Дослідження структурно-функціональної організації плазміди pSM1 і створення вектора для ціанобактерії - Автореферат

Невибагливість до умов культивування та здатність до синтезу біологічно активних речовин дозволяють створювати на їх основі перспективні технології виробництва ряду препаратів медико-біологічного напрямку (Patterson, 1996). Тому ціанобактерії можуть бути унікальними обєктами для фундаментальних досліджень в області оксигенного фотосинтезу та азотфіксації. Ці дослідження значною мірою гальмуються відсутністю ефективних векторних систем для клонування та експресії ціанобактеріальних генів. Ці конструкції несуть зручні маркерні гени стійкості до антибіотиків проте, лише невелика кількість таких векторів здатна деякий час реплікуватися в клітинах окремих штамів ціанобактерій та Escherichia coli. А також в рамках проекту науково-дослідної роботи за темою “Створення мобільного вектора на основі репліконів ціанобактеріальних і колійних плазмід з метою одержання технологічно важливих штамів ціанобактерій для розвитку фотобіотехнології”, яка була підтримана грантом НАН України для молодих вчених, договір № 43 від 16. 02. 2002 (керівник).У пяти підрозділах огляду літератури розглянуті сучасні уявлення про біологію ціанобактерій та їх придатність для створення системи вектор-господар.Обєктом досліджень була аксенічна культура ціанобактерії P.boryanum Gom, штам CALU 465 (Rippka et al., 1979). Плазмідну ДНК із клітин E.coli виділяли, використовуючи метод лужної екстракції (Плазмиды, 1990). Плазмідну ДНК з клітин P.boryanum виділяли методом лужної та фенольної екстракції (Grant et al., 1982), а також модифікованим методом висолювання 1М NACL, після попередньої деградації клітин розчином лізоциму та додецилсульфату натрію. При необхідності виділення плазмідної ДНК з трансконюгантів, ціанобактеріальну культуру попередньо перевіряли на контамінацію донорними клітинами E.coli, кількість яких не повинна була перевищувати 10х101 кл/мл. Додаткову очистку препаратів ДНК проводили шляхом ізопікнічного центрифугування в градієнті концентрації CSCL з додаванням бромистого етидію (Sambrook et al., 1993).За допомогою метода висолювання 1М NACL плазмідної ДНК після попередньої деградації клітин ціанобактерії розчином лізоциму та додецилсульфату натрію встановлено, що клітини P.boryanum містять три плазміди: велику - розміром біля 55 т.п.н., середню - 12 т.п.н. і малу - 1,5 т.п.н.. Ці конструкції виявились необхідними як для фізичного картування та визначення нуклеотидної послідовності ДНК плазміди, так і для конструювання шатл-вектора. Проте, як маркерні використовуються не ціанобактеріальні гени антибіотикостійкості, наявність яких ще не було доведено, а гени в складі стандартних плазмідних E.coli-векторів. Останній метод дозволяє мобілізувати вектор з клітин E.coli в клітини реципієнта за участю двох плазмід: конюгативної, наприклад, RP4 та хелперної - PGJ28. Інша причина, а саме нездатність цієї конструкції підтримуватися в клітинах P.boryanum, була відкинута, оскільки непрямий конюгативний перенос конструкції PSTS1 - похідної від PBSM1, дав позитивні результати.Ціанобактерія P.boryanum містить три ендогенні плазміди: велику розміром біля 55 т.п.н., середню - 12 т.п.н. та малу плазміду PSM1 - 1,5 т.п.н. Аналіз нуклеотидної послідовності плазміди дозволив визначити локалізацію, розмір та функції основних її структурно-функціональних елементів: гену rep, довжина якого складає 1008 п.н. та ori реплікації довжиною біля 500 п.н. Філогенетичний аналіз амінокислотної послідовності білка дозволив віднести його до надродини І, що було зроблено вперше для Rep-білків ціанобактеріальних плазмід. Плазміда PSM1 є природним міні-репліконом і відноситься до класу RCR-плазмід, що реплікуються за механізмом розмотування кільця.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

1. Ціанобактерія P.boryanum містить три ендогенні плазміди: велику розміром біля 55 т.п.н., середню - 12 т.п.н. та малу плазміду PSM1 - 1,5 т.п.н. Найбільш придатним методом для їх виділення є метод висолювання NACL після попередньої обробки клітин лізоцимом та додецилсульфатом натрія.

2. Створена фізична карта ціанобактеріальної плазміди PSM1, яка є повною схемою розміщення 15 сайтів рестрикції для 8 рестриктаз: CLAI, ALUI, Csp6I, Cfr13I, HPAII, PVUI, ACCI і TAQI. PSM1 містить 4 унікальні сайти і є найменшою серед природних плазмід, що робить її перспективною для створення шатл-вектора.

3. Аналіз нуклеотидної послідовності плазміди дозволив визначити локалізацію, розмір та функції основних її структурно-функціональних елементів: гену rep, довжина якого складає 1008 п.н. та ori реплікації довжиною біля 500 п.н.

4. Продуктом експресії гену rep є білок, асоційований з реплікацією плазміди. Філогенетичний аналіз амінокислотної послідовності білка дозволив віднести його до надродини І, що було зроблено вперше для Rep-білків ціанобактеріальних плазмід.

5. Плазміда PSM1 є природним міні-репліконом і відноситься до класу RCR-плазмід, що реплікуються за механізмом розмотування кільця.

6. Вперше на основі реплікону PSM1 і плазміди PBR322 створено чотири векторні конструкції, одна з яких, PSTS4, є повноцінним шатл-вектором для клонування і експресії практично важливих генів в ціанобактеріальній системі.

7. Векторна конструкція PSTS4 ефективно переноситься в клітини P.boryanum і E.coli шляхом непрямої конюгації і спричиняє стійкість ціанобактеріальних трансконюгантів до ампіциліну в 400 разів і тетрацикліну в 50 разів. Визначено оптимальні умови метода переносу вектора до клітин ціанобактерії та показана його невибагливість для використання.

8. Структурно-функціональна цілісність шатл-вектора PSTS4 в клітинах P.boryanum і E.coli підтримується протягом багатьох генерацій та послідовних переносів між клітинами господарями.

1. Менджул М.И., Сырчин С.А., Мошинский И.Д., Самойленко В.А., Цимбал Н.В. Выделение, очистка и клонирование плазмиды PSM1 из цианобактерии Plectonema boryanum // Микроб. журн. - 2000. - Т. 62, №2. - С. 38-44.

2. Сырчин С.А., Самойленко В.А., Цимбал Н.В., Менджул М.И. Физическое картирование плазмиды PSM1 из цианобактерии Plectonema boryanum Gom. штамм CALU // Микроб. журн. - 2001. - Т. 63, №4. - С. 76-84.

3. Самойленко В.А., Цимбал Н.В., Менджул М.И. Опредиление уровня естественной резистентности цианобактерии Plectonema boryanum. Gom. штамм CALU 465 // Бюл. Інст-ту сільськогосп. мікроб. - 2000. - №7. - С. 33-34.

4. Сырчин С.А., Самойленко В.А., Цимбал Н.В., Менджул М.И. Конструирование челночного вектора PSTS1 и отработка способа его введения в клетки цианобактерии Plectonema boryanum Gom. штамм CALU 465 // Микроб. журн. - 2001. - Т. 63, №5. - С. 49-58.

5. Самойленко В.А., Сирчін С.О., Цимбал Н.В., Менджул М.І. Вектори серії PSTS для ціанобактерії Plectonema boryanum Gom. штам CALU 465 // Вісник. Біологія. Київський національний університет імені Тараса Шевченка. - 2001. - Випуск 35. - С. 35-38.

6. Самойленко В.А., Цимбал Н.В., Сирчін С.О., Менджул М.І. Конструювання шатл-вектора для ціанобактерії Plectonema boryanum з метою вивчення структурно-функціональної організації ДНК ціанофагів // Тези міжнарод. конф. "Біоресурси та віруси" - Київ, Україна. - 2001. - С. 18.

7. Samoilenko V.A., Tsimbal N.V. Fisical mapping and cloning of plasmid PSM1 from cyanobacterium Plectonema boryanum 465 // Conf. of genetics and molecular biology. - Lviv (Ukraine). - 2000. P. 53.

8. Samoilenko V.A. PSTS4 - vector for Plectonema boryanum 465 // Conf. for student, PHD students and young scientists on molecular biology and genetics. Kyiv (Ukraine). - 2001. P. 23.

9. Tsymbal N.V., Samoilenko V.A. Conjuctive transfer of a shuttle vector for cyanobacterium Plectonema boryanum 465. Conf. of genetics and molecular biology. - Lviv (Ucraine). - 2000. P. 54.