Ефекти, обумовлені введенням у клітини ссавців трансгена аполіпопротеїну а-1 людини - Автореферат

У роботах (Oka et al., 2007; Lebherz et al., 2007) авторами з використанням рекомбінантних аденовірусних векторів (РАД) та векторів на основі адено-асоційованого вірусу (РААВ) показано можливість забезпечення високого рівня синтезу АРОА1 людини у піддослідних мишей, який утримувався після одноразового введення вектора майже два роки. З іншого боку, спроби доставки цільової ДНК з геном АРОА1 людини в організм мишей з використанням таких носіїв, як галактолізований полі-L-лізин (Диже и соавт., 2001; Перевозчиков и соавт., 1997), забезпечили низький рівень експресії трансгена, хоча було показано ефективність повторних інєкцій препаратів. Введенням гідродинамічною інєкцією плазмідної ДНК вдалось досягнути у десятки разів вищого рівня експресії АРОА1 людини у піддослідних тварин (Акифьев и соавт., 2004) порівняно з зазначеними раніше носіями. Мета та завдання дослідження: Метою даної роботи є дослідження експресії клітинами СНО-К1 гена АРОА1 людини, який знаходиться у складі рекомбінантних плазмід під регуляцією різних сильних промоторів, вивчення експресії, тривалості знаходження та локалізації трансгена АРОА1 людини в організмі піддослідних тварин. Створити рекомбінантні плазміди, які містять ген АРОА1 людини під контролем енхансеру/промотору середньораннього гена цитомегаловірусу людини з інтроном А цього ж гена (HCMV-IA) та енхансеру середньораннього гена цитомегаловірусу людини, промотору та першого інтрону гена ?-актину курчати (CAG), для експресії в клітинах ссавців in vitro та in vivo.Для конструювання векторів експресії використовували плазміди PTRHCMV-IEAPO (Топорова і співав., 2004), PBACMAM-1 «Novagen» (США), PTR-GT60 (Кордюм і співав., 2003), PTRUFNEOR-та PTRUF, які були люб`язно надані С. Для вивчення рівня експресії гена АРОА1 людини стабільно трансфікованими клітинами СНО-К1, до складу плазмід PTRHCMV-IEAPO, PTRCAGAPO та PTRHCMV-IAAPO було клоновано ген неоміцинфосфотрансферази (NEOR), який дозволяє відбирати клітини на селективному середовищі з антибіотиком G418 та отримано плазміди PTRHCMV-IEAPO NEOR, PTRCAGAPO NEOR, PTRHCMV-IAAPO NEOR. Нами було досліджено експресію АРОА1 людини під контролем різних елементів регуляції транскрипції транзиторно та стабільно трансфікованими клітинами СНО-К1. Дослідження рівня транзиторної експресії трансгена трансфікованими клітинами СНО-К1 проводили після трансфекції клітин препаратами ДНК/ПЕІ з рекомбінантними плазмідами: PTRHCMV-IEAPO, PTRCAGAPO та PTRHCMV-IAAPO, що містять у своєму складі ген АРОА1 людини. Встановлено, що рівень синтезу АРОА1 клітинами, трансфікованими плазмідою PTRHCMV-IAAPO, складає ~ 3 нг білка/мл середовища за добу, в той час, як при трансфекції клітин плазмідою PTRHCMV-IEAPO - ~ 0,4 нг/мл.У результаті виконання дисертаційної роботи досліджено експресію трансгена АРОА1 людини, розміщеного у векторах експресії під регуляцією різних промоторів, у клітинах ссавців in vitro; вивчено тривалість збереження, локалізацію та експресію трансгена in vivo, що був введений інєкцією у паренхіму печінки тварин у складі комплексу плазміди PTRHCMV-IEAPO з ПЕІ. Вперше сконструйовано серію рекомбінантних плазмід, які містять повнорозмірний варіант гена АРОА1 людини під транскрипційним контролем промоторів HCMV-IA та CAG: PTRHCMV-IAAPO, PTRCAGAPO, які, здатні забезпечити високий рівень експресії трансгена в клітинах ссавців. У транзиторній системі експресії для трансфікованих плазмідами PTRHCMV-IEAPO та PTRHCMV-IAAPO клітин СНО-К1 показано синтез АРОА1 людини на рівні ~ 0,4 нг/мл і ~ 3 нг білка/мл середовища, відповідно. На культурах стабільних трансформантів СНО-К1 підтверджено, що гібридні промотори HCMV-IA та CAG забезпечують вищий рівень експресії АРОА1 людини порівняно з промотором HCMV-ІЕ. Продемонстровано, що трансген, введений в організм піддослідних тварин інєкцією у паренхіму печінки у складі комплексів плазміди з розгалуженим поліетиленіміном, може потрапляти крім печінки до тканин інших органів, зокрема: легенів, серця, нирок, лімфовузлів та клітин стінки аорти.

. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

У результаті виконання дисертаційної роботи досліджено експресію трансгена АРОА1 людини, розміщеного у векторах експресії під регуляцією різних промоторів, у клітинах ссавців in vitro; вивчено тривалість збереження, локалізацію та експресію трансгена in vivo, що був введений інєкцією у паренхіму печінки тварин у складі комплексу плазміди PTRHCMV-IEAPO з ПЕІ.

1. Вперше сконструйовано серію рекомбінантних плазмід, які містять повнорозмірний варіант гена АРОА1 людини під транскрипційним контролем промоторів HCMV-IA та CAG: PTRHCMV-IAAPO, PTRCAGAPO, які, здатні забезпечити високий рівень експресії трансгена в клітинах ссавців.

2. У транзиторній системі експресії для трансфікованих плазмідами PTRHCMV-IEAPO та PTRHCMV-IAAPO клітин СНО-К1 показано синтез АРОА1 людини на рівні ~ 0,4 нг/мл і ~ 3 нг білка/мл середовища, відповідно.

3. На культурах стабільних трансформантів СНО-К1 підтверджено, що гібридні промотори HCMV-IA та CAG забезпечують вищий рівень експресії АРОА1 людини порівняно з промотором HCMV-ІЕ.

4. Експериментально показано можливість підвищення рівня експресії трансгенів, які є повнорозмірними геномними варіантами, введенням до складу елементів регуляції транскрипції послідовності інтрону.

5. Продемонстровано, що трансген, введений в організм піддослідних тварин інєкцією у паренхіму печінки у складі комплексів плазміди з розгалуженим поліетиленіміном, може потрапляти крім печінки до тканин інших органів, зокрема: легенів, серця, нирок, лімфовузлів та клітин стінки аорти.

6. Встановлено збереження трансгена у клітинах печінки щурів та кролів щонайменше 25 діб та 85 діб у разі введення цільової ДНК інєкцією у паренхіму печінки у комплексі з поліетиленіміном.

7. На 6-ту добу після трансфекції плазмідою PTRHCMV-IEAPO показано накопичення АРОА1 людини на рівні 1,6-20 мкг/мл у плазмі крові кролів.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Гільчук Ю. М., Сухорада О. М., Рубан Т. А., Іродов Д. М., Топорова О. К., Кордюм В. А. Вивчення транзиторної експресії гена АРОА1 людини під регуляцією різних гібридних послідовностей в клітинах СНО-К1 // Біополімери і клітина. - 2006. - Т. 22, № 3. - С. 210-217. Особистий внесок здобувача - конструювання рекомбінантних плазмід; визначення рівня синтезу АРОА1 людини клітинами СНО-К1, трансфікованими препаратами ДНК/ПЕІ; ПЛР аналіз трансгена.

2. Гільчук Ю. М., Іродов Д. М., Старокадомський П. Л., Пішель І. М., Топорова О. К., Новікова С. М., Кордюм В. А. Розповсюдження по органам та експресія гена АРОА1 людини у складі введеної плазмідної ДНК in vivo // Біополімери і клітина. - 2006. - Т. 22, № 6. - С. 439 - 445. Особистий внесок здобувача - оптимізація умов проведення ПЛР аналізу гена АРОА1 людини в ДНК трансфікованих клітин кролів та свиней; виділення РНК із зразків печінки кролів; ПЛР аналіз ДНК тканин піддослідних тварин; тестування специфічності звязування моноклональних та поліклональних антитіл до АРОА1 людини у плазмі крові різних тварин методом Вестерн-блот аналізу; детекція АРОА1 людини в плазмі крові піддослідних кролів.

3. Гільчук Ю. М., Сухорада О. М., Рубан Т. А., Іродов Д. М., Топорова О. К., Кордюм В. А. Експресія гена аполіпопротеїна А-1 людини під контролем різних регуляторних послідовностей стабільними трансформантами СНО-К1 // Доповіді академії наук України. - 2007. - Т. 23, № 4. - С. 169-172. Особистий внесок здобувача - конструювання рекомбінантних плазмід; дослідження методами ELISA та Вестерн-блот аналізу культуральних середовищ клітин СНО-К1, трансфікованих препаратом ДНК/ПЕІ; проведення ПЛР аналізу ДНК тварин.

4. Гільчук Ю. М., Топорова О. К., Новікова С. М., Кордюм В. А. Вплив введення трансгена аполіпопротеїну А-1 людини на рівень холестерину та морфологію тканин у кролів, які утримувалися на холестериновій дієті // Біополімери і клітина. - 2008. - Т. 24, № 1. - С. 78-81.Особистий внесок здобувача - приготування препарату плазмідна ДНК/ПЕІ.

5. Kordyum V., Toporova O., Novikova S., Kozel Iu. (Gilchuk Iu.), Lihachova L., Morgunov P., Irodov D. In vivo gene transfer of human APOA1 genomic DNA results in markedly high transient expression in model animal // XXX Annual ESAO Congress, Abstract book. - Aachen (Germany), 2003. - P. 664. Особистий внесок здобувача - тестування специфічності звязування моноклональних та поліклональних антитіл до АРОА1 людини методом Вестерн-блот аналізу; визначення наявності АРОА1 людини в плазмі крові піддослідних кролів.

6. Kozel Iu. (Gilchuk Iu.), Suchorada H., Toporova O., Irodov D. Expression of human APOA1 gene in mammalian cells in vitro // Conference for students, PHD students and young scientists, Abstract book. - Kiyv (Ukraine), 2003. - P. 168. Особистий внесок здобувача - визначення методом ELISA рівня синтезу АРОА1 людини трансфікованими клітинами СНО-К1.

7. Kozel Iu. (Gilchuk Iu.), Morgunov P., Toporova O., Irodov D., Novikova S., Kordyum V. Testing of transgene delivery and biodistribution by PCR-analysis // First (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology, Abstract book. - Lviv (Ukraine), 2004. - P. 226. Особистий внесок здобувача - оптимізація умов ПЛР аналізу гена АРОА1 людини в ДНК трансфікованих клітин щурів; виділення ДНК із зразків тканин різних органів піддослідних тварин; ПЛР аналіз тотальної ДНК тканин різних органів піддослідних щурів.

8. Kozel Iu. (Gilchuk Iu.), Morgunov P., Toporova O., Irodov D., Novikova S. Testing of transgene delivery and biodistribution by PCR-analysis // XXXI Annual ESAO Congress ”Towards medicaltechnology of the future”, Int. J. Artif. Organs. - 2004. -Vol. 27, № 7. - Р. 591. Особистий внесок здобувача - виділення ДНК із зразків тканин різних органів піддослідних тварин; ПЛР аналіз ДНК тканин різних органів піддослідних щурів.

9. Гільчук Ю. М., Сухорада О. М., Рубан Т. А., Іродов Д. М., Топорова О. К. Вивчення експресії гена АРОА-1 людини під регуляцією різних гібридних послідовностей в СНО-К1 // Матеріали конференції-конкурсу робіт молодих учених, присвяченої 100-річчю від Дня народження В. О. Бєліцера „Актуальні проблеми біохімії та біотехнології - 2006”. - C. 7. Особистий внесок здобувача - конструювання рекомбінантних плазмід; тестування характеристик звязування моноклональних та поліклональних антитіл до АРОА1 людини методами ELISA та Вестерн-блот аналізу; дослідження культуральних середовищ клітин СНО-К1, трансфікованих препаратом ДНК/ПЕІ.

10. Novikova S., Toporova O., Gilchuk Iu., Kordyum V. Non-viral gene delivery of human APOA1 into mammalian cells in vitro and in vivo // XIV Annual Congress of the European Society of Gene Therapy, Abstract book. - Athens (Greece), 2006. - Р. 157. Особистий внесок здобувача - ПЛР аналіз ДНК трансфікованих клітин; виявлення АРОА1 людини в плазмі крові піддослідних кролів та культуральному середовищі трансфікованих клітин.

Размещено на .ru