Дослідження механізмів загибелі неонатальних кардіоміоцитів щура в культурі при моделюванні аноксії-реоксигенації: роль протеасомного протеолізу - Автореферат

Окремі роботи вказують на те, що аутофагічна деструкція клітин серця може розглядатися як один із важливих механізмів загибелі кардіоміоцитів при ремоделюванні міокарда під час гіпертрофії, при кардіоміопатіях та за умов дії кардіотоксичних антибіотиків [Семенов, 2001, Shimomura H., 2001, Hein S., 2002, Kostin S., 2003, Aki T, 2003]. Розповсюдженість програмованих варіантів клітинної загибелі при ішемії-реперфузії міокарду, їх принципова оборотність та певний час, що необхідний для їх реалізації, дозволяє впливати на розвиток цих шляхів при ішемічній хворобі серця з терапевтичною та профілактичною метою. Визначити вплив інгібіторів протеасомного протеолізу на реалізацію явищ ендогенної кардіопротекції в первинній культурі ізольованих неонатальних кардіоміоцитів; Дослідити вплив біофлавоноїда кверцетина та його водорозчинної форми - лікарського препарату "Корвітин" - на співвідношення живих та загиблих різними шляхами кардіоміоцитів, а також на відтворення явищ ендогенної кардіопротекції у первинній культурі ізольованих неонатальних кардіоміоцитів щура. Методи дослідження: виділення та культивування кардіоміоцитів 2-3-денних щурів; визначення живих клітин, клітин, що загинули шляхом некрозу та апоптозу цитологічним методом за допомогою флюорисцентних ядерних барвників "Hoechst" (біз-бензимід) і пропідіум іодид, а також клітин, що загинули шляхом АКС за допомогою флюорисцентного барвника монодансилкадаверин; визначення живих та загиблих різними шляхами кардіоміоцитів за допомогою електронно-мікроскопічних досліджень; визначення активності протеасомного протеолізу в культурі за допомогою спектрофлюориметричного методу з використанням специфічних флюорогенних субстратів протеасоми; методика моделювання аноксії-реоксигенації на культурі кардіоміоцитів і відтворення явищ прекондиціонування та посткондиціонування на цій культурі.Після кожного з циклів шматочкам міокарду давали осісти, а надосадове середовище зливали, клітини осаджували шляхом центрифугування при 400 g протягом 1 хвилини, після чого відмивали від залишків колагенази, шляхом такого ж центрифугування у чистому буфері. Для моделювання реоксигенації після аноксії проводилася заміна живильного середовища та культивування клітин за вихідних умов протягом 60 хвилин. неонатальний кардіоміоцит реоксигенація протеасома При використанні методу подвійного фарбування клітин флюорисцентними барвниками "Hoechst" та пропідіум іодид було встановлено, що співвідношення живих, некротичних (пропідіум іодид позитивних) та апоптотичних (пропідіум іодид негативних з фрагментованим ядром) клітин у контролі становить 89.8 % ± 0.90, 3.2 % ± 0.33 та 5.8 % ± 0.73 відповідно (n = 10). Так встановлено, що трипсиноподібна активність протеасоми в контролі становить 7.64 ± 0.53 НМ амідометилкумаріна (АМК) на 106 клітин у хвилину (n = 7), хімотрипсиноподібна - 9.91 ± 1.76 НМ АМК на 106 клітин у хвилину (n = 7), а пептидилглутаміл-пептидгідролазна активність - 0.059 ± 0.001 НМ АМК на 106 клітин у хвилину (n = 7). Шестидесятихвилинна реоксигенація призводила до часткового збільшення активності протеасоми: трипсиноподібна зростала на 8.7 % (Р = 0.75, порівняно з аноксією; n = 7), хімотрипсиноподібна збільшувалася порівняно з аноксією на 46.0 % (P=0.03; n = 7), а пептидилглутаміл-пептидгідролазна активність відновлювалася до контрольного, вихідного рівня і навіть перевищувала його, збільшуючись порівняно з аноксією у 5.4 рази (Р = 0.01; n = 7) (рис.При відтворенні аноксії-реоксигенації в первинній культурі ізольованих неонатальних кардіоміоцитів щура, поряд із збільшенням кількості некротичних клітин, спостерігається активація запрограмованих шляхів клітинної смерті, таких як апоптоз та аутофагічна клітинна смерть, що свідчить про їх участь в розвитку патології серця; При інгібуванні запрограмованих варіантів клітинної смерті (апоптозу та, як вперше встановлено нами, аутофагічної клітинної смерті) при аноксії-реоксигенації відбувається значне підвищення кількості клітин, що загинули шляхом некрозу, та зменшення загальної кількості живих клітин.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

1. За допомогою модифікованої нами методики отримання первинної культури ізольованих неонатальних кардіоміоцитів щура та вперше розробленої нами методики відтворення посткондиціонування на культурі клітин проведені детальні дослідження розвитку запрограмованих шляхів загибелі кардіоміоцитів (апоптозу та аутофагічної клітинної смерті), а також некрозу та їх взаємовідносин в умовах впливу аноксії-реоксигенації та при відтворенні явищ ендогенної кардіопротекції.

2. При відтворенні аноксії-реоксигенації в первинній культурі ізольованих неонатальних кардіоміоцитів щура, поряд із збільшенням кількості некротичних клітин, спостерігається активація запрограмованих шляхів клітинної смерті, таких як апоптоз та аутофагічна клітинна смерть, що свідчить про їх участь в розвитку патології серця;

3. При інгібуванні запрограмованих варіантів клітинної смерті (апоптозу та, як вперше встановлено нами, аутофагічної клітинної смерті) при аноксії-реоксигенації відбувається значне підвищення кількості клітин, що загинули шляхом некрозу, та зменшення загальної кількості живих клітин. Цей ефект ще більше посилюється на фоні інгібування активності протеасоми;

4. Всі три види протеолітичної активності протеасоми (трипсиноподібна, хімотрипсиноподібна та пептидилглутаміл-пептидгідролазна) знижуються при відтворенні аноксії та відновлюються, не досягаючи вихідного рівня, при реоксигенації;

5. Специфічні інгібітори протеасоми у великих дозах (10 МКМ) збільшують кількість загиблих кардіоміоцитів у культурі за рахунок активації апоптозу та аутофагічної клітинної смерті, а у малих (2.5-5 МКМ) не викликають значного збільшення кількості загиблих клітин;

6. Малі дози протеасомних інгібіторів здатні відтворювати позитивні ефекти прекондиціонування та посткондиціонування, тобто можуть бути використані як агенти для фармакологічного відтворення цих феноменів;

7. Біофлавоноїд кверцетин та його водорозчинна форма "Корвітин" здатні пригнічувати всі три протеолітичні активності протеасоми в культурі ізольованих кардіоміоцитів та здатні відтворювати у культурі кардіоміоцитів явища прекондиціонування та пост кондиціонування, що може пояснювати їх кардіопротекторну дію.

1. Веремеенко К.Н., Досенко В.Е., Нагибин В.С., Кизим А.И., Мойбенко А.А. Протеолитические ферменты и апоптоз // Укр. биохимический журнал. - 2003. -Т., №4. -С. 20-34. Здобувачем виконано підготування статті до друку.

2. Нагібін В.С., Досенко В.Є., Пивовар С. М., Мойбенко О.О., Ягупольский Л.М. Фторований аналог діазоксиду попереджує апоптоз неонатальних кардіоміоцитів під час аноксії-реоксигенації // Фізіологічний журнал. -2004. -Т.50, № 3. -С. 3-9. Здобувачем виконано пошук літератури, отримання та культивування неонатальних кардіоміоцитів, визначення живих та загиблих клітин, підготування статті до друку.

3. Тумановська Л.В., Досенко В.Є., Нагібін В.С., Макогон Н.В., Мойбенко О.О. Апоптотична, аутофагічна та онкотична загибель кардіоміоцитів при аноксії-реоксигенації // Фізіологічний журнал. -2004. -Т.50, №5. -С. 11-18. Здобувачем виконано пошук літератури, отримання та культивування неонатальних кардіоміоцитів, моделювання аноксії-реоксигенації.

4. Мойбенко О.О., Досенко В.Є., Нагибін В.С., Тумановська Л.В. Особливості клітинної смерті кардіоміоцитів при аноксії-реоксигенації // Клінічна та експериментальна патологія. -2004. -Т.ІІІ, №2. -С. 30-32. Здобувачем виконано отримання та культивування неонатальних кардіоміоцитів, моделювання аноксії-реоксигенації.

5. Dosenko V.E., Nagibin V.S., Tumanovskaya L.V., Moibenko A.A., Vaage J. Postconditioning prevents apoptotic necrotic and autophagic cardiomyocyte cell death in culture // Фізіологічний журнал. -2005.Т.51. - №3. -С. 12-17. Здобувачем виконано пошук літератури, культивування кардіоміоцитів, моделювання аноксії-реоксигенації, визначення живих та загиблих клітин, підготування статті до друку.

6. Мойбенко А.А., Досенко В.E., Нагибин В.С. Ферментативные механизмы апоптоза // Пат. физиология и экспериментальная терапия. -2005. -№3. -С. 17-26. Здобувачем виконано підготування статті до друку.

7. Досенко В.Є., Загорий В.Ю., Нагибин В.С., Мойбенко А.А. Влияние N-3-метиладенина на пептидазную и рибонуклеазную активность протеасомы // Укр. биохимический журнал. -2005. -Т.77, №5. -С. 52-56. Здобувачем виконано пошук та аналіз літератури та підготування статті до друку.

8. Досенко В.Є., Нагибин В.С., Тумановская Л.В., Загорий В.Ю., Мойбенко А.А. Влияние кверцетина на активность 20S, 26S протеасомы и протеасомную активность в изолированных кардиомиоцитах // Биомедицинская химия. - 2006. -Т.52, №2. -С. 138-145. Здобувачем виконано пошук літератури, культивування кардіоміоцитів, визначення протеасомної активності.

9. Dosenko V.E., Nagibin V.S., Tumanovskaya L.V., Moibenko A.A., Vaage J. Proteasomal proteolysis in anoxia-reoxygenation, preconditioning and postconditioning of isolated cardiomyocytes // Pathophysiology. -2006. -Vol. 13, N2. -P.119-125. Здобувачем виконано пошук літератури, культивування кардіоміоцитів, визначення протеасомної активності, підготування статті.

10. Dosenko VE, Nagibin VS, Tumanovska LV, Moibenko AA. Protective effect of autophagy in anoxia-reoxygenation of isolated cardiomyocytes? // Autophagy. -2006. -Vol.2. -Issue.4. -P.305-6. Здобувачем виконано пошук літератури, культивування кардіоміоцитів, підготування статті до друку.

11. Dosenko V.E., Nagibin V.S., Moibenko A.A. Phosphocreatine (neoton) prevents necrotic and apoptotic death of cardiomyocytes in modelling of anoxia-reoxygenation // J. Mol. Cell. Cardiol. -2004. -Vol.36. -Issue 5. -P.746.

12. Nagibin V.S., Dosenko V.E., Moibenko A.A. Proteasomal activity in isolated neonatal cardiomyocytes in anoxia-reoxygenation // Abstracts of Joint 59th Harden EMBO Conf. "The ubiquitin proteasome system in health and disease", (Cirencester, 6-10 Sept., 2004). -P.13.

13. Nagibin V.S., Dosenko V.E., Tumanovskaya L.V., Moibenko O.O. Apoptotic and autophagic death of cardiomyocytes in anoxia-reoxygenation and at inhibition of proteasome activity // Abstracts of 12th Euroconference on apoptosis, (Chania, 17-20 Sept. 2004). -P.117.

14. Nagibin V.S., Dosenko V.E., Tumanovskaya L.V., Moibenko A.A., Vaage J. Autophagic cell death of cardiomyocytes in anoxia-reoxygenation is prevented by postconditioning. KATP-channels dependent effect // Abstracts of 13th Euroconference on apoptosis "Survival on the Danube", (Budapest, 1-4 Oct., 2005). -P.58.

15. Dosenko V.E., Nagibin V.S., Tumanovskaya L.V., Moibenko A.A. Proteasome inhibitors as agents of pharmacological preconditioning // Abstracts of 13th Euroconference on apoptosis "Survival on the Danube", (Budapest, 1-4 Oct., 2005). -P.161.

16. Dosenko V., Nagibin V., Tumanovskaya L., Yuzkiv M., Moybenko A., Vaage J. Postconditioning in cultured cardiomyocytes: role of proteasomal proteolysis and ATP-sensing K channels // J. Mol. Cell. Cardiology. -2005. -Vol. 38, Abstracts 25th Annual Scientific Sessions, European Section of the International Society for Heart Research (Tromso, June 21-25, 2005). -Р.1017.

17. Nagibin V.S., Dosenko V.E., Tumanovska L.V., Moybenko A.A., Vaage J. Proteasome inhibitors reproduce preconditioning and postconditioning in cardiomyocyte culture // J. Mol. Cell. Cardiology. -2005. -Vol. 40, Abstracts 26th Annual Scientific Sessions, European Section of the International Society for Heart Research (Manchester, June 14-17, 2006). -Р.936.