Биотехнологический способ получения меченого стабильными изотопами липид-транспортирующего белка чечевицы (Lens culinaris) - Дипломная работа

Растительные липид-транспортирующие белки (LTP) широко распространены в белковых профилях растений, и, как полагают, играют важную роль в выживании многих видов. LTP из различных видов растений разделяют структурное сходство и высоко консервативные мотивы, которые распознаваясь клетками иммунной системы организма обуславливают развитие симптомов аллергических заболеваний. Ранее в Учебно-научном центре ИБХ РАН из семян чечевицы обыкновенной Lens culinaris был выделен белок Lc-LTP2, относящийся к первому подклассу липид-транспортирующих белков, аминокислотная последовательность и структура кДНК, которого уже установлены. Помимо того, для проведения дальнейших структурно-функциональных исследований на основе плазмид pET и штамма Escherichia coli BL21(DE3) была разработана система для гетерологической экспрессии Lc-LTP2 в виде гибридной конструкции с тиоредоксином А и октагистидиновой последовательностью. Для дальнейших исследований структуры Lc-LTP2 и установления изотопной чистоты полученного препарата методами гетероядерной ЯМР-спектроскопии и автоматического микросеквенирования по методу Эдмана требовалось получить меченный стабильными изотопами 13C15N-Lc-LTP2. Цель дипломной работы: явилась разработка биотехнологического способа получения рекомбинантного липид-транспортирующего белка чечевицы Lc-LTP2, тотально меченного стабильными изотопами 13C и 15N, основанного на его гетерологической экспрессии в клетках E. coli. Для этого были осуществлены следующие задачи: 1) Подбор оптимальных условий экспрессии 13C15N-меченного рекомбинантного аналога Lc-LTP2 в клетках E. coli, трансформированных плазмидой pET-His8-TrxL-Lc-LTP2; 2) Установление идентичности очищенного рекомбинантного 13C15N-меченного Lc-LTP2 природному белку. ЛИПИД-ТРАНСПОРТИРУЮЩИЕ БЕЛКИ РАСТЕНИЙ В ДИАГНОСТИКЕ И ТЕРАПИИ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 1.1 Cтруктурно-биохимические черты и биологические функции LTP растений Неспецифические липид-танспортирующие белки (nsLTPs) - небольшие, основные белки, которые широко представлены в белковых профилях различных представителей высших растений. Тем не менее, описанное в ряде экспериментов, исследование белковых профилей различных тканей растений, свидетельствует о локализации nsLTPs в таких гистологических структурах, как ксилема, луб, устьица и трихомы, что может привести к обнаружению совершенно непредсказуемых функций nsLTPs. 1.2 LTP как потенциальные инициаторы аллергии Аллергены - вещества, в основном белки, с молекулярной массой от 5 до 100 кДа, или низкомолекулярные соединения, гаптены, которые при первом поступлении в организм, предрасположенный к развитию аллергии, вызывают сенсибилизацию, то есть образование специфических IgE-антител, а при последующих - развитие симптомов аллергических заболеваний. Подобные аллергены были изолированы из персика (Prunus persica) и яблок (Malus domestica) и обозначены как Pru p 3 и Mal d 3, соответственно. Всего на сегодняшний день обнаружено не менее 35 видов LTPs изолированных из растений, употребляемых в пищу. Например, Art v 3 из полыни обыкновенной, Ole e 7 из оливы европейской и из арабидопсиса (Arabidopsis thaliana), обладают 30-55% гомологией аминокислотной последовательности с некоторыми LTP1 из растительной пищи. Благодаря компактности фолда и высокой стабильности архитектуры молекулы LTP, за счёт наличия четырёх дисульфидных связей, образованных остатками цистеина, данные белки не утрачивают целостность и нативную конформацию, как при термической обработке, так и в деструктурирующих кислотно-ферментативных условиях желудочного сока, а, следовательно, сохраняется их активность и потенциальная аллергенность даже в процессе пищеварения [22]. В результате nsLTPs, будучи классическими пищевыми аллергенами I класса, могут потенциально могут являться причной симптомов орального аллергического синдрома - ОАС (Oral Allergic Syndrome, OAS), характеризующегося возникновением зуда и отечности в орофарингеальной области, умеренных аллергических реакций, таких как контактная крапивница и ангиоидема, а также симптомов тяжёлых системных реакций, таких как анафилаксия [23]. 1.2.1 Место LTP растений в классификации аллергенов В зависимости от потенциальной антител-связывающей способности выделяют мажорные аллергены, способные связывать около 50% антител (IgE) в сыворотке крови больного, и минорные, связывающие около 10% антител в сыворотке больного, имеющего сенсибилизацию к данному аллергену. Общепринятым вариантом классификации белков-аллергенов растений стала наиболее очевидная система, предложенная Международным союзом иммунологических обществ Подкомитета номенклатуры аллергенов ( Данная классификация аллергенов основана на основе гомологии аминокислотной последовательности выделенных белков с известными аллергенами и на их функциональном сходстве. В недавнем исследовании было проанализировано влияние аллергена персика Pru p 3 на созревание дендритных клеток и влияние этого созревания на пролифераци. и дифференцировкe в Th1 или Th2 у пациентов с алле