в перспективі можуть бути використані для спрямованого вибору праймерів, дають змогу рекомендувати високополіморфні маркери для генетичної диференціації геномів тварин і рослин, передусім для аналізу на видовому рівні. Разом з тим, застосування маркерів ISSR- та RAPD-PCR для міжвидових порівнянь має певні обмеження, які варто враховувати під час виконання філогенетичних досліджень.1. На прикладі представників підродини Bovinae та підродини Phaseoleae теоретично обґрунтовано і практично доведено високу інформативність ISSR- та RAPD-маркерів для генетичної диференціації геномів вищих організмів, а також можливість їхнього використання для генетичної паспортизації.
2. Найважливішим етапом екстракції ДНК, що впливає на якісні та кількісні характеристики препарату ДНК, є початковий лізис біологічного матеріалу. Додаткове очищення препарату ДНК методом сорбції на силіцій оксиді уможливлює отримання чітких та відтворюваних спектрів ампліфікації ISSR- та RAPD-PCR.
3. Оптимальними умовами проведення полімеразної ланцюгової реакції за використання досліджених у роботі 22 ISSR- та 9 RAPD-праймерів є наступні: концентрація геномної ДНК - 30-60 нг; іонів Mg2 - 1,8-2,2ММ; DNTP - 200 МКМ; Taq-полімерази - 0,8-1,2 од.; ISSR-праймерів - 0,3-0,6 МКМ; RAPD-праймерів - 0,4-0,7 МКМ; кількість циклів - 32 для ISSR-PCR та 35-37 для RAPD-PCR; температура відпалу - 52-58?С та 45?С відповідно.
4. Одомашнений (Bos taurus) і дикі види тварин підродини бичачих (Bison bison, Bison bonasus), а також сорти культурної (Glycine max L.) та популяції дикої уссурійської сої (Glycine soja) характеризуються високим і порівнянним рівнем генетичної мінливості за маркерами ISSR- та RAPD-PCR. Так, середня гетерозиготність сірої української породи за маркерами ISSR- та RAPD-PCR становила відповідно 0,278 та 0,213, бізона - 0,274 та 0,221, зубра - 0,177 та 0,169. Аналогічні показники для дикої та культурної сої становили відповідно 0,357 та 0,345 і 0,411 та 0,406.
5. Залежно від типу маркерів та нуклеотидної послідовності праймерів, оцінка генетичної спорідненості трьох видів - зубрів, бізонів та великої рогатої худоби - може бути різною. Відтак у випадку ДНК-аналізу необхідна індивідуальна оцінка інформативності та ефективності використання окремих маркерів для виконання міжвидових порівнянь.
6. Поліморфні системи маркерів ISSR- та RAPD-PCR дають змогу проводити генетичну паспортизацію. Так, для ідентифікації 14 сортів сої різного еколого-географічного походження достатнім було застосувати 5 RAPD-праймерів (UBC-1, UBC-2, UBC-3, UBC-6, UBC-9) або 3 ISSR-праймери ((AGC)6G, (CTC)6A, (AC)9C).
7. Серед досліджених 9 RAPD- та 22 ISSR-праймерів найбільш інформативними для генетичної диференціації геномів виявлено ISSR-маркери з тринуклеотидними мікросателітними повторами. Середня кількість і частка поліморфних локусів за цими маркерами у сірої української породи великої рогатої худоби становила відповідно 16,6 та 12,4, у сортів сої - відповідно 22,8 та 10,2.
Пропозиції виробництву
1. Для уникнення зниження рівня генетичного поліморфізму та накопичення негативних ефектів близькоспорідненого схрещування в генетико-селекційній роботі слід проводити попередню молекулярно-біологічну паспортизацію тварин та рослин.
2. Під час проведення паспортизації та визначання рівня генетичної мінливості тварин і рослин доцільно використовувати ISSR-праймери з тринуклеотидними мікросателітними повторами, які характеризуються високим рівнем поліморфізму, а відтак мають високу інформативність.
3. Методи мультилокусного профілювання на основі ПЛР - RAPD-PCR та ISSR-PCR - рекомендуються для використання у селекційній практиці з метою захисту авторських прав селекціонерів та уникнення нелегального розповсюдження перспективного селекційного матеріалу, у програмах зі збереження рідкісних і зникаючих видів сільськогосподарських та диких тварин.
Список литературы
1. Полиморфизм белков, RAPD-PCR и ISSR-PCR маркеров у зубров, бизонов и крупного рогатого скота / В.И. Глазко, Т.Н. Дымань, С.И. Тарасюк, А.В. Дубин // Цитология и генетика. - 1999. - Т. 33, № 6. - С. 30-39. (Дисертант брав участь у проведенні експерименту, аналізі матеріалу, написанні статті).
2. Генетические взаимоотношения между сортами сои, оцененные с использованием ISSR-маркеров / В.И. Глазко, А.В. Дубин, Р.И. Календарь, Г.В. Глазко // Цитология и генетика. - 1999. - Т. 33, № 5. - С. 47-51. (Дисертант провів дослідження, обробку та аналіз результатів, взяв участь у написанні статті).
3. Дубін О.В. Тестування умов проведення ISSR-PCR та їх оптимізація для аналізу геному сої (Glycine max) / О.В. Дубін, Т.М. Димань // Вісник Білоцерківського державного аграрного університету. - Біла Церква, 2007. - Вип.46. - С.49-54. (Дисертант провів дослідження, обробку та аналіз матеріалу, написав статтю).
4. Дубін О.В. Генетична паспортизація сортів сої (Glycine max) за допомогою RAPD-PCR / О.В. Дубін, Т.М. Димань // Аграрні Вісті. - 2007. - №.1. - С.12-15. (Дисертант провів дослідження, обробку та аналіз результатів, написав статтю).
5. Дубін О.В. Інформативність маркерів ISSR-PCR у дослідженні геномів рослин і тварин / О.В. Дубін, Т.М. Димань // Аграрні вісті. - 2008. - №2. - С.7-9. (Дисертант провів дослідження, обробку та аналіз результатів, написав статтю).
6. Дубін О.В. Поліморфізм маркерів ISSR-PCR та RAPD-PCR у деяких представників підродини бичачих / О.В. Дубін, Т.М. Димань // Вісник Білоцерківського національного аграрного університету. - 2008. - Вип.53. - С.43-48. (Дисертант провів дослідження, обробку та аналіз результатів, написав статтю).
7. Глазко В.И. Полиморфизм ISSR у некоторых сортов сои / В.И. Глазко, А.В. Дубин, Г.В. Глазко, Р.И Календарь // Наукові основи стабілізації виробництва продукції рослинництва: міжнар. конф.: тези доп. - Харків, 1999. - С. 139-141.
8. Дубин А.В. ISSR-маркеры в анализе генетических взаимоотношений между сортами домашней сои и популяциями дикой сои / А.В. Дубин, В.И. Глазко // Землеробство ХХІ століття - проблеми та шляхи вирішення: міжнарод. наук.-практ. конф., 8-10.06.1999: тези доп. - Київ-Чабани, 1999.- С.184-185.
9. Дубін О.В. Молекулярно-генетичний поліморфізм та паспортизація сортів культурної сої за використання RAPD-PCR та ISSR-PCR / О.В. Дубін // Наукові пошуки молоді у третьому тисячолітті: IV держ. наук.-практ. конф., 16-17.05.2007: тези доп. - Біла Церква, 2007. - С.26.
10. Дубін О.В. Оптимізація умов проведення ISSR-PCR та RAPD-PCR для аналізу геномів рослин та тварин / О.В. Дубін // Наукові пошуки молоді у третьому тисячолітті: міжн. наук.-практ. конф., 15-16.05.2008: тези доп. - Біла Церква, 2008. - С.64.
Вы можете ЗАГРУЗИТЬ и ПОВЫСИТЬ уникальность своей работы
