Дослідження мутантів дріжджів Hansenula polymorpha з пошкодженням метаболізму глюкози. Визначення природи індукованих мутацій. Ідентифікація гену дріжджів, що контролює катаболітну репресію, встановлення його молекулярної структури шляхом клонування.
При низкой оригинальности работы "Ідентифікація гену GCR1, що контролює катаболітну репресію у метилотрофних дріжджів Hansenula polymorpha", Вы можете повысить уникальность этой работы до 80-100%
Основним регуляторним механізмом, що забезпечує адаптацію метаболізму до змін навколишнього середовища у мікроорганізмів, є диференційна регуляція транскрипції генів. Так, наприклад, присутність в середовищі глюкози, яка є “фаворитним” ростовим субстратом для більшості мікроорганізмів, викликає репресію транскрипції декількох груп генів за механізмом, відомим під назвою “катаболітна репресія” (Magasanik, 1969). В той же час, молекулярно-генетичні дослідження інших, так званих неконвенційних видів дріжджів, також розпочали інтенсивно розвиватися, що зумовлено зростанням промислового значення цих організмів. Важливе прикладне та фундаментальне значення має дослідження механізмів катаболітної репресії на моделі метилотрофних дріжджів, здатних засвоювати токсичний метанол як єдине джерело вуглецю та енергії. Встановити, чи повязане пошкодження глюкозної репресії у мутантів з пошкодженням метаболізму глюкози, або її транспорту у клітину.Можна було припустити, що у мутантів, крім АО, буде порушеною катаболітна репресія також інших ферментів, оскільки використаний метод селекції мутантів (метилотрофний ріст в присутності 2-дезоксиглюкози) передбачає функціонування всього метаболічного шляху утилізації метанолу, в тому числі декількох ферментів, що підлягають репресії глюкозою (Sibirny et al., 1988). Виявилось, що мутанти gcr1 виявляли незвичайні властивості - рівень активності АО в клітинах мутантів, вирощених до середини експоненційної фази росту на середовищі з глюкозою, був у них навіть вищим, ніж в середовищі з метанолом. Було висловлене припущення, що мутації, які пошкоджують катаболітну репресію у мутантів, можуть бути повязані з одним із ферментів, що беруть участь в метаболізмі глюкози, і, як наслідок, призводити до сповільнення утилізації глюкози з середовища. Однак нами не було виявлено суттєвих відмінностей у питомих активностях ферментів метаболізму глюкози: гексокінази, фосфоглюкоізомерази, фосфофруктокінази (ферменти гліколізу) і глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (фермент пентозофосфатного циклу) у мутантів, вирощених в середовищі з глюкозою порівняно зі штамом дикого типу. Хоча активності ключових ферментів утилізації глюкози у мутантів не є зміненими, внутрішньоклітинні пули інтермедіатів гліколізу - глюкозо-6-фосфату, фруктозо-6-фосфату, фруктозо-1,6-бісфосфату та дигідроксиацетонфосфату у мутантів є зниженими при рості на глюкозі порівняно зі штамом дикого типу.В результаті виконаної роботи ідентифіковано ген GCR1, що контролює глюкозну катаболітну репресію транскрипції генів у дріжджів H. polymorpha. Встановлено, що мутації у цьому гені, що кодує імовірний білок-сенсор глюкози, призводять до плейотропного фенотипу та глобальних змін у фізіології дріжджової клітини та регуляції гомеостазу органел пероксисом. Методом функціональної комплементації клоновано ген H. polymorpha GCR1, перший відомий у цього виду ген, що контролює катаболітну репресію і кодує білок, гомологічний до сенсорів та транспортерів глюкози з інших видів дріжджів та грибів. Встановлено, що мутації у гені GCR1 призводять до плейотропного фенотипу, що включає пошкодження катаболітної репресії синтезу ряду ферментів, репресії біогенезу пероксисом та пошкодження транспорту глюкози. Висунуто гіпотезу, що білок Gcr1 є мембранним сенсором глюкози, який бере участь у перших етапах сигнального механізму катаболітної репресії у H. polymorpha.
План
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ
Вывод
В результаті виконаної роботи ідентифіковано ген GCR1, що контролює глюкозну катаболітну репресію транскрипції генів у дріжджів H. polymorpha. Встановлено, що мутації у цьому гені, що кодує імовірний білок-сенсор глюкози, призводять до плейотропного фенотипу та глобальних змін у фізіології дріжджової клітини та регуляції гомеостазу органел пероксисом.
Проведено генетичний, біохімічний та ультраструктурний аналіз мутантів метилотрофних дріжджів H. polymorpha з пошкодженою глюкозною катаболітною репресією.
Методом функціональної комплементації клоновано ген H. polymorpha GCR1, перший відомий у цього виду ген, що контролює катаболітну репресію і кодує білок, гомологічний до сенсорів та транспортерів глюкози з інших видів дріжджів та грибів.
Ідентифіковано точкову мутацію у гені GCR1, що пошкоджує його функцію в індукованого мутанта gcr1-2. Відповідна транзиція С - Т призводить до заміни консервативного амінокислотного залишку серину (S85) на фенілаланін у другому імовірному трансмембранному сегменті білка.
Сконструйовано та охарактеризовано мутантний штам з делецією гену GCR1, gcr1D.
Встановлено, що мутації у гені GCR1 призводять до плейотропного фенотипу, що включає пошкодження катаболітної репресії синтезу ряду ферментів, репресії біогенезу пероксисом та пошкодження транспорту глюкози.
Встановлено, що для таких вуглецевих субстратів як етанол, сахароза та мальтоза у H. polymorpha існує GCR1-незалежний механізм катаболітної репресії.
Висунуто гіпотезу, що білок Gcr1 є мембранним сенсором глюкози, який бере участь у перших етапах сигнального механізму катаболітної репресії у H. polymorpha.
ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
4. O.V. Stasyk, O.G. Stasyk, J. Komduur, M. Veenhuis, J.M. Cregg, A.A. Sibirny. A hexose transporter homologue controls glucose repression in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha // J. Biol. Chem. - 2004. - V.279, N 9. - P. 8116-8125.
5. O.V. Stasyk, A.V. Petryshyn, A.A. Sibirny. Impairment of glucose uptake as a possible cause of catabolite repression deficiency in mutants of methylotrophic yeast Hansenula polymorpha. Abstract of XII Small Meeting on Yeast Transport and Energetics (SMYTE-XII) - Karpach, Poland, 1994. - Folia microbiologica. - 1994. -V39 - P.545-546.
6. O.V. Stasyk, A.R. Kulachkovsky, J.M. Cregg, A.A. Sibirny. The Hansenula polymorpha GCR1 gene encodes a hexose transporter involved in catabolite repression // Abstract of XIX International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology. - Rimini, Italy, 1999. - Current Genetics. - 1999. -V35,N3-4 - P.455.
7. O.V. Stasyk, O.M. Moroz, M.M. Maidan, O.G. Stasyk, A.R. Kulachkovsky, M.V. Gonchar, J.M. Cregg, A.A. Sibirny. Mutants of the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha deficient in glucose repression as hosts for production of alcohol oxidase and heterologous proteins // Abstracts of X International Symposium on Yeasts. - Arnhem, The Netherlands. - 2000. - P.159.
8. O.V. Stasyk, A.R. Kulachkovsky, O.G. Stasyk, M. Veenhuis, J.M. Cregg, A.A. Sibirny. Hexose transporter/sensor homologue is involved in catabolite repression of peroxisome biogenesis in Hansenula polymorpha // Abstracts of XXI Specialized Symposium on Yeasts. - Lviv, Ukraine. - 2001. - P.21.
9. O.V. Stasyk, O.M. Moroz, M.M. Maidan, O.G. Stasyk, A.R. Kulachkovsky, M.V. Gonchar, J.M. Cregg, A.A. Sibirny. Mutants of the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha as hosts for production of alcohol oxidase and heterologous proteins // Abstracts of Bio-Forum II. - Lodz, Poland. - 2001. - P.96.
10. O.V. Stasyk, A.R. Kulachkovsky, J.M. Cregg, A.A. Sibirny. Glucose repression in Hansenula polymorpha is controlled by the hexose transporter homologue // Abstracts of Conference for students, PHD students and young scientists on Molecular Biology and Genetics. - Kyiv, Ukraine. -2001. - P.21.
11. O.V. Stasyk. Glucose repression in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha is controlled by hexose transporter homologue // Abstracts of International Summer School “From Genome to Life” (Structural, Functional and Evolutionary approaches). - Cargese, France. - 2002. - P.53.
12. O.V. Stasyk, O.G. Stasyk, J. Komduur, M. Veenhuis, J.M. Cregg, A.A. Sibirny. Signalling for glucose repression in methylotrophic yeast Hansenula polymorpha involves hexose transporter/sensor homologue // Abstracts of First Ukrainian Congress for Cell Biology. - Lviv, Ukraine. -2004. - P.15.
Вы можете ЗАГРУЗИТЬ и ПОВЫСИТЬ уникальность своей работы
