Сравнительная характеристика физико-химических свойств основных типов гемоглобина. Оптимизация клинической оценки состояния красной крови. Формирование комплексной схемы количественного анализа гемоглобинового спектра на основе иммунохимических тестов.
При низкой оригинальности работы "Гемоглобины человека: иммунобиохимическая характеристика и медико-биологическое значение", Вы можете повысить уникальность этой работы до 80-100%
В последние годы появились единичные работы по изучению отдельных типов гемоглобина с помощью иммунохимических тест-систем [Никулина 2002; Токарев Ю.Н. Пополнены фундаментальные данные по физико-химическим свойствам HBA1, HBA2, HBF, получены новые сведения по некоторым физико-химическим свойствам эмбрионального гемоглобина: относительной электрофоретической подвижности в полиакриламидном и агарозном гелях, изоэлектрической точке, степени щелочной резистентности и отношению к осаждающим агентам, на основании чего разработаны и апробированы оригинальные алгоритмы их выделения и очистки. Внедрение результатов исследования позволит оптимизировать способы аналитической и препаративной работы с основными типами гемоглобина человека, осуществлять более точный и полный анализ гемоглобинового статуса и состояния красной крови, что будет способствовать улучшению диагностики, лечения и прогноза заболеваний, сопровождающихся изменением концентрации общего гемоглобина или отдельных его типов. Основные положения диссертации доложены на V научной конференции с международным участием "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" 2001; на III съезде биохимического общества РАН (Санкт-Петербург, 2002); на 2-й и 3-й научно-практической конференции и школе-семинаре для молодых ученых с международным участием "Белки-маркеры патологических состояний" (Астрахань-Москва, 2001, 2003); на научно-практической конференции с международным участием "Современные достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины" (Астрахань-Москва, 2004), (Астрахань-Волгоград-Москва, 2006), (Астрахань-Москва 2008); на VIII Международной научной конференции "Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского моря" (Астрахань, 2005); на международной научной конференции, посвященной 450-летию г. Установлено, что все методы обратимого и необратимого осаждения, за исключением осаждения слабыми растворами кислот и щелочей, не позволяют разделять типы гемоглобина, однако могут быть использованы для очистки Hb от других белков и концентрирования препаратов гемоглобина.Получены новые достоверные сведения (Р<0,01) по некоторым физико-химическим свойствам эмбрионального гемоглобина: относительной электрофоретической подвижности в полиакриламидном и агарозном гелях, изоэлектрической точке, степени щелочной резистентности и отношению к осаждающим агентам. Впервые сконструирована селективная иммунодиффузионная тест-система на эмбриональный гемоглобин с порогом чувствительности 4,25±0,22 мг/л и смоделированы иммунохимические тест-системы на фетальный гемоглобин с чувствительностью 2,21±0,26 мг/л; на гемоглобин А 1 и А 2-с порогом чувствительности 3,24±0,18 мг/л и 4,42±0,19 мг/л соответственно. Разработаны и успешно апробированы оптимальные алгоритмы количественного анализа изучаемых типов гемоглобина, отличающиеся простотой, специфичностью (Р<0,01), точностью (погрешность <3 %), экономичностью: индикация HBP модифицированным методом двойной иммунодиффузии (чувствительность 2,17±0,33 мг/л); количественное определение HBF методом ракетного иммуноэлектрофореза (чувствительность 1,7±0,29 мг/л); количественный анализ HBA1 и HBA2 по Манчини (чувствительность 2,1±0,32 мг/л и 2,9±0,41 мг/л соответственно). Создана и успешно апробирована на больших выборках клинического материала комплексная схема количественной оценки гемоглобинового спектра по основным типам гемоглобина, отличающаяся специфичностью, надежностью (коэффициент Пирсона 0,98), чувствительностью (порог от 1,7±0,29 до 2,13±0,3 мг/л), точностью (±1,2 %), достоверностью (р<0,001), экономичностью. Определена диагностическая роль тестов на HBP и HBF при патологии новорожденных: впервые выявлен HBP в крови новорожденных с тяжелой внутриутробной гипоксией (33,82 %); отмечено повышение уровня HBF в крови новорожденных с тяжелой внутриутробной гипоксией на 30,08 %, - с ЗВУР в сочетании с тяжелой внутриутробной гипоксией на 68,46 % и снижение концентрации HBF в крови новорожденных с массой тела менее 1000 г на 58,25 %.
Вывод
1. Получены новые достоверные сведения (Р<0,01) по некоторым физико-химическим свойствам эмбрионального гемоглобина: относительной электрофоретической подвижности в полиакриламидном и агарозном гелях, изоэлектрической точке, степени щелочной резистентности и отношению к осаждающим агентам. Аналогичные сведения по HBA1, HBA и HBF уточнены и дополнены.
2. Отмечено изменение электрофоретической подвижности HBP под действием тритонов, мочевины и бихромата калия. Показано, что ДСН меняет вектор электрофоретической подвижности гемоглобинов на противоположный и увеличивает их скорость движения, что было положено в основу разработки способа количественного определения HBF.
3. Разработаны и апробированы эффективные алгоритмы выделения и очистки четырех типов гемоглобина со степенью чистоты HBF - 85,58 %; HBP -30,54 %; HBA1-95,52 %; HBA2-35,32 %, позволившие получить моновалентные антисыворотки на HBA1, HBA2, HBF и HBP.
4. Впервые сконструирована селективная иммунодиффузионная тест-система на эмбриональный гемоглобин с порогом чувствительности 4,25±0,22 мг/л и смоделированы иммунохимические тест-системы на фетальный гемоглобин с чувствительностью 2,21±0,26 мг/л; на гемоглобин А 1 и А 2- с порогом чувствительности 3,24±0,18 мг/л и 4,42±0,19 мг/л соответственно.
5. Разработаны и успешно апробированы оптимальные алгоритмы количественного анализа изучаемых типов гемоглобина, отличающиеся простотой, специфичностью (Р<0,01), точностью (погрешность <3 %), экономичностью: индикация HBP модифицированным методом двойной иммунодиффузии (чувствительность 2,17±0,33 мг/л); количественное определение HBF методом ракетного иммуноэлектрофореза (чувствительность 1,7±0,29 мг/л); количественный анализ HBA1 и HBA2 по Манчини (чувствительность 2,1±0,32 мг/л и 2,9±0,41 мг/л соответственно).
6. Создана и успешно апробирована на больших выборках клинического материала комплексная схема количественной оценки гемоглобинового спектра по основным типам гемоглобина, отличающаяся специфичностью, надежностью (коэффициент Пирсона 0,98), чувствительностью (порог от 1,7±0,29 до 2,13±0,3 мг/л), точностью (±1,2 %), достоверностью (р<0,001), экономичностью.
7. Показана высокая достоверная зависимость продукции антенатальных гемоглобинов от сроков гестации в раннем эмбриогенезе человека (4-12 недель гестации): для эмбрионального гемоглобина корреляция является нелинейной отрицательной, r=-0,89; для фетального - положительной, r=0,94. Установлены сроки начала продукции HBP с 4-й недели гестационного возраста, HBF - с 5-й недели.
8. Доказано значение HBP и HBF как канцероэмбриональных антигенов в диагностике миелопролиферативных заболеваний: Эмбриональный гемоглобин впервые выявлен в крови больных эритремией (частота выявления 67,78 %), сублейкемическим миелозом (49,41 %), острым (24,44 %) и хроническим миелолейкозом (20,53 %). Отмечено достоверное повышение концентрации фетального гемоглобина в крови больных эритремией (превышение референтных значений на 78,8 %), сублейкемическим миелозом (на 42,7 %), острым (на 58,06 %,) и хроническим (на 70,20 %) миелолейкозом.
9. Определена диагностическая роль тестов на HBP и HBF при патологии новорожденных: впервые выявлен HBP в крови новорожденных с тяжелой внутриутробной гипоксией (33,82 %); отмечено повышение уровня HBF в крови новорожденных с тяжелой внутриутробной гипоксией на 30,08 %, - с ЗВУР в сочетании с тяжелой внутриутробной гипоксией на 68,46 % и снижение концентрации HBF в крови новорожденных с массой тела менее 1000 г на 58,25 %. Отмечена корреляция уровней HBP и HBF с полом новорожденных (r=0,96 и r=0,93).
10. Установлено диагностическое значение иммунохимического теста на фетальный гемоглобин при наркологической патологии. Впервые отмечено достоверное превышение концентрации фетального гемоглобина в крови больных опийной наркоманией (на 184,3 % превышает полученные референтные величины) и алкогольной зависимостью (выше на 150,9 %) (Р<0,001).
Практические рекомендации: 1. При очистке основных типов гемоглобина рекомендуется использовать методы фракционирования, основанные на разделении по изоэлектрической точке (с учетом полученных данных по величинам РІ): ионообменную хроматографию и препаративный электрофорез. При применении электрофоретических методов разделения гемоглобинов в качестве рабочего буфера эффективнее использовать буферы с РН от 6,0 до 6,6 (цитратный, ацетатный и др.). На ранних этапах выделения HBP использовать модифицированную методику щелочной денатурации с 40-секундной экспозицией в 1,2 н NAOH.
2. При получении антисывороток на HBA2, HBF и HBP использовать только очищенные препараты этих протеинов. Иммунизацию проводить по описанной комбинированной схеме (адъювант Фрейнда и алюмовокалиевые квасцы). Проводить истощение ?-цепями гемоглобина на Bio-Gel 300. При иммунизации препаратом HBA1, эффективно его предварительное разведение в 500-2000 раз.
3. Внедрить в клинико-лабораторную практику метод ракетного иммуноэлектрофореза с ДСН для количественного определения HBF; трехэтапную методику РИД-тестирования при индикации HBP; РИД по Манчини в количественном анализе HBA1 и HBA2. При применении названных методов определения гемоглобинов пользоваться смоделированными калибровочными графиками.
4. Внедрить разработанную схему количественного анализа гемоглобинового спектра для комплексной оценки уровней HBA1, HBA2, HBF и HBP.
5. Рекомендуется использовать разработанные тесты на HBF и HBP при скрининг-анализе и диагностике миелопролиферативных заболеваний: эритремии, сублейкемического миелоза, острых и хронических миелолейкозов.
6. Дополнять классические схемы оценки степени тяжести и прогноза гипоксии новорожденных, ЗВУР и глубокой недоношенности, иммунохимическими тестами на эмбриональный и фетальный гемоглобины.
7. В оценке тяжести и эффективности лечения больных опийной наркоманией и алкогольной зависимостью целесообразно дополнение общепринятых схем тестом на HBF.
Список литературы
1. Nikulina D.M., Kriventsev Y.A., Djachina M.N. Immunochemical test-systems for diagnostics and estimations to efficiency of the treatment of the inflammatory process // International journal of immunorehabilitation. - Israel. - Maj 2000. - V.2. - №2. P.12.
2. Агапова А.Б., Дьякова О.Н., Кривенцев Ю.А. Разработка диагностической иммунодиффузионной тест-системы на фетальный гемоглобин // Материалы конференции молодых ученых с международным участием "Белки-маркеры патологических состояний". - Астрахань-Москва. - 2001. - С. 101-102.
3. Агапова А.Б., Кривенцев Ю.А. Получение чистого антигена и моделирование тест-системы на фетальный гемоглобин // Материалы 82-й итоговой студенческой научной конференции АГМА. Астрахань. - 2001. - С. 13.
4. Никулина Д.М., Дьякова О.Н., Кривенцев Ю.А., Корноухова И.Ю., Агапова А.Б. Фетальный гемоглобин как тест для диагностики гипоксических состояний // Материалы III съезда биохимического общества РАН. - С.-Пб. 2002. - С. 131.
5. Никулина Д.М., Сентюрова Л.Г., Кривенцев Ю.А., Агапова А.Б., Дьякова О.Н. Отчет о научно-исследовательской работе разработка иммунохимических тест-систем для выявления и оценки гипоксических состояний и деструкции тканей в организме человека // Отчет включен в национальный фонд РФ. Инвентарный № 02.2.00403489.
6. Метелкина Е.В., Коханов А.В., Агапова А.Б., Кривенцев Ю.А., Суринков Д.Б. Железосодержащие белки в остром периоде черепно-мозговой и скелетной травмы // Материалы научно-практической конференции и школы-семинара для молодых ученых с международным участием "Современные достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины". - Астрахань-Москва. - 2004. - с. 114-118.
7. Бисалиева Р.А., Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Краморенко П.В. Разработка способа выделения эмбрионального гемоглобина и моделирование иммунохимической тест-системы на него / Материалы научно-практической конференции с международным участием "Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины". - Астрахань-Волгоград-Москва. - 2006. - С. 34-37.
8. Кривенцев Ю.А., Бисалиева Р.А., Ковалева Н.А., Лада Л.В. Получение специфической антисыворотки на фетальный гемоглобин / Материалы научно-практической конференции с международным участием "Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины". - Астрахань-Волгоград-Москва. - 2006. - С. 62-65.
9. Коханов А.В., Метелкина Е.В., Кривенцев Ю.А., Белопасов В.В. Суточные ритмы показателей системы эритрона у больных с тяжелой черепно-мозговой травмой / Труды Астраханской государственной медицинской академии. - Астрахань. - 2006. - Т.33. - С. 264-267.
10. Кривенцев Ю.А., Бисалиева Р.А., Никулина Д.М., Краморенко П.В., Семенова Т.Б. Иммунохимический анализ продукции эмбрионального гемоглобина в раннем эмбриогенезе человека / Материалы научно-практической конференции с международным участием "Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины". - Астрахань-Волгоград-Москва. - 2006. - С. 58-62.
11. Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисалиева Р.А., Пичугина Н.А. Разработка способа количественного определения фетального гемоглобина человека / Материалы научно-практической конференции с международным участием "Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины". - Астрахань-Волгоград-Москва. - 2006. - С. 65-68.
12. Никулина Д.М., Кривенцев Ю.А., Бахмутова Л.А., Бисалиева Р.А., Штепо М.В., Лапеко С.В. Определение эмбрионального гемоглобина в крови новорожденных с внутриутробной гипоксией / Материалы научно-практической конференции с международным участием "Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины". - Астрахань-Волгоград-Москва. - 2006. - С. 72-73.
13. Коханов А.В., Метелкина Е.В., Кривенцев Ю.А., Белопасов В.В. Суточные ритмы показателей системы эритрона у больных с тяжелой черепно-мозговой травмой // Труды Астраханской государственной медицинской академии. - Астрахань. - 2006. - Т.33. - С. 264-267.
14. Кривенцев Ю.А., Бисалиева Р.А., Носков И.А. Изучение воздействия детергентов на эмбриональный гемоглобин // Вестник Астраханского государственного технического университета. - Астрахань. - 2006. - №6. - Т.35. - С. 69-72.
15. Бахмутова Л.А., Кривенцев Ю.А., Огуль Л.А. Выявление эмбрионального гемоглобина в крови новорожденных с внутриутробной гипоксией // Вопросы практической педиатрии. - М. - 2006. - Т.1. - №4. - С. 12.
16. Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисалиева Р.А., Борисова Н.Б., Бисалиев Р.В. Экспрессия ?-гена эмбрионального гемоглобина при гематологической патологии // Успехи современного естествознания. - М. - 2007. - №3. - С. 72-75.
17. Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисалиева Р.А. Иммунохимический анализ концентрации фетального гемоглобина в крови новорожденных мальчиков и девочек с внутриутробной гипоксией // Омский научный вестник. - Омск. - 2006. - №9. - Т.46. - С. 272-274.
18. Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисалиева Р.А., Борисока Н.В. Иммунохимический анализ содержания эмбрионального гемоглобина в крови больных с онкогематологической патологией // Омский научный вестник. - Омск. - 2006. - №8. - Т.44. - С. 279-281.
19. Кривенцев Ю.А., Бисалиева Р.А., Никулина Д.М., Носков А.И. Моделирование нового способа количественного анализа плодового гемоглобина человека // Фундаментальные исследования. М. 2007. №4. С. 76-78.
20. Кривенцев Ю.А., Бисалиева Р.А., Семенова Т.Б., Никулина Д.М., Краморенко П.В. Изучение относительной электрофоретической подвижности анте- и постнатальных типов гемоглобина человека / Астраханский медицинский журнал. - Астрахань. - 2007. - №2. - С. 102.
21. Никулина Д.М., Кривенцев Ю.А., Бахмутова Л.А., Бисалиева Р.А., Лапеко С. В., Штепо М.В., Огуль Л.А. Фетальный и эмбриональный типы гемоглобина в крови новорожденных с внутриутробной гипоксией / Астраханский медицинский журнал. - Астрахань. - 2007. - №2. - С. 132-133.
22. Бисалиева Р.А., Кривенцев Ю.А., Яблокова И.Ю., Ким И.В., Вафина Р.А. Изучение подходов к выделению и очистке эмбрионального гемоглобина / Материалы конференции молодых ученых АГМА. - 2007. - С. 30-31.
23. Кико Е.Е., Бисалиева Р.А., Кривенцев Ю.А., Ким И.В., Яблокова И.Ю., Вафина Р.А. Иммунохимическое определение эмбрионального гемоглобина у больных гемобластозами / Материалы VI Всероссийской конференции молодых ученых "Актуальные вопросы клинической и экспериментальной онкологии". - М. - 2007. - С. 107-109.
24. Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисалиева Р.А. Гемоглобины человека // Вестник Астраханского государственного технического университета. - Астрахань. - 2007. - №6. - Т.41. - С. 34-41.
25. Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М. Строение и биологическая роль белков гемоглобинового профиля / Гриф УМО 897 от 10.12.2007. Изд-во АГМА, Астрахань, 2007. 101 с.
26. Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисалиева Р.А. Способ количественного определения фетального гемоглобина человека // Бюллетень "Изобретения. Полезные модели". - М. - 10.11.2007. - №31 (III ч.), С. 666.
27. Никулина Д.М., Воробьева Т.Б., Кривенцев Ю.А. Стадиоспецифические белки как маркеры развития плода и состояния новорожденного // Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. - Новосибирск. - 2008. - С. 474.
28. Бисалиева Р.А., Кривенцев Ю.А., Краморенко П.В. Иммунохимический анализ продукции фетального гемоглобина в раннем эмбриогенезе человека // Материалы конференции молодых ученых ГОУ ВПО "АГМА Росздрава". - Астрахань. - 2008. - С. 4-6.
29. Бисалиева Р.А., Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Краморенко П.В., Дьячкова Т.Б. Иммунохимический анализ продукции антенатальных гемоглобинов в раннем эмбриогенезе человека // Российский иммунологический журнал (РАН). - М. "Наука". 2008. - Т.2(11), № 2-3. С. 327.
30. Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисалиева Р.А. Моделирование нового способа определения плодового гемоглобина человека // Астраханский медицинский журнал. - Астрахань. - 2008. - Т.3. - №2. - С. 53-55.
31. Кривенцев Ю.А., Бисалиева Р.А., Батуев Д.Г., Яблокова И.Ю., Вафина Р.А.., Мустафаев И.М. -А. Пополнение сведений по физико-химическим свойствам гемоглобина типов: A1, A2, F и P // Материалы 6-й международной научно-практической конференции "Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины". - Астраханский медицинский журнал. Астрахань-Москва. 2008. Т.3. №3. С. 20-22.
32. Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Заклякова Л.В., Бисалиева Р.А., Борисова Н.В., Кико Е.Е., Ким И.В. Иммунохимический тест на антенатальные гемоглобины в гематологии // Материалы 6-й международной научно-практической конференции "Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины". - Астраханский медицинский журнал. - Астрахань-Москва. - 2008. - Т.3. - №3. - С. 106-110.
33. Коханов А.В., Никулина Д.М., Кривенцев Ю.А., Белопасов В.В., Метелкина Е.В. Фетальный гемоглобин как маркер гипоксии при черепно-мозговой травме // Материалы 6-й международной научно-практической конференции "Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины". - Астраханский медицинский журнал. - Астрахань-Москва. - 2008. - Т.3. - №3. - С. 171-173.
34. Никулина Д.М., Кривенцев Ю.А., Бисалиева Р.А. Иммунохимический тест на примитивный гемоглобин: перспективы внедрения. // Материалы 6-й международной научно-практической конференции "Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины". - Астраханский медицинский журнал. - Астрахань-Москва. - 2008. - Т.3. - №3. - С. 185-188.
35. Бисалиева Р.А., Кривенцев Ю.А., Бисалиев Р.В., Кальной В.С. Иммунохимический анализ фетального гемоглобина в крови наркологических больных // Наркология. - М. - 2009. - №1(85). - С. 95-97.
36. Кривенцев Ю.А., Бисалиева Р.А., Никулина Д.М. Модификация способа количественного анализа эмбрионального гемоглобина человека // Материалы межрегиональной научно-практической конференции "Актуальные проблемы кардиологии детей и взрослых-2009". - Астрахань. 2009. С. 138-140.
37. Бисалиева Р.А., Штепо М.В., Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М. Железосодержащие белки в крови новорожденных с внутриутробной гипоксией // Материалы международна наукова конференція студентів та молодих вчених "Молодь медицині майбутнього". - Одесса. - 2009. - С. 71.
38. Кривенцев Ю.А., Бисалиева Р.А., Никулина Д.М., Носков А.И. Разработка оптимального алгоритма для создания иммунохимической тест-системы на примитивный гемоглобин человека // Вестник российской военно-медицинской академии. - С. -Пб. - 2009. - №1(25). - С. 450.
39. Никулина Д.М., Кривенцев Ю.А., Бахмутова Л.А., Бисалиева Р.А., Лапеко С.В. Эмбриональный гемоглобин как критерий оценки гипоксии новорожденных // Вестник российской военно-медицинской академии. - С. -Пб. - 2009. - №1(25). - С. 450-451.
40. Бахмутова Л.А., Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Лапеко С. В., Бисалиева Р.А. Антенатальные гемоглобины в оценке течения раннего неонатального периода у новорожденных с задержкой внутриутробного развития // Вестник российской военно-медицинской академии. - С. -Пб. - 2009. - №1(25). - С. 451.
41. Бахмутова Л.А., Никулина Д.М., Кривенцев Ю.А. Клиническое значение изучения антенатальных типов гемоглобина для прогноза ранней адаптации у недоношенных новорожденных детей // Вопросы современной педиатрии. - 2009. - Т.8. - №2. - С. 120-122.
Патент на изобретение: Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисалиева Р.А. Способ количественного определения фетального гемоглобина человека // Патент на изобретение №2310204. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений РФ 10.11.2007. г. Москва. - 7 с.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
Hb - гемоглобин
HBA1 и HBA2 - гемоглобины взрослого
HBP - эмбриональный или примитивный гемоглобин
HBF - фетальный гемоглобин
PI - изоэлектрическая точка ?вну - внутригрупповая степень свободы
