Дослідження взаємного внеску кальцієвих каналів плазматичної мембрани, мітохондрій і ендоплазматичного ретикулуму у кальцієву сигналізацію в нейронах спінальних гангліїв малого і середнього діаметра соми за допомогою методу флуоресцентної кальційметрії.
При низкой оригинальности работы "Динамічна взаємодія кальцієвих каналів плазматичної мембрани з внутрішньоклітинними кальцієвими депо в сенсорних нейронах щура", Вы можете повысить уникальность этой работы до 80-100%
Зокрема, встановлено, що практично в усіх типах клітин амплітуда і швидкість захоплення Са2 мітохондріями залежать не тільки від амплітуди підвищення [Ca2 ]i, але й від джерела його надходження у клітину, а також від механізмів, за допомогою яких дане підвищення відбувається (Babcock et.al., 1997). Мітохондрії можуть захоплювати як кальцій, що входить через кальцієві канали плазматичної мембрани, так і іони, що вивільняються з депо ендоплазматичного ретикулуму (ЕР). В той же час ЕР у багатьох типах клітин здатен підсилювати кальцієвий сигнал, що надходить від кальцієвих каналів плазматичної мембрани шляхом механізму кальційіндукованого вивільнення Са2 (calcium-induced calcium release, CICR) (Shmigol et.al., 1995). Тому детальний аналіз впливу кальцієвих каналів плазматичної мембрани, мітохондрій і ЕР на формування внутрішньоклітинних кальцієвих транзієнтів, а також взаємодії цих структур у процесі формування кальцієвих сигналів у сенсорних нейронах, здогадно залучених у ноціцепцію, є дуже важливим і представляє безсумнівний науковий інтерес і велике практичне значення. З урахуванням цього були поставлені наступні завдання: Використовуючи метод флуоресцентної кальційметрії, встановити внесок мітохондрій у зміни амплітуди та кінетичних характеристик кальцієвих транзієнтів, викликаних: деполяризацією плазматичної мембрани, вивільненням Са2 з депо ЕР, активацією капсаіцинчутливих рецепторів плазматичної мембрани, активацією депокерованих кальцієвих каналів плазматичної мембрани.Розділ 1 “Огляд літературних даних” присвячений висвітленню відомих аспектів функціонування мітохондрій та ендоплазматичного ретикулуму як активних внутрішньоклітинних кальцієвих депо, а також висвітлено процес взаємодії цих органел при формуванні кальцієвих транзієнтів в різних типах клітин. Для точного обчислення [Ca2 ]i нами використовувалася наступна формула: [Ca2 ]i = Kd · B · (R - Rmin) / (Rmax - R), де Kd - константа дисоціації індикатору з кальцієм; B - коефіцієнт, обумовлений оптичними характеристиками установки, дорівнює співвідношенню F5000/F500s (F5000 - інтенсивність флуоресценції indo-1 у відсутності кальцію, F500s - інтенсивність флуоресценції indo-1 при насичуючій концентрації Са2 ); Rmin - співвідношення F400/F500 у відсутності кальцію; Rmax - співвідношення F400/F500 при насичуючій концентрації іонів. Апроксимацію кривих наростання кальцієвих транзієнтів виконували за формулою: [Ca2 ]i =[Ca2 ]i o A*(1 - exp(-)), де [Ca2 ]i - концентрація Са2 в цитозолі клітини в даний момент часу, [Ca2 ]i o - базальний рівень кальцію, t0 - початковий момент часу ?1 - стала часу наростання транзієнта, А - амплітудний коефіцієнт. Для детальнішого аналізу участі внутрішньоклітинних органел у підтриманні кальцієвого гомеостазу була проведена математична обробка отриманих даних і виділені криві, що характеризують зміни, внесені в амплітуду і кінетику кальцієвих транзієнтів уніпортером мітохондрій і ендоплазматичним ретикулумом (Рис.5). Захоплення іонів кальцію мітохондріями починалося з 4ї - 8ї с і досягало максимуму через 14 - 18 с від початку деполяризації.У дисертації відповідно до поставленої мети та завдань проведено дослідження функціонування кальційрегулюючих механізмів у ноціцептивних нейронах спінальних гангліїв (СГ) та встановлено внесок кожного з механізмів у формування внутрішньоклітинних кальцієвих транзієнтів, що дозволяє значно розширити уявлення про роль різних Са2 -транспортних систем у кальцієвій сигналізації нейронів СГ малого та середнього діаметру. З використанням флуоресцентної кальційметрії досліджено участь мітохондрій та ендоплазматичного ретикулуму (ЕР) у формуванні характеристик кальцієвих сигналів, викликаних надходженням Са2 з позаклітинного середовища при деполяризації плазматичної мембрани, входом Са2 з позаклітинного середовища в цитозоль нейронів при спустошенні ЕР шляхом активації його рецепторів або блокуванні АТФАЗ, а також активацією ванілоїдних рецепторів плазматичної мембрани в нейронах СГ малого та середнього діаметру, вірогідно залучених у процеси ноціцепції. Дослідження входу Са2 з позаклітинного середовища в цитозоль нейронів СГ малого та середнього діаметру виявило значні розбіжності в кінетичних характеристиках фази наростання відповідних транзієнтів в залежності від механізму, за допомогою якого відбувалось вивільнення Са2 з депо ЕР. Виявлено гетерогенність досліджуваних нейронів за чутливістю мембрани ЕР до капсаіцину, це може бути обумовлене наявністю різних підтипів ванілоїдних рецепторів на мембрані ЕР нейронів СГ малого та середнього діаметру соми. Отримані результати демонструють важливу роль взаємодії механізмів, за допомогою яких іони Са2 надходять з позаклітинного середовища при деполяризації плазматичної мембрани, активації її рецепторів, при спустошенні депо ЕР з внутрішньоклітинними кальційрегулюючими органелами у кальцієвій сигналізації нейронів СГ, залучених у процеси ноціцепції.
План
Основний зміст роботи
Вывод
У дисертації відповідно до поставленої мети та завдань проведено дослідження функціонування кальційрегулюючих механізмів у ноціцептивних нейронах спінальних гангліїв (СГ) та встановлено внесок кожного з механізмів у формування внутрішньоклітинних кальцієвих транзієнтів, що дозволяє значно розширити уявлення про роль різних Са2 -транспортних систем у кальцієвій сигналізації нейронів СГ малого та середнього діаметру.
З використанням флуоресцентної кальційметрії досліджено участь мітохондрій та ендоплазматичного ретикулуму (ЕР) у формуванні характеристик кальцієвих сигналів, викликаних надходженням Са2 з позаклітинного середовища при деполяризації плазматичної мембрани, входом Са2 з позаклітинного середовища в цитозоль нейронів при спустошенні ЕР шляхом активації його рецепторів або блокуванні АТФАЗ, а також активацією ванілоїдних рецепторів плазматичної мембрани в нейронах СГ малого та середнього діаметру, вірогідно залучених у процеси ноціцепції.
Порівняння впливу внутрішньоклітинних кальційрегулюючих органел на зміни амплітудно-кінетичних характеристик кальцієвих транзієнтів показало, що в досліджуваних нейронах найбільш потужним механізмом регуляції концентрації вільного Са2 в цитозолі є мітохондрії. Вони модулюють кальцієві сигнали, які виникають в цитозолі клітини, незалежно від джерела підвищення [Ca2 ]i.
Аналіз функціонування ЕР виявив його вплив на характеристики внутрішньоклітинних кальцієвих сигналів не лише через вивільнення Са2 шляхом активації відповідних рецепторів ЕР, а і шляхом забезпечення зворотнього звязку між вивільненням Са2 з депо і активацією депозалежного входу Са2 в досліджуваних нейронах.
Дослідження входу Са2 з позаклітинного середовища в цитозоль нейронів СГ малого та середнього діаметру виявило значні розбіжності в кінетичних характеристиках фази наростання відповідних транзієнтів в залежності від механізму, за допомогою якого відбувалось вивільнення Са2 з депо ЕР. Наявність входу Са2 з позаклітинного середовища, викликаного блокуванням АТФАЗ ЕР, свідчить, що підвищення концентрації інозитолтрифосфату в цитозолі не є необхідною умовою виникнення депозалежого входу Са2 в досліджувані нейрони.
Виявлено гетерогенність досліджуваних нейронів за чутливістю мембрани ЕР до капсаіцину, це може бути обумовлене наявністю різних підтипів ванілоїдних рецепторів на мембрані ЕР нейронів СГ малого та середнього діаметру соми. Виявлено участь мітохондрій у формуванні кальцієвих транзієнтів, викликаних активацією ванілоїдних рецепторів плазматичної мембрани.
Отримані результати демонструють важливу роль взаємодії механізмів, за допомогою яких іони Са2 надходять з позаклітинного середовища при деполяризації плазматичної мембрани, активації її рецепторів, при спустошенні депо ЕР з внутрішньоклітинними кальційрегулюючими органелами у кальцієвій сигналізації нейронів СГ, залучених у процеси ноціцепції. Порушення такої взаємодії є однією з причин зміни передачі сенсорних сигналів при патологічних станах. кальцієвий плазматичний нейрон мембрана
Перелік опублікованих праць здобувача за темою дисертації
Статті: П. Костюк, Е. Потапенко, И. Степанова. Щелочно-кислотное равновесие и функция нервной клетки. Весци нацианальной академии наук Беларуси 2003, Т.3, С.34-39.
Е.П. Костюк, И.В. Степанова, В.О. Пинченко. Роль изменений кальциевой сигнализации в процессе ноцицептивной передачи в условиях стрептозотоцин-индуцированного диабета. Клин. и эксперим.патол. 2004, Т.3, №2, С.121-124.
E.P. Kostyuk, P.G. Kostyuk, I.V. Stepanova. Intracellular mechanisms participating in the formation of neuronal calcium signals. Neurophysiology 2004, V36, №5/6, С.405 - 417.
І.В. Степанова, П.Г. Костюк, О.П. Костюк. Динамічна взаємодія структур плазматичної мембрани з внутрішньоклітинними кальцієвими депо в сенсорних нейронах щура. Фізіол. Журн. Т51, №2, С. 14-22.
Тези доповідей: E. Potapenko, P. Kostyuk, I. Stepanova, E. Kostyuk. Intracellular calcium homeostasis changes induced in rat spinal cord neurons by extracellular acidification. Physiological Society Spring Workshop “Receptors and Cell Signslling in Oxidative Stress”, Budapest 2003.
Stepanova I., Dynamic interaction between plasma membrane structures and intracellular calcium stores in nociceptive neurons of rats, IBRO advanced school of neuroscience, IASN 2004, Crimea.
Stepanova I., P. Kostyuk. Possible mechanisms of store-operated entry in rat primary nociceptive neurons, IBRO CEERC Summer school 2005, Hungary.
Вы можете ЗАГРУЗИТЬ и ПОВЫСИТЬ уникальность своей работы
