Ідентифікація особи в судовій медицині на основі ПЛР-аналізу геномної ДНК кісткової тканини - Автореферат

Як правило, більша частина обєктів дослідження має виражені деструктивні зміни внаслідок впливу бактеріальної мікрофлори, а також різних фізичних (висока температура, УФ-опромінення), хімічних (кислоти, луги) факторів, несприятливих умов зовнішнього середовища (вологість, температура, зміна значень РН), через що не може бути використана при дослідженні. Кісткова тканина відносно стійка у зовнішньому середовищі, що визначається її будовою, деполімеризація ДНК в остеоцитах відбувається пізніше, ніж у мяких тканинах і рідинах тіла людини. Дослідження складається з таких етапів: виділення геномної ДНК із біологічного обєкта, ампліфікація і подальший аналіз гіперваріабельних ділянок ДНК, які суто специфічні для кожного індивідуума і можуть служити ознаками, що індивідуалізують особу (Jeffreys Методи виділення геномної ДНК із кісткової тканини описані у деяких вітчизняних і зарубіжних публікаціях, проте у практичному використанні дані методи малоефективні, не дозволяють виділити ДНК для якісного проведення судово-медичного ідентифікаційного дослідження методом ПЛР. Отже, актуальність дисертаційного дослідження зумовлена необхідністю вдосконалення базових методів виділення геномної ДНК із кісткової тканини, зокрема для дослідження обєктів, що піддалися дії агресивних факторів зовнішнього середовища (часових, фізичних), а також необхідною є оптимізація ключових моментів проведення ПЛР, матрицею в якій є ДНК кісткових обєктів у деградованому стані й у незначній кількості.Для виділення ДНК із компактної та губчастої речовин кісткової тканини використовували чотири протоколи: протокол I (автори Новоселов В.П., Шаронова Д.А., 1999), протокол II (Hoss M., Paabo S., 1993), протокол ІІІ (Walsh S. P., Metzger D. A., Higuchi R., 1991), протокол IV (Кривда Г.Ф., Кривда Р.Г., 2005). Для порівняльного аналізу методів виділення ДНК із компактної речовини фрагмента діафіза - обєкт № 1 і губчастої речовини ребра - обєкт № 2 використовували чотири основних протоколи (I, II, III і IV) отримання препаратів ДНК кісткової тканини для ПЛР-типування. При аналізі протоколів для виділення ДНК із кісткової тканини розглядали вплив способів руйнування кісткової тканини, можливості використання мінімальних кількостей досліджуваного матеріалу, визначали оптимальну кількість кісткового порошку, необхідного для аналізу, вивчали вплив температурно-часових параметрів етапу лізису, підбирали кількість протеолітичного ферменту - протеїнази К, розглядали застосування співосаджувачів для преципітації ДНК і методи очищення розчину виділеної ДНК від домішок. Одержані експериментальні результати виявили, що кількість ДНК, виділеної з губчастої речовини ребра (обєкт № 2), у середньому втричі більша, ніж кількість ДНК із компактної речовини діафіза стегнової кістки (обєкт № 1) при використанні будь-якого способу руйнування і протоколу виділення: наприклад, кількість ДНК, виділеної з кісткового порошку обєкта № 2 при використанні дрібного абразиву, дорівнює (4400,0 ± 21,6) нг, а кількість ДНК, виділеної з обєкта № 2, - (1400,00 ± 17,32) нг. 1 і 2, можна зробити висновок, що мінімальна маса наважки кісткового порошку, одержана з компактної речовини кісткової тканини (обєкт № 1), яка дає можливість виділити достатню кількість ДНК, придатної для ПЛР-аналізу за 14 локусами без урахування повторів, при використанні стандартного протоколу І виділення становить 25,0 мг, при використанні протоколів II і IV маса наважки повинна дорівнювати не менше 50,0 мг і при виділенні ДНК за допомогою протоколу III вона становить 75,0 мг.У дисертаційній роботі пропонується і обґрунтовується комплекс нових найбільш ефективних підходів до проведення судово-медичного молекулярно-генетичного ідентифікаційного дослідження, обєктом якого є кісткова тканина різного структурного типу та ступеня збереження. Результати власних досліджень дозволили розробити основні методологічні аспекти проведення судовомедичної ідентифікації особи за допомогою ПЛР-типування ДНК кісткової тканини. До найефективніших модифікованих протоколів виділення ДНК із кісткової тканини різного вигляду і стану належать: протокол I, заснований на застосуванні у складі лізуючого буфера аніонного детергента - додецилсульфату натрію і протеолітичного ферменту - протеїнази К, а також протокол IV - заснований на застосуванні ацетату калію у високій концентрації для очищення від білків і полісахаридів. Використання термостабільної Smart Taq-полімерази зі зростанням її концентрації в реакційній суміші до 0,7-1,0 одиниць активності, а також збільшенням кількості основних циклів ампліфікації до 45 підвищує ефективність ПЛР-аналізу при роботі з деградованими препаратами ДНК, виділеної з кісткової тканини. Розроблені модифіковані методики виділення ДНК з кісткової тканини ексгумованих трупів, а також трупів, що перебували на різній стадії гнильного розкладу, є ефективними для виділення ДНК, придатної для ПЛР-аналізу.

Основний зміст роботи

У дисертаційній роботі пропонується і обґрунтовується комплекс нових найбільш ефективних підходів до проведення судово-медичного молекулярно-генетичного ідентифікаційного дослідження, обєктом якого є кісткова тканина різного структурного типу та ступеня збереження. З результатів виконаної дисертаційної роботи випливають такі висновки: 1. Результати власних досліджень дозволили розробити основні методологічні аспекти проведення судовомедичної ідентифікації особи за допомогою ПЛР-типування ДНК кісткової тканини.

2. На підставі проведеного порівняльного аналізу ефективності основних методів виділення ДНК із нативної кісткової тканини (компактної та губчастої речовини) запропоновані оптимальні модифікації ключових етапів виділення геномної ДНК із кісткової тканини: спосіб руйнування кісткової тканини; співвідношення лізуючого буфера і кісткового порошку; температурно-часові режими проведення етапу лізису; кількість протеолітичного ферменту в лізуючому буфері; застосування співосаджувачів; спосіб очищення ДНК.

3. До найефективніших модифікованих протоколів виділення ДНК із кісткової тканини різного вигляду і стану належать: протокол I, заснований на застосуванні у складі лізуючого буфера аніонного детергента - додецилсульфату натрію і протеолітичного ферменту - протеїнази К, а також протокол IV - заснований на застосуванні ацетату калію у високій концентрації для очищення від білків і полісахаридів.

4. Губчаста речовина кісткової тканини ребра визначена як переважний обєкт для проведення молекулярно-генетичного ідентифікаційного дослідження.

5. Використання термостабільної Smart Taq-полімерази зі зростанням її концентрації в реакційній суміші до 0,7-1,0 одиниць активності, а також збільшенням кількості основних циклів ампліфікації до 45 підвищує ефективність ПЛР-аналізу при роботі з деградованими препаратами ДНК, виділеної з кісткової тканини.

6. Розроблені модифіковані методики виділення ДНК з кісткової тканини ексгумованих трупів, а також трупів, що перебували на різній стадії гнильного розкладу, є ефективними для виділення ДНК, придатної для ПЛР-аналізу.

7. Показана можливість проведення молекулярно-генетичного ідентифікаційного дослідження кісткової тканини, взятої від скелетованих трупів із різною давністю після настання смерті й поховання, зокрема понад 60 років. Для проведення дослідження переважним обєктом є губчаста речовина кісткової тканини епіфізів довгих трубчастих кісток.

8. Кістки, що піддалися дії високих температур (відкритого вогню і виварювання), можуть бути обєктами для проведення молекулярно-генетичного ідентифікаційного аналізу. Використання розроблених модифікованих методик виділення ДНК є ефективним при визначенні статевої належності кісток, спалених до чорного розжарювання. Виділення ДНК за допомогою модифікованих методик дозволяє отримати необхідну кількість якісної ДНК з виварених кісткових обєктів і провести достатньо повне ідентифікаційне дослідження.

9. За результатами досліджень розроблені рекомендації з відбору, підготовки й умов зберігання кісткового біоматеріалу.

10. Результати роботи дозволяють визначити, що головним шляхом оптимізації проведення судовомедичної молекулярно-генетичної ідентифікаційної експертизи кісткових залишків є використання запропонованого алгоритму проведення молекулярно-генетичного дослідження.

Практичні рекомендації

Для проведення судовомедичної молекулярно-генетичної експертизи з метою ідентифікації особи за кістковими залишками необхідно: 1. Від невпізнаних гнильно змінених, ексгумованих і скелетованих трупів відбирати епіфізи довгих трубчастих кісток та ребра.

2. Транспортування доцільно здійснювати в пластиковому маркованому й опечатаному термоконтейнері з льодом при температурі ? 0 °С.

3. Підготовку обєктів до зберігання здійснювати шляхом механічного видалення нашарувань і стерилізації з використанням хлораміну.

4. Біологічний матеріал до початку дослідження зберігати у морозильній камері при температурі -20 °С.

5. Кістковий порошок одержувати за допомогою пилки з металевим полотном, далі розтирати його з абразивом, маса наважки обєктів має становити 25,0 мг.

6. Виділення ДНК слід здійснювати за допомогою модифікованих протоколів І і IV.

7. Кількість виділеної ДНК визначати за допомогою флюориметра.

8. Оцінку якості виділеної ДНК здійснювати шляхом електрофорезу в 1%-му агарозному гелі.

9. Оцінювати придатність ДНК для ПЛР-аналізу слід шляхом типування виділеної ДНК за локусом для визначення статевої належності Amel.

10. Проводити ампліфікацію виділеної ДНК необхідно з використанням наборів реактивів "ТАПОТИЛИ" (Росія) і "Promega Technical Manual" (США) не менш ніж за 14 локусами.

11. Провести порівняльний аналіз отриманих ампліфікованих фрагментів виділеної ДНК і зразків крові за досліджуваними локусами. Сформулювати експертний висновок.

1. Кривда Р.Г. Виділення ДНК із кісткової тканини різного терміну зберігання / Р.Г. Кривда, Г.Ф. Кривда, Ю.М. Сиволап // Одеський медичний журнал. - 2002. - № 5 (73). - С. 20-23. (Особисто здобувач сформулював завдання досліджень і провів експериментальні дослідження.)

2. Кривда Р.Г. Використання аналізу ДНК у судово-медичних експертизах / Н.Е. Кожухова, Г.Ф. Кривда, Р.Г. Кривда, Ю.М. Сиволап, Ю.Ю. Суліма, С.В. Чеботар; за ред. Ю.М. Сиволапа і Г.Ф. Кривди. - Одеса: ОДМУ, 2001. - 92 с. (Особисто здобувач сформулював завдання досліджень і провів обґрунтування виконаних самостійно експериментальних результатів.)

3. Кривда Р.Г. Ідентифікація особи шляхом геномної дактилоскопії

/ Р.Г. Кривда // Вчені майбутнього: міжнар. наук.-практ. конф. молодих вчених, 14-16 жовтня 2003 р., Одеса: тези доп. - Одеса, 2003. - С. 15-16.

4. Кривда Р.Г. Тактика використання спеціальних знань у формі судової експертизи в процесі розслідування і розкриття злочинів / В.О. Комаха, Г.Ф. Кривда, В.В. Антонюк, В.В. Гузенко, В.Я. Гуцул, О.А. Зотаєва, О.Ю. Калиновський, В.В. Комаха, О.В. Комаха, Р.Г. Кривда, М. І. Куруц, О.А. Кулачинський, С.М. Миргородський, Ф.П. Нікітіна, В.В. Попа, А.М.

Соцький, Л.М. Чернобай, П.Г. Шнаревич, І. В. Яковенко; за ред. В.О. Комахи. - Чернівці, 2004. - С. 205-211. (Особисто здобувач теоретично обгрунтував тактику підготовки, вилучення, зберігання біологічного матеріалу та експериментальних зразків для судово-медичного молекулярно-генетичного дослідження.)

5. Кривда Р.Г. Перезахоронение праха светлейшего князя М.С. Воронцова и его супруги княгини Е.К. Воронцовой / Г.Ф. Кривда, Ю.В. Загоруйко, Р.Г. Кривда // Інтегративна антропологія. - 2005. - № 1/2. - С. 64-73. (Особисто здобувач провів експериментальні дослідження.)

6. Кривда Р.Г. Вирішення питання щодо судовомедичної ідентифікації особи при дослідженні скелетованих трупів шляхом проведення молекулярно-генетичного аналізу / Р.Г. Кривда // Український судово-медичний вісник. - 2007. - № 1 (20). - С. 31-34.

7. Кривда Р.Г. Идентификация личности в судебной медицине на основе ПЦР-анализа геномной ДНК костной ткани / Р.Г. Кривда // Международная научно-практическая конференция судебных медиков, посвященная 165-летию кафедры судебной медицины с последипломной подготовкой Одесского государственного медицинского университета и 85-летию основания Одесского областного бюро судебномедицинской экспертизы, Одесса, 7-8 июня 2007 г. - Одесса: Одес. гос. мед. ун-т, 2007. - С. 54-56.

8. Кривда Р.Г. Молекулярно-генетическая идентификация личности скелетированных трупов, обнаруженных в криминальном захоронении

/ Р.Г. Кривда, А.Е. Солоденко // Международная научно-практическая конференция судебных медиков, посвященная 165-летию кафедры судебной медицины с последипломной подготовкой Одесского государственного медицинского университета и 85-летию основания Одесского областного бюро судебномедицинской экспертизы, Одесса, 7-8 июня 2007 г. - Одесса: Одес. гос. мед. ун-т, 2007. - С. 57-59. (Особисто здобувач сформулював завдання досліджень і провів обґрунтування виконаних самостійно експериментальних результатів.)

9. Кривда Р.Г. Ефективність виділення ДНК із кісткової тканини для проведення молекулярно-генетичної ідентифікації особи / Р.Г. Кривда // Зб. наук. праць НМАПО ім. П.Л. Шупика. - К., 2007. - Вип. 16, кн. 1. -

С. 937-946.

10. Кривда Р.Г. Виділення ДНК із кісткової тканини гнильно змінених трупів для молекулярно-генетичної ідентифікації особи в судовій медицині

/ Р.Г. Кривда // Зб. наук. праць співробітників НМАПО ім. П.Л. Шупика. - К., 2007. - Вип. 16, кн. 2. - С. 483-490.

11. Кривда Р.Г. Исследование костных останков князя М.С. Воронцова и его супруги княгини Е.К. Воронцовой / Г.Ф. Кривда, Ю.В. Загоруйко, Р.Г. Кривда // 4-й міжнар. конгр. з інтегративної антропології, Вінниця, 4-5 жовтня 2007 р. : тези доп. - Вінниця, 2007. - С. 64-73. (Особисто здобувач провів експериментальні дослідження.)

12. Кривда Р.Г. Судебномедицинское генотипоскопическое исследование костных останков, подвергшихся воздействию высоких температур

/ Р.Г. Кривда // Вчені майбутнього: наук.-практ. конф. молодих вчених з міжнар. участю, Одеса, 15-16 жовтня 2007 р. - Одеса: Одес. держ. мед. ун-т, 2007. - С. 25-26.

13. Пат. 53564 А Україна МПК 7 : А 61В 5/117. Спосіб ідентифікації особи / Кривда Г.Ф., Сиволап Ю.М., Кривда Р.Г., Кожухова Н.Е. ; заявник і патентовласник Одес. держ. мед. ун-т; заявл. 31.07.2002 ; опубл. 15.01.2003, Бюл. № 1. - 4 с.

14. Пат. 10445 Україна, МПК 7 : А 61В 5/117. Спосіб ідентифікації особи / Кривда Г.Ф., Кривда Р.Г. ; заявник і патентовласник Одес. держ. мед. ун-т. - № u 200504118 ; заявл. 29.04.2005 ; опубл. 15.11.2005, Бюл. № 11. - 4 с.

Размещено на .ru