Функціональна взаємодія кінази S6 рибосомного білка S6K1 та протеїнкінази 2 - Автореферат

Національна академія наук України Інститут молекулярної біології та генетикиРоботу виконано у відділі структури та функцій нуклеїнових кислот Інституту молекулярної біології та генетики НАН України. Науковий керівник: кандидат медичних наук, старший науковий співробітник Гут Іван Тарасович, Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, провідний науковий співробітник відділу структури та функцій нуклеїнових кислот. Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Негруцький Борис Сергійович, Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, завідувач лабораторії біосинтезу білка відділу механізмів трансляції генетичної інформації; Захист відбудеться “23” травня 2006 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03680, м.Регуляція ж цих процесів на молекулярному рівні відбувається за рахунок передачі позаклітинних стимулів, що індукуються гормонами, факторами росту, цитокінами від рецепторів клітинної мембрани до відповідних компартментів клітини (ядро, рибосоми, мітохондрії), що, в свою чергу, призводить до зміни експресії відповідних генів як на рівні транскрипції, так і на рівні трансляції МРНК. Сама передача такого позаклітинного стимулу опосередкована функціонуванням множинних сигнальних каскадів, в основі яких покладено принцип послідовних білково-білкових та білково-ліпідних взаємодій, що залежать від пострансляційних модифікацій білків чи ліпідів, наприклад фосфорилювання/дефосфорилювання (Taniguchi et al., 2006). Однією із регуляторних ланок сигнальних шляхів є родина Ser/Thr протеїнкіназ S6 білка 80S рибосом (S6K1 та S6K2), що належать до РІ3К/MTOR-залежного сигнального шляху, який є одним із провідних у регуляції основних клітинних функцій, а саме росту клітин, проліферації, диференціації та апоптозу (Volarevic et al., 2001). Доведено, що S6К здатна фосфорилювати in vitro цілу низку інших субстратів, а саме: проапоптичний білок BAD; білок SKAR, що бере участь у сплайсингу МРНК; фактор транскрипції CREM; субстрат інсулінового рецептора (IRS); фактор ініціації трансляції білкового синтезу 4В (EIF4B) (Thomas, 2002). Метою дослідження було ідентифікувати білки-партнери активованої форми кінази рибосомного білка S6 із використанням методу двогібридної системи дріжджів та проаналізувати функціональне значення виявлених взаємодій у клітині.Через 24 години після трансфекції середовище замінювали на безсироваткове та клітини інкубували ще 36 годин. В експериментах із використанням інгібіторів кіназ клітини інкубували у присутності зазначених концентрацій рапаміцину (15 хв) чи TBB (4,5,6,7-тетрабромобензотриазол) (3, 6, 9 годин) перед стимуляцією сироваткою, або ж інгібітори у зазначених концентраціях додавали у середовище. Імунопреципітацію рекомбінантних форм кіназ, злитих із ЕЕ-таг епітопом та рекомбінантних форм СК2b та СК2а/а? з Мус-таг епітопом та НА-епітопом відповідно, здійснювали, інкубуючи лізати клітин із анти-ЕЕ-таг, анти-Мус-таг та анти-НА-таг моноклональними антитілами і білок-А-сефарозою (“GE-healthcare”, США). Збагачені ядерні фракції клітин NIH3T3 та НЕК293 отримували згідно з описаною раніше методикою, чистоту отриманих фракцій аналізували Вестерн-блотом за допомогою специфічних антитіл: проти b-тубуліну - маркеру цитоплазматичної фракції, проти ламіну А/С або топоізомерази-І - маркерів ядерної фракції. Для деяких білків, що взаємодіють з СК2 та фосфорилюються було зясовано фізіологічну роль такого фосфорилювання, що полягає в регуляції субклітинної локалізації білків-субстратів СК2, зміні стабільності та активності білків.Методом двогібридної системи дріжджів шляхом аналізу КДНК бібліотеки клітин лінії HELA, з використанням мутантної форми S6K1 Т412D як “байту”, ідентифіковано 8 нових S6K1-звязувальних білків. Р.40-44.Особистий внесок здобувача - розроблено та протестовано модифіковану методику великомасштабної трансформації з подальшим вирощуванням клітин у напіврідкому агарозному середовищі. Особистий внесок здобувача - автором клоновано СК2в у вектор для бактеріальної експресії PET42a, очищено рекомбінантний білок CK2в-6His-GST та 6His-GST, отримано моноклональні антитіла проти СК2в та 6His-GST та протестовано їх в імуноферментному аналізі, імуноблотингу та імунопреципітації. Особистий внесок здобувача - автором проведено дріжджове двогібридне скринування з використанням S6K1 T412D як байту. Особистий внесок здобувача - автором підтверджено утворення комплексу між СК2 та S6K1 in vivo та існування регульованого ростовими факторами ядерно-цитоплазматичного транспорту S6K1.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ