Експресія протеїнкінази D2 в нормальних та злоякісно трансформованих В-лімфоцитах людини - Автореферат

Накопичення незалежних мутацій та епігенетичних порушень, які ведуть до дисбалансу регуляції сигнальних шляхів, що контролюють проліферацію, ріст клітин, диференціювання, анергію та апоптоз, обумовлюють злоякісну трансформацію клітин. Протеїнкінази родини PKD задіяні в регуляції ключових сигнальних каскадів клітин і транспорті білків із апарату Гольджі, що свідчить про участь цих ферментів в контролі основних біологічних процесів клітини. Беручи до уваги те, що в останні роки кінази родини PKD опинились в центрі уваги трансляційних досліджень в онкології (M Jaggi et al., 2007), було вирішено дослідити особливості експресії PKD2 в нормальних і злоякісно трансформованих В-лімфоцитах та з‘ясувати функціональну роль PKD2 в сигнальних каскадах лімфоцитів. Крім того, дослідження, що представлені в роботі, було виконано за підтримки гранту Національної академії наук України для молодих вчених “Роль ВКР та CD150 в регуляції сигнальних каскадів В-лімфоцитів” (2005-2006 рр.), грантів від фонду Цивільних Досліджень і Розвитку США UKB2-2831-KV-06 (2004-2006 рр.) Міжнародної Асоціації сприяння кооперації вчених INTAS 11-2118 (2002-2004 рр.) та INTAS 03-55-1350 для молодих вчених (2004 - 2007 рр.). Проаналізувати експресію та аутофосфорилювання протеїнкінази PKD2 в нормальних В-лімфоцитах та злоякісно трансформованих клітинах при лімфомах В-клітинного походження, а також зясувати роль PKD2 в регуляції сигнальних шляхів лімфоцитів.В роботі було використано наступні лінії клітин людини: MP-1, LDN, CESS (В-лімфобластоїдні клітинні лінії, трансформовані вірусом Епштейна-Барр), RPMI-8226 (мієлома), REH, BLIN-1 та Nalm-6 (пре-В-клітинний лейкоз), BJAB, Ramos, Raji, Daudi (лімфома Беркітта), Jurkat, CCRF-HSB2 (гострий Т-лімфобласний лейкоз), KM-Н2 та L428 (лімфома Ходжкіна), Corinna II (хронічний лімфолейкоз), SUDHL5, SUDHL8, SUDHL9, OCILY3, OCILY10 та NUDHL1 (дифузні крупноклітинні В-клітинні лімфоми), НТВ119 (дрібноклітинний рак легені) та MCF-7 (рак молочної залози). Експресію PKD1 та PKD2 на рівні білка визначали за допомогою специфічних кролячих поліклональних анти-PKD1/2 антитіл, що розпізнають як PKD1, так і PKD2, які були люб’язно надані проф. Рівень трансфосфорилювання і аутофосфорилювання PKD2 визначали за допомогою кролячих поліклональних антитіл анти-Ser706/710 PKD2 (Upstate, США) та анти-Ser876 PKD2 (Cell Signaling, США), відповідно. Для цитофлуориметричних досліджень при одномоментному фарбуванні клітин та подальшому їх сортуванні, а також внутрішньоклітинного виявлення рівня експресії PKD2 в субпопуляціях В-клітин мигдаликів були використані МКАТ анти-CD138-FITC та анти-CD27-APC (EBIOSCIENCE, San Diego, США), анти-CD19-PE-Cy7 (Biolegend, San Diego, США), анти-CD38-PERCP-Cy5.5 та анти-IGD-біотин (BD Pharmingen, San Diego, США), стрептовідин-Alexa Fluor 700 (Invitrogene, Carlsbad, США) і ослині анти-кролячі IGG-RPE (Jackson IMMUNORESEARCH, West Grove, США). Для з‘ясування рівня експресії та аутофосфорилювання PKD2 в різних субпопуляціях зрілих В-клітин нами був проведений Вестерн-блот аналіз рівня експресії та аутофосфорилювання PKD2 у виділених із мигдаликів субпопуляціях В-клітин, а саме: наївних В-лімфоцитах (CD19 IGD CD27-CD38-CD138-), клітинах зародкових центрів (CD19 IGD-CD27 /-CD38 CD138-), В-клітинах памяті (CD19 IGD /-CD27 CD38-CD138-), плазмабластах (CD19 /-IGD-CD27 HIGHCD38 high CD138-) та плазматичних клітинах (CD19 /-CD138 ).В результаті комплексного дослідження встановлено, що рівень експресії, аутофосфорилювання та внутрішньоклітинна локалізація PKD2 залежать від рівня диференціювання та активації нормальних і злоякісно трансформованих В-лімфоцитів. Підвищення активності PKD2 в злоякісно трансформованих лімфоцитах може сприяти виживанню пухлинних клітин шляхом активації NF-?B сигнального каскаду. Зясовано, що окремі субпопуляції зрілих В-лімфоцитів людини відрізняються за рівнем експресії PKD2. Виділено три групи хворих на дифузну крупноклітинну В-клітинну лімфому, злоякісні клітини яких мають різний рівень диференціювання і відрізняються за внутрішньоклітинною локалізацією, рівнем експресії і аутофосфорилюванням PKD2 і експресією відомого прогностичного маркера цього гістологічного варіанта лімфом - PKC?II.

Основний зміст роботи

В результаті комплексного дослідження встановлено, що рівень експресії, аутофосфорилювання та внутрішньоклітинна локалізація PKD2 залежать від рівня диференціювання та активації нормальних і злоякісно трансформованих В-лімфоцитів. Підвищення активності PKD2 в злоякісно трансформованих лімфоцитах може сприяти виживанню пухлинних клітин шляхом активації NF-?B сигнального каскаду.

1. Встановлено, що в нормальних та злоякісно трансформованих В-лімфоцитах людини експресована PKD2, а не PKD1.

2. Зясовано, що окремі субпопуляції зрілих В-лімфоцитів людини відрізняються за рівнем експресії PKD2. Найвищий рівень експресії PKD2 відмічено в плазмабластах та В-клітинах памяті, а найнижчий - в плазматичних клітинах. Виявлена залежність між стадією диференціювання первинних В-лімфоцитів і рівнем аутофосфорилювання PKD2.

3. Виявлено ВКР-залежну активацію та релокалізацію PKD2 з цитоплазми до ядра в нормальних і злоякісно трансформованих В-лімфоцитах людини.

4. З‘ясовано, що для злоякісно трансформованих клітин хворих на лімфому з малих лімфоцитів, лімфому з клітин мантійної зони та лімфому Беркітта спорадичного типу характерна цитоплазматична експресія PKD2 та низький рівень її аутофосфорилювання. При лімфомі Ходжкіна високий рівень експресії та аутофосфорилювання PKD2 виявлено переважно в цитоплазмі та ядрі клітин Ходжкіна та Березовського-Штернберга.

5. Виділено три групи хворих на дифузну крупноклітинну В-клітинну лімфому, злоякісні клітини яких мають різний рівень диференціювання і відрізняються за внутрішньоклітинною локалізацією, рівнем експресії і аутофосфорилюванням PKD2 і експресією відомого прогностичного маркера цього гістологічного варіанта лімфом - PKC?II.

6. Встановлено, що надекспресія PKC?II в злоякісно трансформованих В-клітинах призводить до підвищення рівня активації PKD2 і фосфорилювання HDAC.

7. Зясовано, що надекспресія PKD2 підвищує рівень антиген-індукованої активації NF-?B. Показано синергізм дії PKD2 з CARMA1 в активації NF-?B, що повністю залежить від кіназної активності PKD2.

1. Immunohistochemical studies of protein kinase D (PKD) 2 expression in human lymphomas / L.M.Kovalevska, O.V. Yurchenko, L.M. Shlapatska, G.G. Berdova, S.V. Mikhalap, J. Van Lint, S.P. Sidorenko // Experimental Oncology. - 2006. - V. 25, № 3. - P. 186-190. (Особистий внесок дисертанта: імуногістохімічні та біохімічні дослідження, участь в аналізі результатів та написанні статті).

2. Експресія та аутофосфорилювання протеїнкінази D2 в дифузних В-крупноклітинних лімфомах / Л.М. Ковалевська, О.В. Юрченко, С.В. Міхалап, Л.М. Шлапацька, Г.Г. Бердова, Е.М. Алексик, С.П. Сидоренко // Онкологія.- 2008. - T. 10, № 2. - C. 221-224. (Особистий внесок: імуногістохімічні дослідження, участь в аналізі результатів та написанні статті).

3. Протеїнкіназа D2 (PKD2) бере участь в TCR-опосередкованому сигнальному каскаді активації ядерного фактору транскрипції NF-?B / Л.М. Ковалевська, С.В. Міхалап, Л.М. Шлапацька, Г.Г. Бердова, Д.Дж. Ролінгс, М.Морено-Гарсія, С.П. Сидоренко // Укр. журнал гематології та трансфузіології. - 2008 - Т. 8, № 4, -C. 15-19. (Особистий внесок: люциферазний аналіз активності NF-?B, участь в аналізі результатів та написанні статті).

4. Міхалап С.В. Кінази родини PKD у регуляції посттрансляційних модифікацій білків / С.В. Міхалап, Л.М. Ковалевська, С.П. Сидоренко // Укр. Біохім. Журнал. - 2008, Т. 80. № 4, C. 13-20. (Особистий внесок: автор здійснив пошук наукової літератури за темою огляду).

5. Evaluation of activated serine/theonine kinase PKD in normal and malignant lymphocytes in situ / L.М. Kovalevska, O.V. Yurchenko, G.G. Berdova, S.V. Mikhalap // The FEBS Journal. -2003. -V. 270, № 1. - P. 189.

6. The level of PKD expression and phosphorylation in lymphocytes / L.М. Kovalevska, O.V. Yurchenko, G.G. Berdova, S.V. Mikhalap, J. Van Lint., S.P. Sidorenko // Abstract book Conference for young scientists of molecular biology and genetics.- Kyiv, Ukraine, 2003. -P.160.

7. The role protein kinases D in B cell signaling / S.V. Mikhalap, L.M. Kovalevska, O.V. Yurchenko, J.R.Vandenheede, J. Van Lint, T. Seufferlein, S.P. Sidorenko // Український біохімічний журнал. - 2005. - T. 77, № 2. - C. 27.

8. Експресія і активність PKD2 при неходжкінських злоякісних лімфомах / С.В. Міхалап, Л.М. Ковалевська, О.В. Юрченко, Г.Г. Бердова, С.П. Сидоренко // Гематологія і трансфузіологія: фундаментальні та прикладні питання. -2005, - T. 5, № 4. -Р.53-54.

9. Визначення рівня експресії та фосфорилювання протеїнкінази D2 in situ / Л.М. Ковалевська, С.В. Міхалап, О.В. Юрченко, Г.Г. Бердова, С.П. Сидоренко // Тези VII Міжнародної конференціі молодих онкологів „Сучасні проблеми експериментальної і клінічної онкології”. - Київ, 2006. - C. 42.

10. Протеїнкіназа D2 (PKD2) приймає участь в сигнальному каскаді активації ядерного фактора транскрипції NF-?B / Л.М. Ковалевська, Л.М. Шлапацька, С.В. Міхалап, М. Морено-Гарсія, К. Соммерс, Д.Дж. Ролінгс, С.П. Сидоренко // Збірник тез 2-го зїзду Українського товариства клітинної біології. Київ, 2007. -С.158.

11. The role of protein kinase D2 in BCR mediated signaling in normal and malignant B lymphocytes / S.P. Sidorenko, S.V. Mikhalap, L.M. Kovalevska, L.M. Shlapatska, G.G. Berdova, D.J. Rawlings // In: 14th symposium on signals and signal processing in the immune system. Balatonoszod, Hungary. - 2007. -Р. 56.

12. PKD2 expression and autophosphorylation in primary normal B lymphocytes and diffuse large B cell lymphomas / L. Kovalevska, S. Mikhalap, O. Yurchenko, G. Berdova, S. Sidorenko // Acta Biochimica Polonica. Poland. -2007. - V. 54, № 2. - Р. 20.

13. Експресія та функції протеїнкінази D2 в нормальних та злоякісно трансформованих В-лімфоцитах / Л.М. Ковалевська, С.В. Міхалап, О.В. Юрченко, Л.М. Шлапацька, Г.Г. Бердова, С.П. Сидоренко // Тези доповідей конференції „Актуальні проблеми біохімії та біотехнології - 2008”. - Київ, Україна. - 2008. - С. 20.

14. Kinases of PKD family as a potential object of translational research in oncology / S.P. Sidorenko, L.M. Kovalevska, M.Y. Shabelnik, G.G. Berdova, L.M. Shlapatska, S.V. Mikhalap // Abstracts of international conference “Tumor hypoxia and malignant progression”. Kiev, Ukraine. -2008. -P.20.