Експресія 6-фосфофрукто-2-кінази/фруктозо-2,6-бісфосфатази та ряду інших генів при дії метил-третбутилового ефіру на організм - Автореферат

Прийнято вважати, що ключову роль у регуляції гліколізу відіграє 6-фосфофрукто-2-кіназа/фруктозо-2,6-бісфосфатаза [(PFKFB); 6-фосфофрукто-2-кіназа (EC 2.7.1.105); фруктозо-2,6-бісфосфатаза (EC 3.1.3.46)], яка контролює рівень фруктозо-2,6-бісфосфату, алостеричного регулятора 6-фосфофрукто-1-кінази (Okar et al., 2001; Rider et al., 2004). Більшість процесів в організмі, в тому числі і метаболізм глюкози, мають циклічний характер і контролюються циркадіальними генами, експресія яких регулюється казеїнкіназою-1? (Rudic et al., 2004). Метил-третбутиловий ефір використовується для виробництва не етильованих бензинів і є одним із найнебезпечніших глобальних хімічних забруднювачів довкілля в звязку з його високою стабільністю, здатністю накопичуватися в ґрунті і підземних джерелах водопостачання та вираженим негативним впливом на здоровя людей. В звязку з цим, при вивченні впливу на організм хімічних забруднювачів довкілля надзвичайно актуальним напрямком біохімічних досліджень є аналіз експресії генів, що контролюють протікання основних метаболічних процесів, а саме генів PFKFB, циркадіальних генів, казеїнкінази-1? та SNARK, з метою виявлення чутливих генетичних маркерів дії на організм забруднювачів довкілля, зокрема метил-третбутилового ефіру. Для реалізації поставленої мети необхідно було вирішити наступні завдання: 1) Вивчити вплив метил-третбутилового ефіру на експресію МРНК PFKFB-2, PFKFB-3 та PFKFB-4 у різних органах щурів.Проаналізовано дані стосовно ізоформ PFKFB, їх властивостей, молекулярних механізмів регуляції експресії їх генів, а також про альтернативний сплайсинг PFKFB, циркадіальні гени, казеїнкіназу-1??та SNARK, про метил-третбутиловий ефір, систему стресу ендоплазматичного ретикулуму та його значення в механізмі дії токсичних речовин, а також за різних патологічних процесів. У даній роботі ми вивчили дію метил-третбутилового ефіру, глобального хімічного забруднювача довкілля, що має виражену негативну дію на організм, в тому числі і онкогенну, на експресію генів, що мають безпосереднє відношення до росту злоякісних пухлин: PFKFB та їх альтернативний сплайсинг, циркадіальних факторів, протеїнкінази SNARK і казеїнкінази-1?, а також VEGF у різних органах щурів з метою виявлення можливих молекулярно-генетичних маркерів дії на організм екологічно небезпечних хімічних сполук. Метил-третбутиловий ефір вводили щурам внутрішньошлунково у дозі 500 мг/кг щоденно в умовах холодового стресу (після введення метил-третбутилового ефіру щурів витримували шість годин при ЧОС) протягом 1 місяця або у кількості 0,5; 5; та 50 мг/кг маси тіла один раз на день, пять разів на тиждень протягом двох місяців. Вони узгоджуються з попередніми даними аналізу експресії МРНК PFKFB-4 методом полімеразної ланцюгової реакції у реальному часі: посилення експресії МРНК PFKFB-4 у печінці та зниження експресії даної МРНК у легенях щурів, що отримували метил-третбутиловий ефір, але у продуктах полімеразної ланцюгової реакції з печінки щурів, яким вводили протягом місяця дану хімічну сполуку, зявляється більша за розміром додаткова смужка. Для ідентифікації можливого додаткового варіанту МРНК PFKFB-4, що зявляється у печінці щурів за дії метил-третбутилового ефіру, ми клонували різні за розміром фрагменти комплементарних ДНК PFKFB-4 щура, в тому числі і фрагмент, що індукується метил-третбутиловим ефіром.В дисертації наведено теоретичне узагальнення і нове рішення наукової задачі, що виражається у виявленні зміненої експресії МРНК різних 6-фосфофрукто-2-кіназ/фруктозо-2,6-бісфосфатаз (PFKFB), циркадіальних генів Per2, BMAL1 і Clock, VEGF, казеїнкінази-1? та SNARK, а також змін в альтернативному сплайсингу в печінці, легенях та серці за тривалої дії різних доз метил-третбутилового ефіру. Встановлено, що метил-третбутиловий ефір (500 мг/кг протягом місяця) посилює експресію МРНК 6-фосфофрукто-2-кінази/фруктозо-2,6-бісфосфатази-4 у печінці та знижує в легенях щурів і порушує вирізання інтрону з пре-МРНК PFKFB-4 у печінці, в результаті чого зявляється новий альтернативний сплайс-варіант МРНК, який кодує ізоензим з видозміненим та вкороченим С-кінцем.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

В дисертації наведено теоретичне узагальнення і нове рішення наукової задачі, що виражається у виявленні зміненої експресії МРНК різних 6-фосфофрукто-2-кіназ/фруктозо-2,6-бісфосфатаз (PFKFB), циркадіальних генів Per2, BMAL1 і Clock, VEGF, казеїнкінази-1? та SNARK, а також змін в альтернативному сплайсингу в печінці, легенях та серці за тривалої дії різних доз метил-третбутилового ефіру. Наукове завдання вирішено шляхом експериментального вивчення експресії генів у різних органах щурів.

1. Встановлено, що метил-третбутиловий ефір (500 мг/кг протягом місяця) посилює експресію МРНК 6-фосфофрукто-2-кінази/фруктозо-2,6-бісфосфатази-4 у печінці та знижує в легенях щурів і порушує вирізання інтрону з пре-МРНК PFKFB-4 у печінці, в результаті чого зявляється новий альтернативний сплайс-варіант МРНК, який кодує ізоензим з видозміненим та вкороченим С-кінцем.

2. Показано, що експресія альтернативного сплайс-варіанту МРНК PFKFB-4, що має делецію 22 н.з. у каталітичній частині фруктозо-2,6-бісфосфатази, суттєво змінюється під впливом метил-третбутилового ефіру як у печінці, так і у легенях, але в протилежному до основного варіанту МРНК напрямку.

3. Встановлено, що під впливом метил-третбутилового ефіру у різних органах щурів тканино-специфічно порушується експресія МРНК PFKFB-3 та її альтернативний сплайсинг.

4. Доведено, що під впливом тривалої дії метил-третбутилового ефіру за умов холодового стресу посилюється експресія основної ізоформи МРНК PFKFB-2 у таких життєво важливих органах, як печінка та легені, а в легенях ще і додаткової ізоформи МРНК PFKFB-2.

5. Показано, що під впливом тривалої дії метил-третбутилового ефіру у легенях щурів порушується альтернативний сплайсинг МРНК PFKFB-2, в результаті чого утворюються альтернативні сплайс-варіанти, які не мають частини каталітичних доменів 6-фосфофрукто-2-кінази.

6. Встановлено, що під впливом тривалої дії різних доз метил-третбутилового ефіру значно порушується експресія МРНК казеїнкінази-1?, циркадіальних транскрипційних факторів Per2, BMAL1 і Clock та протеїнкінази SNARK у печінці, легенях та міокарді щурів.

1. Вплив екотоксиканта метил-третбутилового ефіру на експресію альтернативних сплайс-варіантів МРНК 6-фосфофрукто-2-кінази/фруктозо-2,6-бісфосфатази у щурів / А.В. Кундієва, Д.О. Мінченко, О.П. Яворовський, І.В. Завгородній, Ю.О. Паустовський, О.Г. Мінченко // Сучасні проблеми токсикології. - 2009. - № 1. - C. 37 - 43.

2. Expression of 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase-3 and VEGF MRNA in rat liver, lung and heart: effect of methyl tertbutyl ether / D.O. Minchenko, A.V. Kundieva, K. Tsuchihara, O.P. Yavorovsky, Y.O. Paustovsky, H. Esumi, O.H. Minchenko // Ukr. Biokhim. Zh. - 2009. - Vol. 81, N 4. - P. 59-68.

3. Effect of methyl tertial butyl ether on the expression of PFKFB-3 and VEGF MRNA in rat liver and lung / D.O. Minchenko, K. Tsuchihara, O.P. Yavorovsky, Y.O. Paustovsky, A.V. Kundieva, H. Esumi, O.H. Minchenko // Studia Biologica. - 2009. - Vol. 3, № 2. - P. 5 - 14.

4. Експресія PFKFB-2?та її альтернативних сплайс-варіантів у печінці та легенях щурів як показник впливу метил-третбутилового ефіру на організм / Д.О. Мінченко, А.В. Кундієва, О.П. Яворовський, Ю.О. Паустовський, І.В. Завгородній, Р.О. Бачинський, О.Г. Мінченко // Науковий вісник НМУ ім. О.О. Богомольця. - 2009. - № 4. - С. 42 - 49.

5. Структурна організація, експресія та регуляція експресії генів 6-фосфофрукто-2-кінази/фруктозо-2,6-бісфосфатази / Д.О. Мінченко, А.Ю. Бобарикіна, А.В. Кундієва, Н.М. Липова, І.В. Божко, О.О. Ратушна, О.Г. Мінченко // Біологічні студії/Studia Biologica. - 2009. - Т. 3, № 3. - С. 123 - 140.

6. Вплив метил-третбутилового ефіру на експресію МРНК протеїнкінази SNARK, казеїнкінази-1?, Clock, BMAL1 та Per2 у щурів / А.В. Кундієва, Д.О. Мінченко, О.П. Яворовський, О.Г. Мінченко // Вісник КНУ імені Тараса Шевченка, Біологія. - 2010. - Вип. 55. - С. 6 - 10.

7. Rattus norvegicus 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase 1 (Pfkfb1), MRNA isoform, complete cds, alternatively splice / D.O. Minchenko, O.H. Minchenko, M. Moenner, A. Bikfalvi, A.V. Kundieva, L.L. Karbovsky, O.O. Ratushna // GENBANK accession number GQ422136, 15-SEP-2009.

8. Rattus norvegicus 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase 2 variant 4 (Pfkfb2) MRNA, complete cds, alternatively splice / D.O. Minchenko, O.H. Minchenko, M. Moenner, A. Bikfalvi, J. Caro, A.V. Kundieva, I.V. Bozhko, O.O. Ratushna, L.L. Karbovsky // GENBANK accession number GQ422137, 15-SEP-2009.

9. Rattus norvegicus 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase 2 variant 5 (Pfkfb2) MRNA, complete cds, alternatively spliced / D.O. Minchenko, O.H. Minchenko, M. Moenner, J. Caro, H. Esumi, I.V. Bozhko, A.V. Kundieva, O.P. Yavorovsky, R. Marunych, O.V. Hubenya // GENBANK accession number GQ422138, 15-SEP-2009.

10. Effect of methyl tertial butyl ether on the expression of rat 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase-4 MRNA and its unique alternative splice variants / A. Kundieva, D. Minchenko, Y. Paustovsky, I. Zavgorodny, R. Bachynsky, O. Yavorovsky, O. Minchenko // The VII Parnas Conference on Biochemistry and Molecular Biology, Yalta, 2009. Ukr. Biokhim. Zh. - 2009.

11. Expression of 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase-3 and VEGF MRNA in the liver, lung and heart of methyl tertbutyl ether-treated rats / A. Kundieva, D. Minchenko, O. Yavorovsky, Y. Paustovsky, O. Minchenko //The VII Parnas Conference on Biochemistry and Molecular Biology, Yalta, 2009. Ukr. Biokhim. Zh. - 2009. - 81, N 4 (special issue). - P. 164.

12. Вплив метил-третбутилового ефіру на експресію МРНК протеїнкінази SNARK, казеїнкінази-1?, Clock, bmal1 та per2 у щурів / А.В. Кундієва, Д.О. Мінченко, O.П. Яворовський, О.Г. Мінченко // Матеріали VIII міжнародної міждисциплінарної науково-практичної конференції молодих вчених. Київ, 2010. Шевченківська весна, Київ. - 2010. - С. 40 - 41.