Біоінформатичний пошук та дослідження висококонсервативних генів основних антигенів M. hyopneumoniae. Епізоотологічний моніторинг свинарських господарств України з метою виявлення таких, у яких циркулює M. hyopneumoniae. Виділення польових ізолятів гена.
Отже, розробка нових високоспецифічних засобів діагностики ЕПС на основі полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) та імуноферментного аналізу (ELISA) з використанням рекомбінантних антигенів набули особливого значення в усьому світі, адже вони дозволяють заощадити час і кошти в процесі виявлення мікоплазманосіїв. Розвиток новітніх технологій на основі молекулярно-генетичних методів відкриває нові перспективи щодо діагностики ЕПС, зокрема детекції мікоплазм і диференціації їх від інших збудників респіраторних хвороб свиней, проведення генотипування польових ізолятів і молекулярно-епізоотологічного моніторингу (Bousguet E. et al., 1998; Futo S. et al., 1995). Вищевикладене дає підставу визнати проведення детального епізоотологічного моніторингу щодо поширення ЕПС, визначення генетичної варіабельності штамів M. hyopneumoniae, виділених на території України, дослідження щодо філогенетичних взаємозвязків з метою розробки ефективних систем виявлення хворих тварин і вдосконалення методів діагностики із застосуванням нових діагностичних препаратів і технологій на основі ELISA з рекомбінантними антигенами та ПЛР актуальними завданнями, виконання яких сприятиме встановленню ефективного контролю розповсюдження цієї інфекції. Дисертаційна робота виконувалася впродовж 2004-2010 рр. згідно з тематичними планами наукових досліджень ННЦ "ІЕКВМ", затвердженими Національною академією аграрних наук України, за завданнями 04.04 "Розробити тест-системи для детекції збудників інфекційних захворювань за допомогою полімеразної ланцюгової реакції" (№ держреєстрації 0101U001616, 2004-2005 рр.) та 37.03-004.01 "Провести дослідження господарств України щодо інфекційних пневмоній свиней мікоплазменної етіології та розробити систему контролю мікоплазмозу свиней" (№ держреєстрації 0107U003197, 2006-2010 рр.). Розроблено та впроваджено у лабораторну практику спосіб виявлення ДНК M. hyopneumoniae за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (деклараційний патент України на корисну модель №31897, 2008 р.) та спосіб отримання трансформованої культури E. coli штаму DH?5F’, яка є носієм генів mhp366 та mhp377 та продукує рекомбінантний протеїн збудника ензоотичної пневмонії свиней (деклараційний патент України на корисну модель №32904, 2008 р.).За допомогою біоінформатичного аналізу повного геному референтного штаму M. hyopneumoniae для подальших досліджень було обрано 35 генів, які ймовірно кодують поверхневі ліпопротеїни. За результатами цих досліджень було обрано 105 амінокислотних послідовностей та за допомогою SPOT-технології сформовано панель синтетичних поліпептидів у трьох повтореннях 15-вимірних ланцюжків з кроком 3 а. з. на нітроцелюлозній мембрані. Отримані протеїни використовували в якості антигену в непрямому варіанті ІФА з сироватками крові свиней-реконвалесцентів та гіперімунними сироватками крові свиней, а також поліклональними сироватками крові кроликів, що містили антитіла до M. hyorhinis BTS-7, M. hyosynoviae S-16 і M. flocculare MS42. У результаті проведеної перевірки найвищі показники оптичної щільності (OD) були отримані за розведення 1:100 сироваток крові хворих на ЕПС свиней (2,0385 ± 0,0112 - GST-Mhp366, 2,2922 ± 0,0124 - GST-Mhp377), у той час як гіперімунні сироватки мали значно меншу активність з отриманими химерними протеїнами (1,2379 ± 0,0131 - GST-Mhp366, 1,4571 ± 0,0111 - GST-Mhp377). У реакції з сироватками крові кроликів, що містили антитіла до M. hyopneumoniae, було отримано високі показники оптичної щільності (2,9448 ± 0,0124 - GST-Mhp366; 3,2813 ± 0,0298 - GST-Mhp377).У дисертаційній роботі на підставі проведеного комплексу клініко-епізоотологічних, патологоанатомічних, бактеріологічних, серологічних, молекулярно-генетичних та математико-біостатистичного аналізу вивчено епізоотичну ситуацію щодо ЕПС в Україні, визначено етіологічну роль M. hyopneumoniae у виникненні та поширенні ензоотичної пневмонії свиней та удосконалено систему її лабораторної діагностики за рахунок впровадження методології на основі полімеразної ланцюгової реакції. Розроблено систему отримання синтетичних генів M. hyopneumoniae, що складається з напрацювання девяти ділянок фрагментів mhp366 та mhp377 довжиною від 152 до 891 п. н., які запобігають перериванню транскрипції, їх ампліфікації у клітинах E. coli, послідовного злиття у складі експресуючих плазмід PGEX5x3 та реклонування. Очищені за методом GST-залежної афінної хроматографії препаративні форми протеїнів GST-Mhp366 та GST-Mhp377 з концентрацією білка 0,28 і 0,3 мг/см3, індукованих в експресуючих клітинах E. coli, характеризуються високою імунореактивністю та специфічністю по відношенню до антитіл проти M. hyopneumoniae, які виявляються шляхом імуноблотингу та ELISA. Розроблена методика виявлення ДНК M. hyopneumoniae з використанням праймерів OMHP366A/B/H на основі утворених ампліконів розміром 1699 ± 20 та 790 ± 20 п. н. дозволяє виявляти 90-100 мікробних клітин M. hyopneumoniae (100 фг/мкл ДНК) за гніздової ПЛР або 8,3?103 клітин (0,8-10 пг/мкл ДНК) з
Вывод
Отримання рекомбінантних протеїнів M. hyopneumoniae. За допомогою біоінформатичного аналізу повного геному референтного штаму M. hyopneumoniae для подальших досліджень було обрано 35 генів, які ймовірно кодують поверхневі ліпопротеїни. Компютерний аналіз первинної та вторинної структури білків, що кодуються обраними генами, дозволив виявити три найбільш імовірні області формування локусів антигенних детермінант. За результатами цих досліджень було обрано 105 амінокислотних послідовностей та за допомогою SPOT-технології сформовано панель синтетичних поліпептидів у трьох повтореннях 15-вимірних ланцюжків з кроком 3 а. з. на нітроцелюлозній мембрані.
За допомогою сироватки крові свиней-реконвалесцентів установлено високу антигенну активність епітопу з протеїну Mhp366, проте реактивності по відношенню до гіперімунної сироватки крові не виявлено. Для більш поглибленого вивчення цього антигену необхідно було отримати його повний синтетичний аналог у формі фюжн-протеїну.
Аналіз даних літератури показав, що серед усіх неохарактеризованих ліпопротеїнів мембрани M. hyopneumoniae найбільш перспективним прототипом був Mhp377. Тому наша увага була приділена отриманню рекомбінантного протеїну на основі цього білка.
Розраховані системи праймерів, що містили сайти ендонуклеаз та змінені кодони TGA, дозволили напрацювати ділянки генів mhp366 довжиною 802, 152, 345, 402 п. н. і mhp377 - 891, 192, 266, 299, 453 п. н., які вбудовували до експресійного вектора PGEX5x3. Таким чином було сконструйовано дві експресуючі плазміди PMHP366-500 та PMHP377-500 довжиною 6 570 п. н. та 6 926 п. н. відповідно (рис. 1). Отриманими плазмідами проводили трансформацію хімічно-компетентних клітин E. coli з наступним відбором клонів за допомогою ампіцилінової селекції. У результаті серії проведених досліджень встановлено, що найбільший вихід білка (до 15 мг/дм3 культури) можна отримати за культивування бактеріальної маси впродовж 3 годин та додавання 1 ММ ІПТГ з метою індукції експресії цільових плазмід у клітинах E. coli. ген свинарський hyopneumoniae ізолят
Рис. 1. Карти сконструйованих експресійних векторів PMHP366-500 і PMHP377-500, у складі яких показані ділянки генів mhp366 і mhp377 M. hyopneumoniae референтного штаму 232.
Після проведення очищення (ефективність складала 97%) концентрація препаративної форми білків GST-Mhp366 та GST-Mhp377 складала 0,28 та 0,3 мг/см3 відповідно.
Визначення рекомбінантних протеїнів. Отримані протеїни використовували в якості антигену в непрямому варіанті ІФА з сироватками крові свиней-реконвалесцентів та гіперімунними сироватками крові свиней, а також поліклональними сироватками крові кроликів, що містили антитіла до M. hyorhinis BTS-7, M. hyosynoviae S-16 і M. flocculare MS42. У результаті проведеної перевірки найвищі показники оптичної щільності (OD) були отримані за розведення 1:100 сироваток крові хворих на ЕПС свиней (2,0385 ± 0,0112 - GST-Mhp366, 2,2922 ± 0,0124 - GST-Mhp377), у той час як гіперімунні сироватки мали значно меншу активність з отриманими химерними протеїнами (1,2379 ± 0,0131 - GST-Mhp366, 1,4571 ± 0,0111 - GST-Mhp377).
У реакції з сироватками крові кроликів, що містили антитіла до M. hyopneumoniae, було отримано високі показники оптичної щільності (2,9448 ± 0,0124 - GST-Mhp366; 3,2813 ± 0,0298 - GST-Mhp377). Поряд з цим при перехресній реакції для сироваток крові кроликів з антитілами проти M. hyorhinis показники становили 0,4021 ± 0,0141 - GST-Mhp366 і 1,3614 ± 0,0131 - GST-Mhp377, проти M. flocculare - 0,7767 ± 0,0128 - GST-Mhp366 і 1,1217 ± 0,0114 - GST-Mhp377, а проти M. hyosynoviae - 0,615 ± 0,0127 - GST-Mhp366 і 0,7828 ± 0,0121 - GST-Mhp377, що свідчило про високу специфічність химерних протеїнів. Крім зазначеного, отриманий протокол був порівняний за показниками чутливості та специфічності з комерційним набором "IDEXX HERDCHEK M. hyopneumoniae" (табл. 1).
Таблиця 1
Результати ELISA рекомбінантних протеїнів, застосованих у якості антигену у порівнянні з комерційною тест-системою фірми "IDEXX" (M ± m)
Поряд із високим показником оптичної щільності в реакції з сироватками кроликів з антитілами проти M. hyopneumoniae (3,1236 ± 0,0341) було отримано високі показники також по відношенню до інших видів мікоплазм, зокрема до M. flocculare (2,4767 ± 0,0246) та M. hyorhinis (1,4921 ± 0,0369).
Розробка методики виявлення ДНК M. hyopneumoniae. З метою створення методики видоспецифічного виявлення ДНК M. hyopneumoniae на основі напівгніздової ПЛР нами були використані олігонуклеотиди OMHP366B та OMHP366Н (прямі), а також OMHP366A (зворотний), попередньо розраховані з метою клонування ділянки гена mhp366. Ці олігонуклеотиди фланкували фрагмент розміром 1 699 п. н. на першому етапі та 802 п. н. - на другому за умов гібридизації ДНК, виділеної з M. hyopneumoniae 232. З огляду на наявність у складі цього фрагмента варіабельної ділянки розмір амплікону складав 1 699 ± 20 та 790 ± 20 п. н. у залежності від ізоляту.
Отримані дані теоретичного аналізу системи праймерів OMHP366A/B/H шляхом порівняння їх послідовностей за алгоритмами BLAST та FASTA показали відсутність комплементарності до послідовностей ДНК інших бактерій, вірусів або еукаріот. Під час розробки методики виявлення ДНК збудника ЕПС необхідно було провести оптимізацію реакції за ряду параметрів, що включали температурні режими, кількість циклів, концентрації праймерів та іонів магнію. За результатами цих тестувань було встановлено, що за температури відпалу в межах від 47 до 50°C поряд зі специфічним ампліконом зявляються неспецифічні за розміром смуги, що свідчать про димерізацію праймерів, а в інтервалі температур від 59 до 62°C монофрагмент специфічного розміру взагалі не ампліфікується.
Було підібрано оптимальний склад реакційної суміші, який за обєму в 25 мкл містив 2,5 мкл десятикратного ПЛР-буфера (з 1,5 ММ MGCL2), 2,5 ОД Taq-ДНК-полімерази - 0,7 мкл, по 1 мкл кожного праймера OMHP366A/B/Н (з концентрацією 20 ПМ/мкл), 2 мкл розчину DNTP (по 2,5 ММ/мкл кожного), 4 мкл розчину досліджуваної проби сумарної ДНК та 13,8 мкл деіонізованої води. Оптимальний протокол ампліфікації при цьому включав 35 (для напігніздового варіанта у двох раундах) та 40 ампліфікаційних циклів (класичний варіант), кожний з яких складався з денатурації за температури 94°C впродовж 30 с, відпалу праймерів за температури 55°C - 30 с та елонгації за температури 72°C - 60 с. У результаті оцінки чутливості запропонованої методики зясовано, що поріг детекції її складає 100 фг/мкл або 90-100 мікробних клітин (напігніздовий варіант) або 0,8-10 пг/мкл ДНК, що приблизно дорівнює 8,3?103 клітинам M. hyopneumoniae (класична ПЛР). В якості позитивного контролю нами запропоновано плазмідну ДНК PMHP366-500, сконструйовану на попередніх етапах досліджень.
Розроблена методика увійшла до рекомендацій щодо виявлення M. hyopneumoniae, M. hyorhinis, A. pleuropneumoniae, H. parasuis, B. bronchiseptica, P. multocida та S. suis за допомогою ПЛР.
На основі розробленої методики була створена діагностична тест-система "SUIDNATEST-M. hyo" (ТУ У 24.4-00497087-110:2010), яка успішно пройшла міжлабораторні тестування та застосовується у моніторингових дослідженнях за господарчими договорами. На відміну від існуючих закордонних аналогів запропонована тест-система показала високі відсотки чутливості (до 95%) та специфічності (до 100%).
Моніторингові дослідження щодо виявлення хворих на ЕПС свиней в свиногосподарствах України. Наступні наші дослідження були спрямовані на виявлення ДНК M. hyopneumoniae за допомогою розробленої тест-системи у зразках клінічного матеріалу від хворих або загиблих тварин. Було досліджено 422 зразки клінічного матеріалу від свиней з респіраторною патологією та різним ступенем ураженості, що належали 68 господарствам з різних регіонів України (табл. 2).
Таблиця 2
Результати епізоотологічного моніторингу щодо ЕПС у 2005-2010 рр.
Область Кількість обстежених господарств / кількість господарств, в яких виявлено М. hyopneumoniae Кількість досліджених свиней/ виявлено ДНК М. hyopneumoniae Захворюваність, %
Харківська 23 /12 109 / 49 20-80
Дніпропетровська 6 / 3 69 / 16 40-60
Донецька 6 / 2 45 / 13 12-40
Полтавська 6 / 3 40 / 20 20-40
Луганська 3 / 1 26 / 3 до 30
Чернігівська 3 / 2 22 / 7 до 40
Інші області (11) 21/ 14 111 / 52 20-60
Разом 68/37 422/160 у середньому 40
З метою порівняння діагностичної чутливості розробленої методики виявлення ДНК збудника ЕПС та комерційної ELISA тест-системи "IDEXX HERDCHECK M. hyopneumoniae CHEKIT" фірми "IDEXX" (США) при мікоплазмозі свиней були досліджені зразки сироваток крові ремонтних свинок віком 4-5 місяців, свиней на відгодівлі віком до 6 місяців та основних свиноматок, отриманих з НВП "Олімпекс-Агро" (Дніпропетровська обл.), філіалу "Єленовський" ТОВ "Агротіс" (Донецька обл.), двох приватних свиногосподарств (Херсонська обл.) й учбового господарства "Прогрес" Харківської державної зооветеринарної академії (Харківська обл.) на наявність антитіл до M. hyopneumoniae, а також від цих тварин відбирали носові змиви з метою виявлення ДНК збудника ЕПС. Усього було досліджено матеріал від 91 тварини без клінічних ознак хвороби.
У результаті тестування зразків сироваток крові було встановлено, що 53 (58%) з них мали антитіла до M. hyopneumoniae (значення S/P дорівнювало в різних пробах 0,8-1,3), що свідчило про мікоплазманосійство. У той же час за допомогою нашої методики ДНК мікоплазм було виявлено у 60 зразках (65%) (табл. 3).
Зважаючи на відсутність антитіл у частини свиней, можна припустити, що інфекція була на ранніх стадіях, або індукція гуморального імунітету не відбувалась за рахунок імуносупресивного впливу інших збудників, наприклад, цирковірусу свиней другого серотипу (ЦВС-ІІ). З метою виявлення чинників, що ускладнюють перебіг ЕПС, нами були проведені додаткові дослідження клінічного матеріалу щодо наявності ДНК ЦВС-ІІ. У 34 з 91 зразка крові виявляли ДНК цирковірусів ІІ-го серотипу, що складало 37% досліджуваних тварин. Завдяки ранньому виявленню мікоплазманосіїв у зазначених господарствах було розпочато своєчасну терапію, що в свою чергу дозволило ефективно локалізувати захворювання.
Таблиця 3
Результати дослідження зразків клінічного матеріалу щодо ЕПС за ELISA та ПЛР (n = 91)
Вікові групи тварин Кількість обстежених тварин З них позитивних у ELISA/ПЛР
Основні свиноматки 39 28/30
Ремонтні свинки віком 4-5 місяців 29 14/19
Поросята на відгодівлі віком до 6 місяців 23 11/11
Розлади респіраторного апарату у свиней різних статевовікових груп відмічали у 52% дослідженого поголівя. За допомогою загальнородової детекції установлено наявність генетичного матеріалу представників класу Mollicutes у 46% зразках. У результаті проведення ідентифікації виявляли M. hyopneumoniae в 35% від загальної кількості досліджених зразків клінічного матеріалу. Крім цього, 123 зразки додатково були досліджені щодо наявності вірусів РРСС та ЦВС2. У 4% зразків виявляли тільки ДНК M. hyopneumoniae. У більшості випадків мікоплазмози перебігали в асоціації з ЦВС-інфекцією (13%) та РРСС (близько 11%). У 8% досліджених зразків виявляли генетичний матеріал вірусів РРСС і цирковірусів, а також M. hyopneumoniae. У негативних щодо мікоплазм зразках реєстрували РНК вірусу РРСС у 26%, ДНК цирковірусів - у 23% та асоціацію двох вказаних збудників - у 15% досліджених зразків (рис. 2).
Філогенетичні дослідження ізолятів M. hyopneumoniae. З огляду на встановлені нами можливості застосування антигенних детермінант протеїну Mhp366 з метою диференціації інфікованих і вакцинованих тварин нами було проведено детальне дослідження щодо виявлення замін у варіабельній ділянці гена mhp366 різних ізолятів M. hyopneumoniae, виділених у різних географічних регіонах. Для вирішення цієї задачі були досліджені екстракти ДНК з розплодок 17 ізолятів M. hyopneumoniae, які циркулювали на території Данії (n = 11), України (n = 3), Бельгії (n = 2) і Німеччини (n = 1). На підставі результатів попередніх досліджень нами було проведено ПЛР з праймерами OMHP366A та OMHP366B, що фланкують варіабельну ділянку довжиною 790 ± 20 п. н., для подальшого секвенування. Користуючись триплетним кодом, з отриманих нуклеотидних послідовностей отримували амінокислотні ланцюги, які потім вирівнювали за допомогою компютерної програми BIOEDIT.
Множинне вирівнювання амінокислотних послідовностей продемонструвало тільки дві заміни у позиціях 75 (N/K) та 82 (N/D) відповідно, що підтвердило високу консервативність областей, які кодували імуногенні епітопи. За результатами проведених досліджень установлено, що VNTR-ділянка була представлена в усіх зразках.
Кількість тандемних повторень варіювала від 3 до 5, причому, більшість послідовностей містила по 4 копії, які відповідали амінокислотним послідовностям [KR] TE. Секвеновані фрагменти гена mhp366 ізолятів VB-1A, VB-2A, VB-3A M. hyopneumoniae, що циркулювали в обстежених господарствах України, виявились ідентичними. В аналізованих послідовностях протеїну Mhp366 українських ізолятів було виявлено 6 амінокислотних замін у порівнянні з референтним штамом M. hyopneumoniae 232, протеїн якого використовували як матрицю вирівнювання.
За результатами філогенетичного аналізу отриманих послідовностей було побудовано дендрограму (рис. 3), яка показала наявність двох основних гілок. До першої гілки входило 2 кластери, перший з яких був сформованим з двох підкластерів. Ця група послідовностей включала 10 ізолятів, виділених від свиней в Данії, з невеликим відсотком дивергенції у середині групи - 2,2%.
Другий підкластер містив послідовності місцевих ізолятів M. hyopneumoniae з показником числового індексу гілкування (BOOTSTRAP) 81. При цьому кількість відмінностей нуклеотидних послідовностей з референтним штамом 232 складала 11,8%, а найвищі рівні дивергенції спостерігали по відношенню до штамів 7448, 3873, B2V2W20 та Oef91 - 14,3%. До другого кластера увійшли референтний штам J, датський штам Мр47, а також бразильські PMS і 7442. Ця група мала показник числового індексу гілкування (BOOTSTRAP) від 51 до 62, дивергенція всередині групи складала 2,2%.
Друга основна гілка була сформована двома кластерами, перший з яких містив референтний штам 233, що демонстрував 11,8% відмінностей за аналізованою областю в порівнянні з другим кластером. Ця група включала штами, ідентифіковані в Бельгії та Німеччині, а також штам 7448, виділений у Бразилії. Зазначений кластер мав найвищий показник числового індексу гілкування (BOOTSTRAP) - 88, що свідчило про достовірність отриманих результатів.
Проведені філогенетичні дослідження протеїну Mhp366 збудника ЕПС показали, по-перше, наявність цього протеїну в усіх досліджених ізолятах з різних географічних районів Європи. По-друге, отримані дані показали широкий діапазон замін амінокислотних залишків у межах протеїну Mhp366 у залежності від географічного походження ізолятів M. hyopneumoniae. Проведений аналіз дозволив визначити кореляцію послідовностей протеїну Mhp366 місцевих ізолятів з відповідними послідовностями інших ізолятів.
Рис. 3. Філогенетичні звязки між штамами та ізолятами M. hyopneumoniae (Neighbor Joining, Bootstrap = 1000, ізоляти, виділені в Україні, позначені кругом).
Обрана ділянка протеїну Mhp366 є досить варіабельним та формує декілька генетичних груп (кластерів). Досліджені ізоляти M. hyopneumoniae виявилися ідентичними та належали до одного кластеру. Однак, з огляду на розташування інших ізолятів у межах дендрограми у даному випадку генетичне різноманіття не було опосередковане ареалом збудника ЕПС. Філогенетична спорідненість польових ізолятів, які були виділені на території Харківської області, скоріш за все, повязана із занесенням інфекції у результаті переміщення племінних тварин-мікоплазмоносіїв у свинарських господарствах.
Вы можете ЗАГРУЗИТЬ и ПОВЫСИТЬ уникальность своей работы
