Дослідження експресії муцинових генів в кон"юнктиві ока людини - Автореферат

Аналіз нуклеотидних і амінокислотних послідовностей вказує на відсутність гомології між різними типами муцинових генів. Видозмінений характер експресії муцинових генів було виявлено при різних патологічних станах, включаючи запальні процеси викликані бактеріальною та вірусною інфекцією (Jany et al., 1997, Adier et al., 1995), системні захворювання, злоякісні новоутворення (Lalani, 1991) і бронхіальну астму (Rose, 1992). В роботах останніх років було показано, що ряд ендогенних та екзогенних факторів, зокрема ростові фактори, гормони, хімічні препарати і патогенні мікроорганізми можуть впливати на експресію муцинових генів в епітеліальних тканинах (Parry, 1992, Guzman et al., 1995, An et al., 1994, Gollub et al., 1995). Механізми контролю експресії муцинових генів є досить складними і можуть регулюватись на різних рівнях, включаючи транскрипцію, сплайсинг МРНК і трансляцію (Dohrman et al., 1994, Kovaric et al., 1998). Дисертаційна робота "Дослідження експресії муцинових генів в конюнктиві ока людини" виконувалась за планом наукової роботи кафедри офтальмології Львівського державного медичного університету в співробітництві з Брістольським Університетом (Велика Британія).Зразки тканин шлунку, товстої і тонкої кишки, підщелепної слинної залози, бронхів і раку молочної залози були використані як позитивний контроль при вивчені експресії муцинових генів. За допомогою компютерного аналізу банків даних Swissprot і ЕМВО та програм для порівняння білкових і ДНКОВИХ послідовностей (Bestflt і Fasta) було відібрано 9 специфічних олігонуклеотидних послідовностей (довжиною 48 нуклеотидів кожна), що відповідають тандемним повторам девяти муцинових генів. Специфічність гібридизаційного сигналу було підтверджено аналізом тканин, в яких експресію муцинових генів було показано в попередніх дослідженнях, а саме: шлунок, товста і тонка кишка, підщелепна слинна залоза, бронхи, трахея і рак молочної залози. Девять олігонуклеотидних проб, що відповідають тандемним повторам відповідних муцинових генів, були синтезовані на ДНК синтезаторі і очищені до гомогенного стану за допомогою хроматографії у зворотній фазі. Варто зазначити, що даний етап був необхідним для того, щоб позбутися олігонуклеотидів синтез яких не був завершеним, оскільки наявність вкорочених олігонуклеотидів в гібридизаційній суміші може призвести до появи неспецифічного звязування і отримання недостовірних результатів.На основі детального аналізу нуклеотидних та амінокислотних послідовностей девяти муцинових генів було підібрано специфічні олігонуклеотидні проби для проведення досліджень методом гібридизації in situ. Специфічність гібридизаційного сигналу з радіоактивними пробами перевірено на тканинах, в яких експресія муцинових генів була вивчена раніше. Отримані результати є базовими для вивчення змін в експресії муцинових генів при патологічних станах ока, включаючи запальні процеси (конюнктивіти), аутоімунні захворювання (синдром Стівенса Джонсона, Cicatrical pemphigoid), деструктивні зміни (хімічні та фізичні травми), регенеративні процеси та злоякісний ріст.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ.

1. На основі детального аналізу нуклеотидних та амінокислотних послідовностей девяти муцинових генів було підібрано специфічні олігонуклеотидні проби для проведення досліджень методом гібридизації in situ. Специфічність гібридизаційного сигналу з радіоактивними пробами перевірено на тканинах, в яких експресія муцинових генів була вивчена раніше.

2. Вперше показано, що в конюнктиві ока людини експресуються три типи муцинових генів, а саме: MUC1, MUC4 і MUC5AC. Експресію трансмембранного муцину MUC1 виявлено у всіх шарах сквамозного епітелію конюнктиви. Секреторний муцин MUC4 експресується в усіх шарах епітелію конюнктиви і ця експресія має гомогенний характер локалізації. МРНК MUC5AC виявляється лише в базальному шарі конюнктивального епітелію і має виражений плямистий характер розповсюдження. Отримані результати є базовими для вивчення змін в експресії муцинових генів при патологічних станах ока, включаючи запальні процеси (конюнктивіти), аутоімунні захворювання (синдром Стівенса Джонсона, Cicatrical pemphigoid), деструктивні зміни (хімічні та фізичні травми), регенеративні процеси та злоякісний ріст.

3. Створено бактерійний вектор для експресії фрагмента MUC4, що містить тандемні повтори. Отримано клони трансформованих бактерій, в яких рекомбінантний білок експресується в міліграмових кількостях.

4. Розроблено методику афінної очистки N-кінцевого фрагмента MUC4 на Talon Сефарозі, що дозволяє отримати велику кількість рекомбінантного білка.

5. Наявність рекомбінантного N-MUC4 дозволила розпочати роботу з отримання специфічних моноклональних антитіл, а також вивченню біохімічних властивостей даного муцину.

1. Ellingham R.B., Myerscough N., Gout I.I., Berry M., Corfield A. Soluble mucins in human aqueous tears / / Biochemical Society Transactions. -1997.- 25. N 3.- P.12-16.

2. Гут I.Й., Елінгем P., Істі Д., Семенова Г.С. Вивчення експресії секреторних муцинів у конюнктиві ока людини // Биополимеры и клетка.-1998.- 14. N 1.- C. 29-38.

3. Gout I. I. Structure and function of epithelial mucins. Review // Биополимеры и клетка.-1998.- 14. N 5.- C.410-419.

4. Gout I. I., Ellingham R. B., Berry M. Biochemical properties of mucins in the human conjunctiva // South Western Ophthalmological Society Meeting. Bristol, United Kingdom, June 1996.- P.72.

5. Gout I.I., Ellingham R.B., Easty D. In situ hybridisation for MUC genes in human conjunctiva // South Western Ophthalmological Society Meeting. Bristol, United Kingdom, June 1997.- P.132.

6. Gout I.I. Expression of transmembrane mucin MUC1 in human conjunctiva // Lorn Cancer Meeting. Lorn, Australia, February 1998.- P.147.