Довгозбережне середовище для кріоконсервації сперми бугаїв та способи його виготовлення - Автореферат

Крім того, жовток будучи хорошим живильним середовищем для мікроорганізмів в ряді випадків є носієм патогенної і сапрофітної мікрофлори, яка негативно впливає на сперму, а також на відтворювальну функцію і стан здоровя самиць. Розробити спосіб хіміко-термічної стерилізації середовища з нативним жовтком. Як свідчать отримані результати компоненти курячого жовтка екстраговані органічними розчинниками (спирт, ефір) і введені в середовище для розбавлення сперми в концентрації 3% запобігають температурному шоку статевих клітин бугая, барана та кнура на одному рівні з 30%-ною концентрацією нативного жовтка, про що свідчать дані таблиці 1. З таблиці 1 видно, що рухливість сперміїв бугая в середовищі з нативним жовтком до шоку становила 7,1 балів, а після шоку 3,9 балів, різниця між показниками рухливості статевих клітин була високовірогідною (Р <0,001), при цьому коефіціент кріорезистентності (R) становив 0,55. Етапи обробки Рухливість сперміїв, бали R-коефіціент кріорезістентності сперми середовище з жовтком середовище з антишоковим компонентом середовище з жовтком середовище з антишоковим до шоку після шоку до шоку після шоку компонентомКомпоненти жовтка курячих яєць екстраговані органічними розчинниками і введені в сперму в концентрації 3% запобігають температурному шоку статевих клітин бугая, барана і кнура на одному рівні з 30%-ною концентрацією нативного жовтка. Встановлено, що попередня кріообробка нативного жовтка заморожуванням до-196°С призводить до деструкції жовткових кульок і виходу з них ліпопротеїнових сполук, що дало змогу розробити спосіб збільшення виходу антишокового компоненту при екстрагуванні з жовтка в 1,5 рази. Прогрівання розчинів антишокового компоненту при 100...110°С не впливає негативно на його термостійкі властивості і не порушує захисні якості відносно сперми, що дає змогу застосувати ефективні способи його стерилізації. № 745045), яке відрязняється тим, що з метою збереження високої санітарної і біологічної якості сперми, середовище містить замість жовтка термостабільний антишоковий компонент в такому співвідношенні інгрідієнтів: 11% розчин лактози 93,0, гліцерін мл 4,0, термостабільний антишоковий компонент 3.0. Розроблено спосіб виготовлення середовища з антишоковим компонентом, який відрізняється тим, що з метою довгозбереження і уникнення мікробного фактору, середовище герметизують в ампули і прогрівають при 100...110°С протягом 20 хвилин, потім зберігають в умовах кімнати до моменту використання.

1. Компоненти жовтка курячих яєць екстраговані органічними розчинниками і введені в сперму в концентрації 3% запобігають температурному шоку статевих клітин бугая, барана і кнура на одному рівні з 30%-ною концентрацією нативного жовтка.

2. Встановлено міцний звязок антишокового компоненту жовтка з цитоплазматичними мембранами сперміїв. Багаторазове центрифужне його відмивання від сперміїв ізотонічним вуглеводно-сольовим буфером не позбавляє резистентності статевих клітин до температурного шоку.

3. Встановлено, що попередня кріообробка нативного жовтка заморожуванням до -196°С призводить до деструкції жовткових кульок і виходу з них ліпопротеїнових сполук, що дало змогу розробити спосіб збільшення виходу антишокового компоненту при екстрагуванні з жовтка в 1,5 рази.

4. Прогрівання розчинів антишокового компоненту при 100...110°С не впливає негативно на його термостійкі властивості і не порушує захисні якості відносно сперми, що дає змогу застосувати ефективні способи його стерилізації.

5. Розроблено середовище для кріоконсервування сперми бугаїв (а.с. № 745045), яке відрязняється тим, що з метою збереження високої санітарної і біологічної якості сперми, середовище містить замість жовтка термостабільний антишоковий компонент в такому співвідношенні інгрідієнтів: 11% розчин лактози 93,0, гліцерін мл 4,0, термостабільний антишоковий компонент 3.0.

6. Розроблено спосіб виготовлення середовища з антишоковим компонентом, який відрізняється тим, що з метою довгозбереження і уникнення мікробного фактору, середовище герметизують в ампули і прогрівають при 100...110°С протягом 20 хвилин, потім зберігають в умовах кімнати до моменту використання.

7. Встановлено, що 33%-ний перекис водню, внесений в термолабільне середовище в концентрації 0,02% стимулює рухливість і виживаність сперміїв при 38°С, а токсична його дія наступає з 0,07%-ної концентрації, що дозволило вперше застосувати цей антисептик для санації термолабільних середовищ.

8. Застосування нетоксичної дози Н2О2 (перекису водню) в середовищі спільно з прогрівом його при 70°С на протязі 20 хвилин, забезпечило стерильність попередньо забрудненого мікроорганізмами середовища і не знизило його захисних якостей в процесі кріоконсервування сперміїв. Рухливість сперміїв після деконсервації складала 4,8 бала проти 4,0 балів в контролі, а по показнику абсолютної виживаності 23,9 проти 15,5 одиниць, відповідно.

9. Запропонований нами склад і спосіб виготовлення середовища, яке містить жовток (патент Росії № 1828582 і Патент України № 13138) забезпечує збереження початкових кріопротективних і санітарних якостей його протягом 36 місяців зберігання в умовах кімнати, що дозволило організувати виробництво і централізоване постачання кріопротективного середовища племінним підприємствам.

10. На основі використання прозорих довгозбережних середовищ розроблено асептичний спосіб і пристрій (а.с. № 1543598) для оцінки сперми перед осіменінням самиць, безпосередньо в герметизованій спермодозі, що забезпечує чітку видимість сперміїв під мікроскопом, більш точну оцінку їх рухливості.

11. Проведено науковий і широкий виробничий дослід впровадження довгозбереженого середовища на 14 підприємствах України і Росії, в якому виготовлено 1137 літрів середовища, заготовлено 15,3 млн.спермодоз і осіменено 3 млн.500 тис.корів і телиць. Заплідненість від першого осіменіння складає 61,8%. При цьому вилучається джерело поширення збудників хвороб, які можуть передаватись з жовтком при штучному осіменінні і скорочуються витрати дорогокоштовних компонентів і реактивів.

РЕКОМЕНДАЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

1. Для підвищення санітарно-гігієничного рівня роботи племінних підприємств і запобігання збудників захворювань, які розповсюджуються з жовтком і іншими компонентами, а також для раціонального використання всіх компонентів середовища для кріоконсервації сперми бугаїв пропонується фармзаводам, біофабрикам і племобєднанням два варіанти довгозбережних середовищ: - середовище, яке містить термостабільний антишоковий компонент замість нативного жовтка і його термічну стерилізацію при 110°С протягом 20 хвилин (а.с. СРСР № 745045);

- середовище, яке містить жовток і хіміко-термічний спосіб стерилізації, включаючий в середовище фармакопейний перекис водню (Н2О2) в концентрації 0,02...0,03% і прогрів його при 70°С протягом 20 хвилин (патент СРСР № 1828582, патент України № 13138).

2. З метою підвищення санітарно-гігієничного рівня та раціональної праці пунктів штучного осіменіння тварин пропонується неушкоджуючий асептичний спосіб та пристрій для оцінки рухливості сперміїв при мікроскопії в герметичних упаковках (а.с.СРСР № 1543598).

1. А.с. №745045. Среда для криоконсервации спермы / Ф.И. Осташко, М.П.Павленко, Л.Н.Павленко (СССР).- № 2623106/30-15; Заявлено 1.06.78; Зарег. в ГРИ СССР 7.03.80.гриф:”Не подлежит опубликованию в открытой печати”.

2. Ostashko F.I., Pavlenko M.P., Pavlenko L.N. Antishock effect of yolk and components in cooling spermatozoids of bull, ram and boar/10th International Congress on Animal Reproduction and A.I.- Illinois (USA).- 1984.- V.1.- P. 209-211.

3. Павленко Л.Н. Криоконсервация спермы быков в долгохранящейся термостабильной среде //Всесоюзная конференция криобиологии и криомедицины.- Харьков, 1984.- Т.2.- С. 245.

4. Павленко М.П., Павленко Л.Н. Изучение защитных свойств антишокового компонента желтка на сперме быков, баранов и хряков при криовоздействии //Всесоюзная конференция криобиологии и криомедицины.- Харьков, 1984.- Т.2.- С. 246.

5. А.с. 1543598 СССР. Устройство для микроскопии спермы и эмбрионов в эластичных капсулах /Ф.И.Осташко, М.П.Павленко, Л.Н.Павленко, Г.Н.Кузнецов.- № 44528131/30-15; Завлено 14.04.88; Зарег. в ГРИ СССР 15.10.89.

6. Осташко Ф.И., Павленко М.П., Павленко Л.Н. Долгохранящаяся среда для спермы и ее влияние на выживаемость и оплодотворяющую способность спермиев быков при криоконсервации //Научно-производственная конференция “Новые методы и биотехнология в животноводстве”.- К.: Госагропром УССР, 1991.- С.38-39.

7. Осташко Ф.И., Павленко М.П., Павленко Л.Н. Жидкие долгохранящиеся среды для криоконсервации спермы быков //Тезисы 11 международной конференции 21-25 апреля 1992 “Успехи в современной биологии” / Институт криобиологии и криомедицины АН Украины.- Харьков, 1992.- С.134-135.

8. Осташко Ф.І., Павленко М.П., Павленко Л.М. Методика визначення антишокових властивостей захисних компонентів в розбавлювачах при дії низьких температур на спермії // Нове в методах зоотехнічних досліджень Інститут тваринництва УААН.- Харків, 1992.- С.138-142.

9. Пат. 1828582 СССР. Среда для криоконсервации спермы и способ ее приготовления / Ф.И.Осташко, М.П.Павленко, Л.Н.Павленко (СССР).- № 4948632; Заявлено 8.04.91; Зарег. в ГРИ СССР 13.10.92. гриф. “Не подлежит опубликованию в открытой печати”.

10. Осташко Ф.І., Павленко М.П., Павленко Л.М. Рідкий довгозбережений розбавлювач для кріоконсервації сперми плідників // Основні наукові розробки інституту для впровадження у виробництво / Інститут тваринництва УААН.- Харків, 1992.- С.13-14.

11. Павленко М.П., Павленко Л.М. Довгозбережене середовище для кріоконсервації сперми бугаїв-плідників // Молочно-мясне скотарство: Міжв.темат.наук.збірник.- К.:Урожай, 1994.- Вип.85.- С.70-72.

12. Пат. 13138 Україна, МКИ А 61 D 19/02. Середовище для консервування сперми та спосіб його приготування / Ф.І.Осташко, М.П.Павленко, Л.М.Павленко (Україна).- Опубл. 28.02.97.- Бюл.№ 1.