Дослідження мутацій та поліморфізмів послідовності ДНК гена фенілаланінгідроксилази в родинах високого ризику фенілкетонурії - Автореферат

Вже до 2000 року на хромосомах людини картовано близько 1000 генів, мутації яких призводять до різних спадкових захворювань (MCKUSICK et al., 2000). Одним із перших в геномі людини було картовано та ідентифіковано ген фенілаланінгідроксилази (ФАГ), мутації в якому обумовлюють розвиток захворювання з аутосомно-рецесивним типом успадкування - фенілкетонурії (Lidsky, 1984). Дослідження мутантних варіантів гена цього захворювання надає можливість вивчати природу, походження і механізми розповсюдження в популяціях мутацій геному людини. Дослідження проводилися в рамках тематичних планів Інституту гігієни і медичної екології АМН України №109.98 "Розробка методів молекулярно-генетичної діагностики найбільш поширених в Україні нейродегенеративних захворювань і розумової відсталості спадкової природи" та Інституту молекулярної біології і генетики НАНУ №2. 28.2.2 "Популяційно-генетичні дослідження мутацій у групах високого ризику важких спадкових патологій в Україні". Дослідити частоту і спектр мутацій гена ФАГ у хворих на ФКУ з України.Матеріалом для дослідження при проведенні пренатальної ДНК-діагностики фенілкетонурії були біоптати хоріона, плаценти і некультивовані клітини амніотичної рідини, отримані від вагітних із цих сімей і надані Інститутом педіатрії, акушерства і гінекології АМН України, Кримським і Криворізьким міжобластними медико-генетичними центрами. Було показано, що в 19-ти пацієнтів DHPLC профіль представлений двома піками, що свідчить про мутацію в 7-ому екзоні гена ФАГ у цих пацієнтів (рис. Розроблена нами власна модифікація цього методу дозволила провести аналіз 6-ти мутацій в послідовності 7-го екзону, а саме R252W, R261Q, R261X, G272X, S273F та P281L, використовуючи одну пару праймерів та 6-ть різних ендонуклеаз рестрикції (Eco881, HINFI, BAMHI, DDEI, Sau3A, MSPI). Таким чином, у 101-го хворого на ФКУ з різних регіонів України нами було проведено молекулярно-генетичний аналіз мутантних алелей в послідовності 1-го, 3-го, 5-го, 7-го, 11-го та 12-го екзонів, а також 10-го і 12-го інтронів, що дозволило нам ідентифікувати мутації на 73% ФКУ хромосом. Зчеплення ж із STR-поліморфізмом не було таким сталим: у 54-х випадках мутацію R408W було виявлено на хромосомах з алелем 238 п.н., у шести випадках на хромосомі з алелем 242 п.н., у трьох випадках на хромосомі з алелем 246 п.н, і лише в поодиноких випадках на хромосомах з алелями 230 і 234 п.н.Вирішення поставлених в даній роботі завдань дозволило зясувати походження, спектр та розповсюдження мутацій гена ФАГ в Україні, а також встановити асоціацію цих мутацій з розвитком клінічних форм фенілкетонурії, що відкриває перспективи для дослідження природи взаємодії конкретних генетичних чинників патогенезу та пошуку нових засобів профілактики цього спадкового захворювання. Встановлено, що мажорною для популяції України є мутація R408W, частота зустрічальності якої в групі хворих на ФКУ складає 57%. У результаті сегрегаційного аналізу поліморфних послідовностей ДНК (VNTR і STR) із мажорною мутацією R408W встановлено статистично вірогідну нерівновагу за зчепленням з мінігаплотипом VNTR03/STR238, що свідчить про одноподійне походження цієї мутації в популяції України. Встановлено, що мутація R408W у гомозиготному стані обумовлює розвиток "класичної" форми ФКУ, мутації ж інших типів можуть мати модифікуючий вплив на формування фенотипових ознак даного захворювання. Отримані результати свідчать про високу (93,3%) інформативність використання аналізу мутації R408W і алельних варіантів VNTR-і STR-поліморфізмів для пренатальної ДНК-діагностики фенілкетонурії і масового скринінгу гетерозиготних носіїв цього захворювання в Україні.

Основний зміст

1. Вирішення поставлених в даній роботі завдань дозволило зясувати походження, спектр та розповсюдження мутацій гена ФАГ в Україні, а також встановити асоціацію цих мутацій з розвитком клінічних форм фенілкетонурії, що відкриває перспективи для дослідження природи взаємодії конкретних генетичних чинників патогенезу та пошуку нових засобів профілактики цього спадкового захворювання.

2. Вперше у хворих на ФКУ з України проаналізовано 140 мутацій гена ФАГ. Мутантні алелі ідентифіковані на 73-х% ФКУ хромосом і представлені 11-ма різними мутаціями: 9-міссенс мутацій, 1- нонсенс мутація і 2-і мутації сайтів сплайсингу.

3. Встановлено, що мажорною для популяції України є мутація R408W, частота зустрічальності якої в групі хворих на ФКУ складає 57%.

4. У результаті сегрегаційного аналізу поліморфних послідовностей ДНК (VNTR і STR) із мажорною мутацією R408W встановлено статистично вірогідну нерівновагу за зчепленням з мінігаплотипом VNTR03/STR238, що свідчить про одноподійне походження цієї мутації в популяції України.

5. Встановлено, що мутація R408W у гомозиготному стані обумовлює розвиток "класичної" форми ФКУ, мутації ж інших типів можуть мати модифікуючий вплив на формування фенотипових ознак даного захворювання.

6. Отримані результати свідчать про високу (93,3%) інформативність використання аналізу мутації R408W і алельних варіантів VNTR-і STR-поліморфізмів для пренатальної ДНК-діагностики фенілкетонурії і масового скринінгу гетерозиготних носіїв цього захворювання в Україні.

7. Вперше створено банк лейкоцитарної ДНК хворих на фенілкетонурію (101 зразок), членів їхніх родин (182 зразки) і осіб, які брали участь у програмі генетичного тестування (175 зразків) з України.

Перелік наукових праць, опублікованих за темою дисертації

1. Dork T., Macek M., Mekus F., Tummler B., Tzountzouris J., Casals T., Krebsova A., Koudova M., Sakmaryova I., Macek M., Vavrova V., Zemkova D., Ginter E., Petrova N.V., Ivaschenko T., Baranov V., Witt M., Pogorzelski A., Bal J., Zekanowsky C., Wagner K., Stuhrmann M., Bauer I., Seydewitz H.H., Neumann T., Jakubiczka S., Kraus C., Thamm B., Nechiporenko M., Livshits L., Mosse N., Tsukerman G., Kadasi L., Ravnik-Glavac M., Glavac D., Comel R., Vouk K., Kucinkas V., Krumina A., Teder M., Kocheva S., Efremov G.D., Onay T., Kirdar B., Malone G., Schwartz M., Zhou Z., Freidman K.J., Carles S., Claustres M., Bozon D., Verligue C., Ferec C., Tzetis M., Kanavakis E., Cuppens H., Bombiery C., Pignatti P.F., Sangiuolo F., Jordanova A., Kusic J., Radojkovic D., Sertic J., Richter D., Rukavina A.S., Bjorck E., Strandvik B., Cardoso H., Montgomery M., Nakielna B., Hughes D., Estivill X., Aznarez I., Tillis E., Tsui L-C., Zielenski J. Characterization of a novel 21-kb deletion, CFTRDELE2,3 (21 kb), in the CFTR gene: a cystic fibrosis mutation of Slavic origin common in Central and East Europe // Hum Genet. - 2000. - Vol. 106, N 3. - P. 259-268.

2. Нечипоренко М.В., Лившиц Л.А. Анализ мутаций гена фенилаланингидроксилазы в семьях высокого риска фенилкетонурии в Украине // Цитология и генетика. - 2000. - Т. 34, №6. - С. 59-63.

3. Нечипоренко М.В., Кравченко С.А, Лівшиць Л.А. Аналіз мутацій та VNTR-поліморфізму гена фенілаланінгідроксилази //Український біохімічний журнал. - 2001. - Т. 73, №2. - С. 63-67.

4. Нечипоренко М.В., Кравченко С.А., Лівшиц Л.А. Молекулярно-генетичний аналіз мутацій та мінігаплотипів гена фенілаланінгідроксилази в Україні // Біополімери і клітина. - 2001. - Т.17, N6. - С. 556-559.

5. Nechyporenko M.V., Kravchenko S.A., Livshits L.A. PKU in Ukraine: PAH gene mutations and minihaplotype analysis // Bulletin of molecular medicine. - 2001. - №9-10. - P. 1-6.

6. Нечипоренко М.В., Кравченко С.А., Лившиц Л.А. Анализ мутаций и VNTR-полиморфизма гена фенилаланингидроксилазы //Украинский биохимический журнал. - 2000. - Т. 72, №2. - С. 141.

7. Nechyporenko M.V., Kravchenko S.A., Livshits L.A. Mutation and polymorphisms analysis of the phenylalanine hydroxylase gene in high risk PKU families from Ukrane // European Journal of Human Genetics.-2001. - V. 9, supplement 1. - P. 406.

8. Nechyporenko M.V. Mutations and minihaplotypes analysis of the phenylalaninehydroxylase gene in PKU families from Ukraine // Abstaract of the Conference for students, PHD students and young scientists. - Kyiv (Ukraine). - 2001. - P. 154.