Диагностика инфекционных заболеваний у животных - Курсовая работа

ДНК-анализы широко применяются в диагностике инфекционных заболеваний, позволяя обнаруживать даже единичные микроорганизмы в организме человека. ДНК-диагностика объединяет несколько методов исследования, самый распространенный из них - метод ПЦР (полимеразной цепной реакции, Polymerase chain reaction, PCR diagnostics) . Ежегодно на рынке появляется все больше тест-систем, предназначенных для выявления как возбудителей различных заболеваний, так и мутаций генов человека, животных и растений. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - высокоточный метод молекулярно-генетической диагностики, который позволяет выявить различные инфекционные и наследственные заболевания, как в острой и хронической стадии, так и задолго до того, как заболевание может себя проявить. полимеразный цепной реакция инфекционный Изначально метод использовался в основном для научных целей, но затем, разглядев его перспективность и эффективность, метод стали продвигать в практическую медицину.История открытия ПЦР-амплификации ДНК - блестящий пример эпохального изобретения, сделанного гениальным одиночкой; причем идея осенила изобретателя мгновенно и, как кажется, абсолютно непредсказуемо. Весной 1983 года, в пятницу вечером, Кари Маллис, 39-летний химик-синтетик из мало кому тогда известной калифорнийской биотехнологической фирмы Cetus, направлялся после работы домой. Суть метода состояла в энзиматическом удлинении олигонуклеотида, наплавленного на участок ДНК, прилегающий к участку мутации. Если дезоксинуклеотиды («кирпичики», из которых построена ДНК) добавлять в реакцию не все сразу, а по одному, то удлинение олигонуклеотида будет происходить только тогда, когда добавляемый дезоксинуклеотид комплементарен участку мутации. Он крутил эту идею и так, и этак, и вдруг его осенила светлая мысль: если реакцию с двумя такими праймерами-олигонуклеотидами проводить не в двух, а в одной пробирке, то количество фрагмента ДНК, ограниченного олигонуклеотидами, увеличится вдвое.Нити ДНК имеют противоположную направленность: 5’-концу одной нити соответствует 3’-конец второй нити. В живой клетке этот процесс происходит следующим образом: с помощью специальных ферментов - гираз происходит расплетение спирали в том ее участке, где должна происходить репликация. Далее водородные связи, связывающие нити, разрываются и нити расходятся. Репликация одновременно идет и на второй нити ДНК (“-” или антисмысловой), только наращивание цепи происходит в обратном направлении. В результате процесса репликации из одной молекулы ДНК образуется две молекулы ДНК, в которых одна нить от материнской молекулы ДНК, а вторая, дочерняя, вновь синтезированная.Многие традиционные методы диагностики, например иммуноферментный анализ, выявляют белки-маркеры, являющиеся продуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что дает лишь опосредованное свидетельство наличия инфекции. Выявление специфического участка ДНК возбудителя методом ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции. Высокая специфичность метода ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что исключает возможность получения ложных результатов, в отличие от иммунологических методов анализа, где нередки ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антигенами. Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК возбудителя.Перекрестная контаминация от пробы к пробе (в процессе обработки клинических образцов или при раскапывании реакционной смеси), приводящая к появлению спорадических ложноположительных результатов; Контаминация продуктами амплификации (ампликонами), имеющая наибольшее значение, т.к. в процессе ПЦР ампликоны накапливаются в огромных количествах и являются идеальными продуктами для реамплификации.Решение этой задачи обеспечивается богатым арсеналом методических приемов, - начиная от клинических методик вирусологического и бактериологического тестирования и кончая иммунохимическими и молекулярно - биологическими методами. При этом под некультивируемостью мы понимаем, как невозможность на современном уровне развития микробиологии подобрать условия культивирования для большинства микроорганизмов, существующих в природе (по некоторым данным эта цифра может достигать 99%), так и невозможность высеять хорошо культивируемый микроорганизм из какой-либо биологической среды, содержащей ингибиторы его размножения. Кроме того, целый ряд клинически важных бактериальных возбудителей животных может плохо культивироваться изза широкого применения в современной ветеринарной лечебной практике антибиотиков широкого спектра действия. Кроме того, этот метод практически незаменим в тех случаях, когда патологический ген оказывает свое действие только в тканях, которые недоступны для исследования (мозг, печень). Для диагностики инфекционных заболеваний наибольшее применение нашел способ амплификации (умножения) нуклеиновых кислот: полимеразная цепная реакция (ПЦР), лигазная ц

Содержание

Введение

1. История открытия ПЦР

2. Принцип ПЦР

3. Преимущества метода ПЦР

4. Ограничения метода ПЦР

5. ПЦР как экспресс-метод диагностики инфекционных заболеваний

6. Техника исполнения

6.1 Забор материала для ПЦР-исследования

6.2 Выделение ДНК из образцов

6.3 Проведение полимеразной цепной реакции

7. Применение методов ПЦР-диагностики в ветеринарии

7.1 Диагностика гриппа птиц

7.2 Диагностика хламидиозной инфекции у животных

7.3 Диагностика туберкулеза крупного рогатого скота

7.4 Диагностика лейкоза кошек

7.5 Диагностика аденовироза и гепатита собак

Заключение

Список источников

ДНК-диагностика - это один из наиболее современных высокотехнологичных методов исследования. ДНК-анализы широко применяются в диагностике инфекционных заболеваний, позволяя обнаруживать даже единичные микроорганизмы в организме человека.

ДНК-диагностика объединяет несколько методов исследования, самый распространенный из них - метод ПЦР (полимеразной цепной реакции, Polymerase chain reaction, PCR diagnostics) .

На сегодняшний день ПЦР -анализ является одной из наиболее распространенных и динамично развивающихся технологий лабораторной диагностики. Ежегодно на рынке появляется все больше тест-систем, предназначенных для выявления как возбудителей различных заболеваний, так и мутаций генов человека, животных и растений. Количество ПЦР-лабораторий неуклонно увеличивается, а ПЦР-анализ становится все более востребованным среди специалистов.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - высокоточный метод молекулярно-генетической диагностики, который позволяет выявить различные инфекционные и наследственные заболевания, как в острой и хронической стадии, так и задолго до того, как заболевание может себя проявить. полимеразный цепной реакция инфекционный

Метод ПЦР был разработан в 1983 году Кэри Мюллисом, за что он был удостоен Нобелевской премии в 1993 году. Изначально метод использовался в основном для научных целей, но затем, разглядев его перспективность и эффективность, метод стали продвигать в практическую медицину.

За генетическую информацию в живом организме любого размера отвечает ДНК - двухспиральная дезоксирибонуклеиновая кислота, состоящая из последовательности четырех нуклеотидов, которые принято обозначать буквами А (аденин), Г (гуанин), Т (тимидин) и Ц (цитозин). Одно из основных правил генетики - правило комплементарности, то есть нуклеотиды соседних спиралей ДНК соединяются только в определеном порядке: А с Т, Г с Ц, и никак иначе.

У каждого живого создания (бактерия, вирус, рыба, зверь) - своя ДНК, причем для выявления конкретного организма достаточно иметь лишь небольшой участок этого хранилища генетической информации. Некоторые виды микроорганизмов, например, вирус иммунодефицита человека, хранят генетическую информацию в другой нуклеиновой кислоте - РНК, но и ее фрагменты можно находить с помощью ПЦР.

Именно на обнаружении этого небольшого, но уникального для каждого отдельного организма участка и построен принцип ПЦР. Для каждого возбудителя создан свой специфический генетический детектор, эталонный фрагмент ДНК, который по принципу комплементарности точно обнаруживает «свой» фрагмент ДНК и запускает реакцию создания огромного количества его копий.

Один цикл ПЦР длится около трех минут, количество копий растет в геометрической прогрессии. Таким образом, за несколько часов количество фрагментов увеличивается в несколько миллиардов раз. Понятно, что теперь определить, какой возбудитель у данной конкретной инфекции, достаточно легко.

1.