Довгохвильові сквараїнові барвники, як флуоресцентні біоаналітичні реагенти - Автореферат

Один з найперспективніших шляхів подальшого поліпшення чутливості та достовірності флуоресцентного визначення біоаналітів полягає у проведенні вимірювань у довгохвильовій області спектру (600-900 нм), де біологічні речовини мають мінімум власного поглинання та випромінювання, що заважають спектральним дослідженням, а також заміна інтенсивності, як вимірюваної аналітичної характеристики (параметру флуоресценції), на поляризацію та час життя флуоресценції. Але ці барвники не застосовувалися раніше як реагенти для розробки флуоресцентних біоаналітичних методів, заснованих на вимірюваннях поляризації та часу життя флуоресценції. Дисертаційну роботу виконано в ДНУ "НТК "Інститут монокристалів" НАН України у відповідності до теми відомчого замовлення НАН України: "Синтез та дослідження довгохвильових барвників та люмінофорів" (2004-2006 р.р., №0104U008441); вона була частиною міжнародних проектів УНТЦ №U111 "Червоні та інфрачервоні флуоресцентні зонди та мітчики для медико-біологічних досліджень", №3804 "Засновані на часах гасіння флуоресценції мітчики і зонди для медико-біологічних аналізів та моніторингу бактеріального забруднення" та №P313 "Медико-біологічні зонди та мітчики". Для досягнення цієї мети необхідно було вирішити наступні основні завдання: вивчити спектральні і фотофізичні властивості та фотостабільність довгохвильових сквараїнових барвників у водних середовищах, а також при ковалентному та нековалентному звязуванні з біотином, олігонуклеотидами та модельними протеїнами - альбуміном (BSA) та імуноглобуліном (IGG); встановити закономірності щодо впливу молекулярної будови барвників на їх властивості у вільному та звязаному стані; зясувати можливість використання часів життя флуоресценції сквараїнових барвників для флуоресцентного імуноаналізу низькомолекулярних антигенів, визначення вмісту біотину його реакцією з авідином, а також для гібридизаційного аналізу олігонуклеотидів;Аналіз літератури показав, що час життя флуоресценції, як параметр вимірювання, є найбільш стійким у порівнянні з інтенсивністю та поляризацією до впливу багатьох перешкоджаючих факторів, таких як ефект внутрішнього фільтру, гасіння флуоресценції, автофлуоресценція, світлорозсіяння, фотознебарвлення та ін. Для зясування можливості застосування цих сквараїнів як біоаналітичних реагентів досліджено їх спектральні, фотофізичні та фотохімічні властивості у вільному стані, в нековалентних комплексах та ковалентних конюгатах з біоаналітами та вибрано ті сквараїни, що мають найбільший динамічний діапазон змін параметрів флуоресценції, насамперед, часу життя, а також найкращу фотостабільність. Одержано закономірності щодо звязку положення (lmakc.), інтенсивності (IFL), форми та напівширини (Dl) смуг поглинання та флуоресценції, а також квантового виходу (FF), поляризації (P), часу життя флуоресценції (t) та фотостабільності з будовою барвників, їх комплексів та конюгатів з біомолекулами. Таким чином, довгохвильові сквараїнові барвники мають певні переваги як біоаналітичні реагенти, бо дозволяють збільшити чутливість та достовірність вимірювання завдяки високої чутливості інтенсивності, поляризації та часу життя флуоресценції до мікрооточення, можливості використання часів життя флуоресценції як параметру детекції, можливості зменшити вплив джерела збудження на сигнал реєстрації та завдяки підвищеній фотостабільності. При розробці цього методу було встановлено, що порядок додавання реагентів впливає на результат аналізу, а саме: при одноразовому додаванні надлишку авідину до реагенту час життя флуоресценції (t) зростає в 2.7 рази та сягає 1.78 нс, а інтенсивність флуоресценції зростає в 1.4 рази; при титруванні реагенту авідином час життя зростає до 1.10 нс, а інтенсивність зменшується в 2.9 рази; при титруванні авідину реагентом час життя зменшується з 1.78 нс до 1.10 нс, а інтенсивність флуоресценції зростає.Розроблені флуоресцентні реагенти та методологічні підходи, засновані на вимірюванні їх часів життя флуоресценції, запропоновано для створення нових високочутливих та високодостовірних методів та методик флуоресцентного визначення низькомолекулярних та високомолекулярних біоаналітів. Запропоновано методологічний підхід до визначення низькомолекулярних та високомолекулярних біоаналітів, заснований на вимірюванні часів життя флуоресценції довгохвильових сквараїнових барвників, який на відміну від методів, що використовують флуоресцентний резонансний перенос енергії між двома барвниками (FRET), застосовує тільки один флуоресцентний реагент. (Здобувачем виконано синтез конюгатів барвників, спектральні та фотофізичні дослідження, обговорення результатів). (Здобувачем запропоновано підхід до проведення імуноаналізу низькомолекулярних антигенів, виконано синтез конюгатів барвників, спектральні дослідження, обговорення результатів,). (Здобувачем виконано синтез конюгатів барвників, спектральні дослідження, аналіз та обговорення результатів).

Основний зміст роботи

Вирішено наукову проблему щодо зясування можливості використання нових довгохвильових сквараїнових барвників як флуоресцентних біоаналітичних реагентів для збільшення чутливості та достовірності флуоресцентного визначення біоаналітів. Розроблені флуоресцентні реагенти та методологічні підходи, засновані на вимірюванні їх часів життя флуоресценції, запропоновано для створення нових високочутливих та високодостовірних методів та методик флуоресцентного визначення низькомолекулярних та високомолекулярних біоаналітів. Ці реагенти та методології можна застосовувати у клінічній діагностиці, медико-біологічних дослідженнях, в біології, аналітичній хімії, біохімії, при аналізі харчових продуктів, моніторингу біологічного та хімічного забруднення навколишнього середовища.

Довгохвильові сквараїнові барвники завдяки своєму спектральному діапазону, високій яскравості, фотостабільності та чутливості інтенсивності, поляризації та часу життя флуоресценції до мікрооточення є перспективними біоаналітичними реагентами для флуоресцентного визначення біоаналітів. Ці барвники дозволяють збільшити чутливість та достовірність біоаналітичних методик, особливо при використанні часів життя флуоресценції як параметру вимірювань.

Підвищення достовірності результатів визначення біоаналітів у присутності інших, заважаючих біомолекул, може бути досягнуто зниженням чутливості сквараїнових барвників до нековалентних взаємодій (комплексоутворення), зокрема, покращенням їх водорозчинності.

Для підвищення чутливості параметрів флуоресценції сквараїнових барвників до полярності мікрооточення та присутності макромолекул рекомендується збільшувати полярність їх молекул, зокрема, шляхом заміщення сквараїнового атому кисню іншим атомом або групою.

Запропоновано методологічний підхід до визначення низькомолекулярних та високомолекулярних біоаналітів, заснований на вимірюванні часів життя флуоресценції довгохвильових сквараїнових барвників, який на відміну від методів, що використовують флуоресцентний резонансний перенос енергії між двома барвниками (FRET), застосовує тільки один флуоресцентний реагент. Новий підхід дозволяє спростити та прискорити проведення аналізу.

Розроблено метод визначення вмісту біотину реакцією з авідином та імунофлуоресцентний аналіз, що засновані на вимірюванні часів життя флуоресценції довгохвильового сквараїнового барвника К8-1661.

Розроблено гібридизаційний метод визначення олігонуклеотидів, заснований на вимірюванні часу життя флуоресценції довгохвильового сквараїнового барвника К8-1340 у міцелярному або протеїновому середовищі.

Список публикацій автора за темою дисертації

Synthesis of water-soluble, ring-substituted squaraine dyes and their evaluation as fluorescent probes and labels / A. L. Tatarets, I. A. Fedyunyayeva, T. S. Dyubko, Ye. A. Povrozin, A. O. Doroshenko, E. A. Terpetschnig, L. D. Patsenker // Anal. Chim. Acta. - 2006. - V. 570, No. 2. - P. 214-223. (Здобувачем виконано синтез конюгатів барвників, спектральні та фотофізичні дослідження, обговорення результатів).

Fluorescent probes and labels for biomedical applications / L. Patsenker, A. Tatarets, O. Kolosova, O. Obukhova, Ye. Povrozin, I. Fedyunyayeva, I. Yermolenko, E. Terpetschnig // Ann. New York Acad. Sci. - 2008. - V. 1130. - P. 179-187. (Здобувачем виконано синтез конюгатів барвників, спектральні дослідження, аналіз отриманих даних).

Near-infrared, dual-ratiometric fluorescent label for measurement of PH / Ye. A. Povrozin, L. I. Markova, A. L. Tatarets, V. I. Sidorov, E. A. Terpetschnig, L. D. Patsenker // Anal. Biochem. - 2009. - V. 390. - P. 136-140. (Здобувачем виконано синтез конюгатів барвників, спектральні дослідження, обговорення результатів).

Seta-633 - A NIR Fluorescence Lifetime Label for Low-Molecular-Weight Analytes / Ye. A. Povrozin, O. S. Kolosova, O. M. Obukhova, A. L. Tatarets, V. I. Sidorov, E. A. Terpetschnig, L. D. Patsenker // Bioconjugate Chem. - 2009. - V. 20 - P. 1807-1812. (Здобувачем запропоновано підхід до проведення імуноаналізу низькомолекулярних антигенів, виконано синтез конюгатів барвників, спектральні дослідження, обговорення результатів,).

Пат. PCT/US2008/001274, МПК (2006.01) C12Q. Luminescent compounds / E. A. Terpetschnig, L. D. Patsenker, A. Tatarets, A. Klochko, Yu. Kudryavtseva, E. Povrozin - WO 2008/094637; заявл. 30.01.2008; опубл. 07.08.2008. (Здобувачем виконано синтез конюгатів барвників, спектральні дослідження, аналіз та обговорення результатів).

Пат. 12/512972 США, A61K 49/00, C07D 471/22, C07D 495/14. Luminescent Compounds / E. A. Terpetschnig, L. D. Patsenker, O. Klochko, Yu. Kudriavtseva, A. L. Tatarets, I. G. Yermolenko, Ye. A. Povrozin - US 2010/0266507 A1; заявл. 30.07.2009; опубл. 21.10.2010. (Здобувачем виконано синтез конюгатів барвників, спектральні дослідження, аналіз та обговорення результатів).

Новые флуоресцентные красители для исследования биомембран с помощью длинноволновых полупроводниковых лазеров / Е. А. Поврозин, А. Л. Татарец, Э. А. Терпечниг, Т. С. Дюбко, Л. Д. Паценкер // XXI Международная научно-практическая конференция "Применение лазеров в медицине и биологии", междунар. конф., 26-29 мая 2004 г.: тезисы докл. - Одесса, 2004. - C. 131.

Новые длинноволновые флуоресцентные зонды для исследования белков / А. Л. Татарец, Е. А. Поврозин, Т. С. Дюбко, Э. А. Терпечниг, Л. Д. Паценкер // XXI Международная научно-практическая конференция "Применение лазеров в медицине и биологии", междунар. конф., 26-29 мая 2004 г.: тезисы докл. - Одесса, 2004. - C. 134.

New squarylium labels for biomedical assays / L. D. Patsenker, O. S. Kolosova, A. L. Tatarets, Ye. A. Povrozin, Ye. N. Obukhova, I. G. Yermolenko, E. A. Terpetschnig // Methods and Applications of Fluorescence MAF9: 9 Intern. Conf., 4-7 September 2005: book of abstr. - Lisbon, Portugal, 2005. - P. 203.

Advanced fluorescent materials for biomedical applications / L. Patsenker, E. Terpetschnig, B. Krasovitskii, O. Kolosova, I. Fedyunyayeva, A. Tatarets, Ye. Povrozin, I. Yermolenko // Modern physical chemistry for advanced materials: intern. conf., 26-30 June 2007: book of abstr. - Kharkiv, 2007. - P. 105-106.

Photo-induced hydrolysis of thiosquarylium dyes / A. Tatarets, O. Kolosova, Ye. Povrozin, Ye. Obukhova, I. Fedyunyayeva, E. Terpetschnig, L. Patsenker // Modern physical chemistry for advanced materials: intern. conf., 26-30 June 2007: book of abstr. - Kharkiv, 2007. - P. 350-351.

New fluorescent probes and labels for biomedical applications / O. Kolosova, L. Patsenker, E. Terpetschnig, I. Fedyunyayeva, A. Tatarets, Ye. Povrozin, I. Yermolenko, Yu. Kudryavtseva // Photonics North: intern. conf., 4-6 June 2007: book of abstr. - Ottawa, Canada, 2007. - P. 68.

Thiosquarylium Dyes as High-Photostable Biomedical Markers / A. Tatarets, O. Kolosova, Ye. Povrozin, E. Obukhova, I. Fedyunyayeva, E. Terpetschnig, L. Patsenker // Photonics North: intern. conf., 4-6 June 2007: book of abstr. - Ottawa, Canada, 2007. - P. 83.

Thiosquarylium Dyes as Highly-Photostable Biomedical Markers / Ye. Obukhova, A. Tatarets, O. Kolosova, Ye. Povrozin, I. Fedyunyayeva, E. Terpetschnig, L. Patsenker. // Methods and Applications of Fluorescence MAF10: 10 Intern. Conf., 9-12 September 2007: book of abstr. - Salzburg, Austria, 2007. - P. 121.

Water-soluble, PH-sensitive Fluorescent Labels Based on Squaraine Dyes / O. Kolosova, A. Tatarets, Ye. Obukhova, Ye. Povrozin, V. Sidorov, L. Markova, E. Terpetschnig, L. Patsenker // Methods and Applications of Fluorescence MAF10: 10 Intern. Conf., 9-12 September 2007: book of abstr. - Salzburg, Austria, 2007. - P. 123.

Fluorescent Probes and Labels for Biomedical Applications / L. Patsenker, O. Kolosova, A. Tatarets, I. Fedyunyayeva, Ye. Povrozin, I. Yermolenko, Yu. Kudryavtseva, E. Terpetschnig // Methods and Applications of Fluorescence MAF10: 10 Intern. Conf., 9-12 September 2007: book of abstr. - Salzburg, Austria, 2007. - P. 154.

Dicyanomethylene squarylium dyes as fluorescent probes for serum albumins / A. Tatarets, Ye. Povrozin, O. Obukhova, I. Fedyunyayeva, L. Patsenker, E. Terpetschnig // Supramolecular and NANOCHEMISTRY: Toward Applications: International Symposium, 25-29 August 2008: book of abstr. - Kharkov, 2008. - P. 2-9.

Маркова Л. И. Скварилиевые красители на основе 2,3-диметил-3-(4-сульфобутил)-3H-5-индолсульфоновой кислоты / Л. И. Маркова, Е. А. Поврозин, О. С. Колосова // 6 Всеукраїнська конференція молодих вчених та студентів з актуальних питань хімії: всеукр. конф., 3-6 червня 2008 р.: тези доп. - Харків, 2008. - С. 67.

Длинноволновые метчики с повышенной водорастворимостью на основе полиметиновых красителей / Л. И. Маркова, Е. А. Поврозин, И. А. Федюняева, О. А. Соколик, Л. Д. Паценкер // Сучасне матеріалознавство. Матеріали та технології: Всеукраїнська конференція молодих вчених, 12-14 листопада 2008 р.: тези доп. - Київ, 2008. - С. 127.

Long-Wavelength Dye Seta-633 for Fluorescence Lifetime (FLT) Immunoassay / Ye. A. Povrozin, O. S. Kolosova, A. L. Tatarets, O. M. Obukhova, V. I. Sidorov, E. A. Terpetschnig, L. D. Patsenker // Supramolecular Systems in Chemistry and Biology: V International Symposium, 12-16 May 2009: book of abstr. - Kyiv, 2009. - P. 167.

Squarylium Dyes With Substituted Cyclobutenone Oxygen Atom: Synthesis, Properties, Application / A. L. Tatarets, I. A. Fedyunyayeva, O. M. Obukhova, Ye. A. Povrozin, S. U. Khabuseva, L. D. Patsenker // Kiev - Toulouse: V Scientific Joint Conference in Chemistry, 31 May - 4 June 2009: book of abstr. - Kyiv, 2009. - P. 22.

Advanced Fluorescent Probes and Labels for Biomedical Applications / L. Patsenker, A. Tatarets, O. Kolosova, L. Markova, O. Klochko, Ye. Povrozin, I. Fedyunyayeva, I. Yermolenko // Kiev - Toulouse: V Scientific Joint Conference in Chemistry, 31 May - 4 June 2009: book of abstr. - Kyiv, 2009. - P. 128.

Fluorescence Lifetime Based Hybridization Assay Using the New Long-Wavelength Fluorescent Label Seta-670 / L. D. Patsenker, Ye. A. Povrozin, V. I. Sidorov, A. L. Tatarets, E. A. Terpetschnig // ICP 2009: 24 International Conference on Photochemistry, 19-24 July 2009: book of abstr. - Toledo, Spain, 2009. - P. 430.

Fluorescence Lifetime Immunoassay Using the Long-Wavelength Label Seta-633 / Ye. A. Povrozin, O. S. Kolosova, O. M. Obukhova, A. L. Tatarets, V. I. Sidorov, E. A. Terpetschnig, L. D. Patsenker // Methods and Applications of Fluorescence MAF11: 11 Intern. Conf., 6-9 September 2009: book of abstr. - Budapest, Hungary, 2009. - P. 117.

New Long-wavelength Fluorescent Protein Labels with Advanced Characteristics / O. M. Obukhova, Ye. A. Povrozin, E. A. Terpetschnig, L. D. Patsenker // Methods and Applications of Fluorescence MAF11: 11 Intern. Conf., 6-9 September 2009: book of abstr. - Budapest, Hungary, 2009. - P. 155.

Novel Long-Wavelength Fluorescent dye Seta-633 for Fluorescence Lifetime Imaging of Antigen-Antibody Reactions / Ye. A. Povrozin, O. S. Kolosova, O. M. Obukhova, A. L. Tatarets, V. I. Sidorov, E. A. Terpetschnig, L. D. Patsenker // 2009 WMIC: World Molecular Imaging Congress, 23-26 September 2009: book of abstr. - Montreal, Canada, 2009. - P. 0787.

Synthesis and Spectral Properties of Dicyanomethylene Squaraine Dyes / A. L. Tatarets, O. M. Obukhova, Ye. A. Povrozin, L. D. Patsenker, E. A. Terpetschnig // Chemistry of Nitrogen Containing Heterocycles CNCH-2009: Intern. Conf., 05-09 October 2009: book of abstr. - Kharkiv, 2009. - P. 137.

Количественное определение компонентов комплекса авидин-биотин при помощи длинноволнового сквараинового красителя / Е. А. Поврозин, В. И. Сидоров, А. Л. Татарец, Е. Н. Обухова, Л. Д. Паценкер // ХХІІ Українська конференція з органічної хімії, 20-25 вересня 2010 р.: тези доп. - Ужгород, 2010. - С. 367.