Деякі механізми остеогенного диференціювання мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин in vitro - Автореферат

Останні дослідження показали, що мультипотентні мезенхімальні стромальні клітини (МСК) можуть бути успішно застосовані при лікуванні асептичного некрозу головки стегнової кістки [Kawate, 2006], несправжніх суглобів [Goel, 2005], значних кісткових дефектів [Niemeyer, 2008], синдрому ламких кісток [Blanc, 2005]. Традиційно остеоіндукцію МСК проводять хімічним методом за допомогою дексаметазону [Анохина, 2007; Peng, 2007; Nuttelman, 2006], але при цьому може інгібуватися клітинна проліферація [Wei, 2001], спостерігатися продукція клітинами прозапальних цитокінів ІЛ-6 і ІЛ-8 в значно збільшених концентраціях [Возианов, 2009], що ускладнює клінічне застосування таких клітин. В нашій роботі дослідження були спрямовані на розробку технології остеоіндукції МСК, яка б зберігала проліферативну активність клітин після їх індукції за остеогенним шляхом в умовах in vitro. Мета роботи - визначити вплив деяких індукторів остеогенного диференціювання на мультипотентні мезенхімальні стромальні клітини та обґрунтувати найбільш ефективний метод спрямованої остеоіндукції цих клітин in vitro. Метод клітинного культивування застосовувався для ізоляції та культивування МСК і КО; методи хімічної та біологічної остеоіндукції - для остеогенної індукції МСК; прижиттєве забарвлення плазматичних мембран флуоресцентними барвниками РКН67 Green й РКН26 Red Fluorescent - для поліпшення візуального спостереження за розташуванням клітин на поверхнях носіїв клітинних ліній; розрахунок ЕЕ - для оцінки зміни морфології індукованих клітин; МТТ-аналіз (MTT-Cell Proliferation Assay) - для оцінки кількості життєздатних клітин та їх проліферативної активності; цитохімічний метод з використанням субстрату BCIP/NBT - для детекції ЛФ; методи фазово-контрастної та флуоресцентної мікроскопії - для візуалізації культур клітин; статистичний метод - для обробки отриманих результатів.При остеоіндукції МСК дексаметазоном продукція ЛФ клітинами починалась з 7-ї доби (p<0,05), різко підвищувалась до 10-ї доби та стабілізувалась на одному рівні (табл. На 7-му добу в культурі зявлялись малодиференційовані клітини з наявністю одиничних округлих клітин, які продукували ЛФ (ЛФ ), на 13-16-ту добу індукції майже всі клітини продукували ЛФ і мали округлу форму (рис. При додаванні індукційного середовища с дексаметазоном до культури МСК 50% конфлуентності моношар не утворювався через те, що клітини припиняли ділитися. Не зважаючи на недоліки використання BMP [Dhanaraj, 2003; Meijer, 2007], індукція за допомогою цього агенту дозволяє отримати остеогенне диференціювання МСК (p<0,001, починаючи з 7-ї доби індукції) без втрати здатності клітин прикріплюватися до поверхні культуральних флаконів і ділитися (протягом трьох тижнів). Кількість ЛФ клітин, на 7-му добу культивування була меншою, ніж КО (p<0,001), а на 14-ту добу, навпаки, кількість ЛФ клітин перевищувала кількість КО більш ніж в 1,5 разу (табл.В дисертації наведене теоретичне узагальнення і нове рішення актуальної наукової проблеми, що стосується встановлення оптимальних індукторів остеогенного диференціювання мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин in vitro. Результати проведених досліджень свідчать про доцільність використання методу остеоіндукції, який включає в себе культивування мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин спільно з остеогенно детермінованими клітинами (клітинами окістя) на біоматеріалі „Остеоматрикс”. Виявлено достовірне збільшення кількості клітин на „Остеоматриксі” і колагені І типу, а також проростання клітин в товщу „Остеоматриксу” на глибину до 40-50 мкм. Клітинні культури при культивуванні на губчато-кортикальних чіпсах «Тутопласт» зберігають свою життєздатність, але проліферації у них в різні строки культивування не відмічається, тобто «Тутопласт» не сприяє процесам проліферації клітин. За результатами забарвлення на лужну фосфатазу «Остеоматрикс» і колаген І типу сприяють остеогенному диференціюванню мезенхімальних стовбурових клітин.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

1. В дисертації наведене теоретичне узагальнення і нове рішення актуальної наукової проблеми, що стосується встановлення оптимальних індукторів остеогенного диференціювання мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин in vitro. Результати проведених досліджень свідчать про доцільність використання методу остеоіндукції, який включає в себе культивування мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин спільно з остеогенно детермінованими клітинами (клітинами окістя) на біоматеріалі „Остеоматрикс”.

2. Виявлено достовірне збільшення кількості клітин на „Остеоматриксі” і колагені І типу, а також проростання клітин в товщу „Остеоматриксу” на глибину до 40-50 мкм. Це свідчить про те, що губчатий і кортикальний демінералізований кістковий матрикс у вигляді біоматеріалу «Остеоматрикс» і колаген І типу мають індуктивні властивості, що сприяють процесам адгезії й проліферації клітин. Клітинні культури при культивуванні на губчато-кортикальних чіпсах «Тутопласт» зберігають свою життєздатність, але проліферації у них в різні строки культивування не відмічається, тобто «Тутопласт» не сприяє процесам проліферації клітин. За результатами забарвлення на лужну фосфатазу «Остеоматрикс» і колаген І типу сприяють остеогенному диференціюванню мезенхімальних стовбурових клітин.

3. При культивуванні клітин на гідроксиапатиті кількість клітин, прикріплених до носія, постійно зменшується протягом всього періоду спостережень. Для зразків склокераміки виявлена відсутність клітинного росту і повна загибель клітин на 7-му добу культивування. Тобто зразки склокераміки та гідроксиапатиту не володіють остеоіндуктивними властивостями в умовах in vitro.

4. Встановлено, що з 7-ї до 14-ї доби спрямованої остеоіндукції кістковими морфогенетичними білками спостерігається підвищення секреції лужної фосфатази мезенхімальними стовбуровими клітинами, після чого відбувається стабілізація синтезу лужної фосфатази на одному рівні. Збільшення вмісту кісткових морфогенетичних білків 2-го чи 4-го типів від 5 до 10 нг/мл дозволяє збільшити ступінь диференціювання, тоді, як збільшення до 15 нг/мл достовірно не відрізняється від 10 нг/мл. Також не виявлено взаємодії кісткових морфогенетичних білків 2-го чи 4-го типів при одночасному їх додаванні.

5. Встановлено, що мезенхімальні стовбурові клітини починають продукувати лужну фосфатазу з 14-ї доби остеоіндукції за допомогою клітин окістя. При додаванні в культуральне середовище кальцитоніну в концентрації, аналогічній концентрації дексаметазону при остеоіндукції in vitro, відмічається більш інтенсивне забарвлення на ЛФ клітин мікс-культури мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин і клітин окістя. Встановлена щільність клітин (4·104 клітин/см2), необхідна для оптимальної остеоіндукції мезенхімальних стовбурових клітин за допомогою клітин окістя.

6. Клітини, отримані в результаті індукції за допомогою кісткових морфогенетичних білків і клітин окістя, характеризуються меншим ентропійним еквівалентом (1,7-2,4 ум. од.) порівняно з клітинами, отриманими при комітуванні за допомогою дексаметазону (3,8±0,11 ум. од.), і на відміну від індукції дексаметазоном, не втрачають проліферативної здатності протягом трьох тижнів остеоіндукції.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Для остеогенного диференціювання мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин in vitro рекомендована остеоіндукція за допомогою клітин окістя.

2. Для оптимальної остеоіндукції мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин за допомогою клітин окістя in vitro рекомендована щільність клітин, яка дорівнює 4·104 клітин/см2.

3. Для покращення остеоіндукції мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин за допомогою клітин окістя in vitro рекомендовано використання кальцитоніну.

4. Для створення трансплантату для заміщення кісткових дефектів рекомендовано використання кістковомозкових мезенхімальних стовбурових клітин, індукованих за допомогою клітин окістя та культивованих на біоматеріалі «Остеоматрикс».

5. Для викладання у вищих навчальних закладах рекомендовано використати отримані в ході виконання дисертаційної роботи результати.

1. Попандопуло А. Г. Використання біоматеріалу „Остеоматрикс” для створення остеопрогеніторного трансплантата / А. Г. Попандопуло, А. В. Оберемко, В. М. Оксимец // Український морфологічний альманах. 2010. - Т. 8, № 3. С. 111-113 (Особисто здобувачем виконані експериментальні дослідження, аналіз отриманих результатів, статистичну обробку матеріалу, формулювання висновків, літературне оформлення).

2. Влияние механизма травмы на состояние периостальных источников репарации / В. Г. Климовицкий, В. М. Оксимец, В. Ю. Черныш, А. Г. Попандопуло, А. В. Оберемко // Травма. 2008. Т. 9, № 4. С. 390-395 (Особисто здобувачем виконано експериментальну частину роботи).

3. Індуктивні властивості різних носіїв культивованих клітинних ліній / В. К. Гринь, В. Н. Казаков, А. Г. Попандопуло, А. В. Оберемко, В. М. Оксимец // Трансплантология. 2008. Т. 10, № 1. С. 96-99 (Особисто здобувачем виконані дослідження з культивування клітин, аналіз отриманих результатів, статистичну обробку матеріалу, формулювання висновків, літературне оформлення).

4. Оберемко А. В. Оценка пролиферативного потенциала мезенхимальных стволовых клеток костного мозга и прогениторных клеток надкостницы / А. В. Оберемко // Вестник неотложной и восстановительной медицины. 2009. Т. 10, № 4. С. 443-445 (Роботу виконано самостійно).

5. Оберемко А. В. Носії мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин для заміщення кісткових дефектів / А. В. Оберемко // Вестник неотложной и восстановительной медицины. 2010. Т. 11, № 2. С. 267-269 (Роботу виконано самостійно).

6. Пат. 46095 Україна, МПК С12N 5/00. Спосіб біологічної стимуляції остеогенного диференціювання мезенхімальних стовбурових клітин / Гринь В. К., Климовицький В. Г., Попандопуло А. Г., Оксимець В. М., Оберемко А. В., Буше В. В., заявник і патентовласник ДУ „ІНВХ ім. В. К. Гусака АМНУ”. заявл. 09.06.09; опубл. 10.12.09, Бюл. № 23 46 (Особисто здобувачем виконані дослідження з культивування та остеогенного диференціювання клітин, формулювання висновків, оформлення патенту).

7. Пат. 45773 Україна, МПК С12N 5/00. Спосіб отримання тримірного остеопрогеніторного трансплантата / Гринь В. К., Климовицький В. Г., Попандопуло А. Г., Оксимець В. М., Оберемко А. В., Буше В. В.; заявник і патентовласник ДУ „ІНВХ ім. В. К. Гусака АМНУ”. заявл. 09.06.09; опубл. 25.11.09, Бюл. № 22 (Особисто здобувачем виконані дослідження з культивування та остеогенного диференціювання клітин, формулювання висновків, оформлення патенту).

8. Попандопуло А. Г. Метод индукции стволовых клеток стромы костного мозга по остеогенному пути / А. Г. Попандопуло, А. В. Оберемко, В. М. Оксимец // Проблемы криобиологии. 2008. Т. 18, № 2. С. 254 (Особисто здобувачем виконано експериментальне дослідження, літературне оформлення).

9. Некоторые аспекты эффективности роллерного культивирования / А. Г. Попандопуло, А. В. Оберемко, В. М. Оксимец, А. А. Штутин // Проблемы криобиологии. 2008. Т. 18, №2, С. 193 (Особисто здобувачем виконані дослідження з культивування клітин, МТТ-аналіз, аналіз отриманих результатів, статистичну обробку матеріалу).

10. Попандопуло А. Г. Направленная биоостеоиндукция мезенхимальных клеток костного мозга / А. Г. Попандопуло, А. В. Оберемко, В. М. Оксимец // Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследдования: Материалы Всероссийской научной школы-конференции для молодежи, 21-26 сентября 2009 г. М., 2009. С. 45-46 (Особисто здобувачем виконані дослідження з культивування та остеогенного диференціювання клітин, аналіз отриманих результатів, статистичну обробку матеріалу, літературне оформлення).

11. Попандопуло А. Использование мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для замещения дефектов костной ткани / А. Попандопуло, А. Оберемко // XIV міжнар. мед. конгрес студентів та молодих вчених, 13-15 квітня 2010 р.: тезисы докл. Тернопіль, 2010. С. 240 (Особисто здобувачем виконано аналіз літератури та отриманих результатів, літературне оформлення статті).

12. Сравнительный анализ функционального состояния остеорепаративных клеточных пулов при механической травме трубчатых костей / А. Г. Попандопуло, В. В. Буше, В. М. Оксимец, А. В. Оберемко // Генетична і регенеративна медицина: проблеми та перспективи: наук.-практ. конф. з між нар. участю, 14-15 жов. 2010 р.: тези доп. К., 2010. С. 152. (Особисто здобувачем виконано аналіз отриманих результатів).

13. Попандопуло А. Г. Дослідження проліферативного потенціалу культивованих клітин / А. Г. Попандопуло, А. В. Оберемко // Молодь - медицині майбутнього: міжнар. наук. конф. студентів та молодих вчених, присвячена 200-річчю з дня народження М. І. Пирогова, 22-23 квітня 2010 р: тези доп. Одеса, 2010. С. 34 (Особисто здобувачем виконано експериментальне дослідження, аналіз літератури та отриманих результатів, літературне оформлення).

14. Биологическая остеогенная индукция мезенхимальных стволовых клеток и создание трехмерного остеопрогениторного трансплантата / В. Г. Климовицкий, В. М. Оксимец, А. Г. Попандопуло, А. В. Оберемко, А. М. Гребенюк, А. Ю. Магомедов, С. А. Винокуров // Сборник научных трудов XV съезда ортопедов-травматологов Украины. 2010. С. 8 (Особисто здобувачем виконані дослідження з культивування та остеогенного диференціювання клітин, аналіз отриманих результатів, статистичну обробку матеріалу).

15. Оберемко А. В. Хімічна та біологічна остеоіндукція мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин in vitro / А. В. Оберемко // Український науково-медичний молодіжний журнал. 2010. Спец. вип. № 4. С. 537 (Роботу виконано самостійно).

16. Інженерінг тривимірної преостеогенної тканини / А. Г. Попандопуло, А. В. Оберемко, В. М. Оксимець, В. В. Буше // Генетична і регенеративна медицина: проблеми та перспективи: наук.-практ. конф. з між нар. участю, 14-15 жов. 2010 р.: тези доп. К., 2010. С. 153 (Особисто здобувачем виконано експериментальну частину роботи, аналіз отриманих результатів і літературних джерел, статистичну обробку матеріалу).

17. Получение остеопрогениторного трансплантата in vitro / А. Г. Попандопуло, В. М. Оксимец, А. В. Оберемко, Ю. А. Магомедов // Актуальне вопросы тканевой и клеточной трансплантологии: IV Всероссийский симпозиум с международным участием, 21-22 апреля 2010 г.: тезисы докл. Санкт-Петербург, 2010. С. 108 (Особисто здобувачем виконано експериментальну частину роботи, аналіз отриманих результатів, статистичну обробку матеріалу).