Ефективність використання різних білкових добавок при одержанні in vitro ембріонів великої рогатої худоби - Автореферат

Хоча загальний розвиток методу відбувається шляхом спрощення та стандартизування середовищ культивування, створення хімічно визначених середовищ, практично усі середовища не здатні забезпечувати повноцінний розвиток зародків без додавання сироваток або їх складових (Lorengan P et al., 1994; Сметаніна И.Г., 1998; Gliedt D.W. et al., 1996; Лобачьова І.В., 1997; Van Langendonckt При виконанні роботи використовували біотехнологічні (дозрівання ооцитів, їх запліднення та наступний розвиток утворених ембріонів in vitro), морфологічні (оцінка ооцитів, яйцеклітин та ембріонів за морфофізіологічними показниками), цитогенетичний (дослідження мейозу), радіоімунологічний (дослідження гормонального фону сироваток), електрофоретичний (дослідження концентрації загального сироваткового білка і його фракцій) методи. На підставі проведених досліджень і теоретичних узагальнень, що сформульовані у дисертаційній роботі, удосконалено метод отримання пізніх морул із дозрілих та запліднених in vitro ооцитів великої рогатої худоби шляхом введення до середовищ культивування сироватки крові суперовульованих корів, одержаної у різні фази статевого циклу. Основні положення дисертації були представлені та обговорені на науково-практичній конференції “Теоретичні і практичні аспекти породоутворювального процесу у молочному та мясному скотарстві” (Київ, 1995); першій міжнародній науково-практичній конференції молодих вчених і спеціалістів “Селекційно-біотехнологічні методи використання генетичного потенціалу сільськогосподарських тварин” (Київ, 1994); міжнародній науково-практичній конференції, присвяченій 80-річчю з дня народження члена-кореспондента ВАСГНІЛ Ф.Ф.Ейснера “Теория и практика племенного дела в животноводстве” (Харків, 1996); другій міждержавній науково-практичній конференції “Селекционно-генетические и биотехнологические проблемы разведения крупного рогатого скота” (Брест, 1995); науково-практичній конференції “Неінфекційна патологія тварин” (Біла Церква, 1995); другій міжнародній конференції “Актуальные проблемы биологии в животноводстве” (Боровск, 1995);другій міжнародній конференції “Використання сучасних молекулярно-генетичних і біотехнологічних розробок у генетико-селекційних дослідженнях” (Київ, 1998); на II та III Міжнародних конференціях “Використання сучасних молекулярно-генетичних і біотехнологічних розробок у генетико-селекційних дослідженнях” (Одеса, 1998, 1999) Нами досліджено інтраядерне дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів корів при культивуванні у середовищі, доповненому фетальною телячою сироваткою (ФСТ) фірми “Serva”, а також виготовленими самостійно естральною сироваткою крові корів з індукованою поліовуляцією (ЕССК), естральною сироваткою крові корів із спонтанною охотою (ЕСК) та сироваткою новонародженого теляти (СНТ), (табл.1).Використання у системі одержання поза організмом ембріонів великої рогатої худоби сироватки корів-донорів з індукованою множинною овуляцією забезпечує найбільш адекватні умови дозрівання ооцитів і розвитку доімплантаційних ембріонів порівняно з іншими типами сироваток. Здатність до мейотичного дозрівання ооцитів корів позитивно корелює (r=0,83, p<0,05) із рівнем ендогенного естрадіолу та концентрацією b-глобулінів (r=0,78; p<0,05) у сироватці, яку було використано при культивуванні поза організмом. Використання сироватки крові корів з індукованою поліовуляцією забезпечує більш високий рівень виходу повноцінних ембріонів (морул) порівняно з сироваткою корів із спонтанною охотою і фетальною сироваткою теляти. Концентрація екзогенного естрадіолу (1 мкг/мл), що традиційно використовується при дозріванні ооцитів корів поза організмом, негативно впливає на ядерне дозрівання, підвищуючи частку ооцитів з дегенеративними змінами хромосом. Комбіноване використання у середовищі дозрівання ооцитів сироватки суперовульованих корів, одержаної у фолікулярну фазу статевого циклу, а у складі середовища розвитку ембріонів сироватки, яку одержано у лютеальну фазу, підвищує вихід ембріонів, які досягли доімплантаційних стадій in vitro.

Використання у системі одержання поза організмом ембріонів великої рогатої худоби сироватки корів-донорів з індукованою множинною овуляцією забезпечує найбільш адекватні умови дозрівання ооцитів і розвитку доімплантаційних ембріонів порівняно з іншими типами сироваток.

Встановлено індивідуальні відміни за рівнем мейотичного дозрівання ооцитів корів при використанні естральної сироватки різних суперовульованих корів-донорів.

Здатність до мейотичного дозрівання ооцитів корів позитивно корелює (r=0,83, p<0,05) із рівнем ендогенного естрадіолу та концентрацією b-глобулінів (r=0,78; p<0,05) у сироватці, яку було використано при культивуванні поза організмом.

Встановлено високу кореляційну залежність між мейозстимулюючою дією естральної сироватки суперовульованих корів у культурі in vitro та виходом повноцінних ембріонів, одержаних від цих донорів in vivo.

Використання сироватки крові корів з індукованою поліовуляцією забезпечує більш високий рівень виходу повноцінних ембріонів (морул) порівняно з сироваткою корів із спонтанною охотою і фетальною сироваткою теляти.

Концентрація екзогенного естрадіолу (1 мкг/мл), що традиційно використовується при дозріванні ооцитів корів поза організмом, негативно впливає на ядерне дозрівання, підвищуючи частку ооцитів з дегенеративними змінами хромосом. Зниження дози естрадіолу до 50 нг/мл забезпечує повноцінне ядерне і цитоплазматичне дозрівання ооцитів корів in vitro.

Комбіноване використання у середовищі дозрівання ооцитів сироватки суперовульованих корів, одержаної у фолікулярну фазу статевого циклу, а у складі середовища розвитку ембріонів сироватки, яку одержано у лютеальну фазу, підвищує вихід ембріонів, які досягли доімплантаційних стадій in vitro.

Інсуліноподібний фактор росту-II позитивно впливає на інтра- та екстраядерне дозрівання ооцитів корів при додаванні до середовища дозрівання і не впливає на розвиток отриманих ембріонів.

Доповнення середовища розвитку ембріонів корів епідермальним фактором росту у дозозалежній манері позитивно впливає на ранній ембріорозвиток.

Оптимальним строком введення білкової добавки до середовища культивування ембріонів, отриманих поза організмом, є період, коли ембріони досягають стадії 8-16-ти клітин.

Практичні пропозиції

Для розвитку поза організмом ооцит-кумулюсних комплексів великої рогатої худоби доцільно застосовувати базове комплексне середовище 199, яке доповнюють 20% естральної сироватки крові корів з індукованою поліовуляцією, яку одержують через 24 години після введення простагландину, та 50-ма нг/мл IGF-II й 50-ма нг/мл естрадіолу-17b.

На етапі культивування ембріонів пропонуємо використовувати просте хімічно визначене середовище CR1аа без ко-культури, яке через 90 годин після осіменіння ооцитів доповнюють сироваткою крові корів з індукованою поліовуляцією, одержаною у лютеальну фазу естрального циклу.

Сироватку одержувати від корів-донорів з високими результатами ембріопродукції.

Жернокльов Г.В. Використання різних сироваток для культивування ооцитів корів // Тваринництво України.- 1997.- №4.- С.21.

Жернокльов Г.В. Вплив білкових добавок на розвиток ембріонів // Тваринництво України.- 1998.- №2.- С.10.

Жернокльов Г.В. Одержання ембріонів з дозрілих in vitro у середовищі з різними сироватками ооцитів великої рогатої худоби//Научно-технический бюллетень Института животноводства УААН.- Харьков.- 1998.- №73.- С.20-24.

Жернокльов Г.В. Вплив естрадіолу-17b факторів росту на ядерне і цитоплазматичне дозрівання ооцитів великої рогатої худоби поза організмом // Науково-технічний бюлетень Інституту тваринництва УААН.- Харків.- 1998.- №75.- С.124-130.

Міненко Г.В., Пивовар А.К. Гормональний фон естральної сироватки крові корів після суперовуляції // Матеріали 1-ї Міжнар. наук. конф. молодих вчених та спец-тів. “Селекційно-біотехнологічні методи використання генетичного потенціалу сільськогосподарських тварин”. - Київ.-1994.- С.57.

Миненко Г.В., Бугров А.Д. Созревание ооцитов коров в среде с эстральной сывороткой крови суперовулированных доноров // Матер. Междун. научно-практ. конф., посвященной 90-летию со дня рождения д.б.н., проф. Лукина Е.И., “Зоологическая наука и современные проблемы зоотехнии и ветеринарной медицины”.- Харьков.- 1994. - С.46.

Миненко Г.В., Бугров А.Д., Кутиков Е.С. Белки эстральной сыворотки крови коров в системе культивирования ооцитов вне организма // Материалы Междунар. научно-практич. конференции, посвященной 140-летию со дня рождения профессора Кулешова П.Н.- Харьков.- 1995.- С.73.

Миненко Г.В. Вплив білкових добавок на дозрівання ооцитів, запліднення яйцеклітин та розвиток ембріонів великої рогатої худоби in vitro // Матеріали науково-виробничої конференції.- Київ, Асоціація “Україна”.- 1996.- С.340.

Аннотація

Жернокльов Г.В. Ефективність використання різних білкових добавок при одержанні in vitro ембріонів великої рогатої худоби.- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.20 - біотехнологія.- Інститут тваринництва УААН, Харків, 2001.

Досліджено ефективність використання різних сироваток на етапах дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів in vitro і культивування одержаних після запліднення ембріонів великої рогатої худоби. Визначено перевагу використання у системі in vitro естральної сироватки крові корів з індукованою поліовуляцією, одержану від донорів з високим виходом ембріонів. Встановлено наявність взаємозвязку рівня мейотичного дозрівання ооцитів і концентрації ендогенного естрадіолу та b-глобулінової фракції білка у сироватках, якими доповнено культуральне середовище. Вивчено вплив на дозрівання ооцитів і розвиток ембріонів корів in vitro екзогенних гормонів і факторів росту. Показано позитивний вплив комбінованого використання при дозріванні ооцитів і культивуванні ембріонів сироваток крові, одержаних у різні фази естрального циклу корів. Досліджено здатність до розвитку ембріонів, одержаних in vitro, у середовищі без ко-культури.

Ключові слова: ооцит, ембріон, сироватка, велика рогата худоба, культивування in vitro.