Характер дослідження ряду біохімічних показників у сироватці крові та структури деяких ділянок геному 4-ї і 5-ї хромосом лейкоцитів великої рогатої худоби, інфікованої вірусом лейкозу. Аналіз рівня глюкози та вмісту мікроелементів у піддослідних тварин.
Аннотация к работе
Проблема ліквідації лейкозу великої рогатої худоби та використання позитивних в реакції імунодифузії (РІД) на лейкоз корів (інфікованих вірусом лейкозу) для відтворення залишається однією з найбільш актуальних. Крім того, вірус лейкозу належить до мутагенних агентів: частка клітин із структурними хромосомними абераціями та відносна кількість анеуплоїдних клітин у інфікованої вірусом лейкозу великої рогатої худоби значно вищі, ніж у здорових тварин (Мандигра М.С., 2000). Дисертаційна робота виконувалась згідно державного завдання в Інституті ветеринарної медицини УААН "Вивчення впливу патогенів на генетичний апарат тваринних клітин та розробка методів їх корекції при дії інфекційних, технологічних та екологічних факторів" (період виконання - 1996-1998 рр.), № держреєстрації - 0197 U O12751, в якій автор досліджував дію вірусу лейкозу на ділянки геному великої рогатої худоби. Метою дисертаційної роботи було дослідження впливу вірусу лейкозу великої рогатої худоби на біохімічний профіль крові і геном лімфоцитів. Для досягнення мети необхідно було вирішити наступні завдання: - дослідити ряд біохімічних показників (вміст загального білку і окремих білкових фракцій, вітаміну А в сироватці крові, глюкози, мікроелементів (міді, цинку, заліза, марганцю, кобальту) у крові інфікованої вірусом лейкозу великої рогатої худоби та неінфікованих тварин, а також мікроелементний склад кормів;Наведені у таблиці 1 дані свідчать про те, що вміст загального білку у сироватці крові великої рогатої худоби, інфікованої вірусом лейкозу, на початку і наприкінці стійлового періоду був відповідно у 1,14 і 1,22 рази більший (Р<0,001), ніж у тварин контрольної групи. У сироватці крові тварин дослідної групи на початку стійлового періоду разом з більшим загальним вмістом білків виявлено менший вміст альбумінів і альфа-глобулінів (Р <0,01) та вищий вміст гама-глобулінів (Р <0,001), ніж у сироватці крові тварин контрольної групи (рис.1). Наприкінці стійлового періоду різниці у співвідношенні білкових фракцій у сироватці крові корів дослідної групи порівняно до корів контрольної групи, подібні до різниць, виявлених на початку стійлового періоду, що свідчить про звязок між стадією захворювання і синтезом сироваткових білків у великої рогатої худоби. Так, вміст загального білка в сироватці крові великої рогової худоби дослідної групи наприкінці стійлового періоду був більший, ніж у сироватці крові корів контрольної групи в 1,22 рази (Р <0,01). Так, наприкінці стійлового періоду вміст заліза у крові великої рогатої худоби, інфікованої вірусом лейкозу, був менший в 1,92 рази (Р <0,01), міді - в 1,75 рази (Р <0,01), кобальту - в 2,05 рази (Р <0,001), ніж у тварин контрольної групи (Р <0,001).Проведено дослідження метаболічного профілю крові і структури окремих ділянок ДНК у локусах MAF-50 і BM-315 хромосом № 4 і № 5 у лейкоцитах великої рогатої худоби, інфікованої вірусом лейкозу, на різних стадіях захворювання. Вміст вітаміну А в сироватці крові, глюкози і мікроелементів (міді, заліза, кобальту, цинку) у крові великої рогатої худоби, інфікованої вірусом лейкозу, значно менший (Р <0,05 - 0,001), ніж у неінфікованих корів. Вміст загального білка і гамма-глобулінів у сироватці крові інфікованої вірусом лейкозу великої рогатої худоби значно більший (Р<0,001), а вміст альбумінів - менший (Р<0,01), порівняно до їх вмісту у сироватці крові здорових тварин. Відношення альбуміни/глобуліни в сироватці крові великої рогатої худоби, інфікованої вірусом лейкозом, на початку стійлового періоду було меншим в 1,40 рази (Р<0,001), а в кінці стійлового періоду - в 1,60 рази (Р<0,001), ніж у сироватці крові неінфікованих тварин. Рекомендації для практичних лабораторій ветеринарної медицини України, науково-дослідних інститутів та інших ветеринарних закладів, які використовують в своїй роботі метод молекулярно-генетичних досліджень ПЛР: "Методичні рекомендації по організації та проведенню робіт у лабораторіях, які використовують метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР)" Розробники А.М.
План
2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Вывод
Вміст загального білка і окремих білкових фракцій у сироватці крові великої рогатої худоби, інфікованої вірусом лейкозу. З наявних у літературі даних відомо, що у корів, хворих на лейкоз, змінюється вміст загального білка і співвідношення окремих білкових фракцій у сироватці крові. Ступінь цих змін залежить від ряду факторів: стадії захворювання, годівлі і утримання. При аналізі отриманих результатів ми не виявили звязку між змінами вмісту окремих мікроелементів і змінами білкового складу сироватки крові великої рогатої худоби, а також даних про вплив стадії захворювання тварин на вказані зміни. Тому окремий етап дисертаційної роботи становило порівняльне дослідження загального вмісту білків і вмісту окремих фракцій у сироватці крові здорових і хворих на лейкоз тварин.
Наведені у таблиці 1 дані свідчать про те, що вміст загального білку у сироватці крові великої рогатої худоби, інфікованої вірусом лейкозу, на початку і наприкінці стійлового періоду був відповідно у 1,14 і 1,22 рази більший (Р<0,001), ніж у тварин контрольної групи.
У сироватці крові тварин дослідної групи на початку стійлового періоду разом з більшим загальним вмістом білків виявлено менший вміст альбумінів і альфа-глобулінів (Р < 0,01) та вищий вміст гама-глобулінів (Р < 0,001), ніж у сироватці крові тварин контрольної групи (рис.1). Загалом альбуміново - глобулінове відношення у сироватці крові тварин дослідної групи було в 1,40 рази менше, ніж у сироватці крові корів контрольної групи (Р < 0,001).
Таблиця 1 - Вміст загального білка в сироватці крові великої рогатої худоби, інфікованої вірусом лейкозу (M±m, г/л, n=10)
Групи тварин Загальний білок
Початок стійлового періоду Кінець стійлового періоду
Дослідна 86,5±0,14*** 88,3±0,64***
Контрольна 76,0±0,19 72,7±0,26
Примітка. Тут і надалі *- Р < 0,05; ** - Р < 0,01; *** - Р < 0,001.
Наприкінці стійлового періоду різниці у співвідношенні білкових фракцій у сироватці крові корів дослідної групи порівняно до корів контрольної групи, подібні до різниць, виявлених на початку стійлового періоду, що свідчить про звязок між стадією захворювання і синтезом сироваткових білків у великої рогатої худоби. Так, вміст загального білка в сироватці крові великої рогової худоби дослідної групи наприкінці стійлового періоду був більший, ніж у сироватці крові корів контрольної групи в 1,22 рази (Р < 0,01).
Вміст альбумінів у сироватці крові корів дослідної групи наприкінці стійлового періоду був у 1,31 рази менший (Р < 0,01), а вміст гама-глобулінів в 1,42 рази більший (Р < 0,01) (рис. 2), ніж у тварин контрольної групи. З цих даних випливає, що інфікування великої рогатої худоби вірусом лейкозу приводить до підвищення синтезу імунних білків у клітинах білої крові. Різниці у вмісті альфа- і бета-глобулінів у сироватці крові корів дослідної групи, порівняно до корів контрольної групи, при цьому виражені незначною мірою (Р< 0,5). Коефіцієнт А/Г у сироватці крові тварин дослідної групи на початку стійлового періоду був менший в 1,4 рази (Р < 0,001), а наприкінці - в 1,6 рази (Р < 0,01), ніж у тварин контрольної групи. З цих даних випливає, що на ступінь зміни складу вмісту окремих фракцій сироваткових білків у корів протягом стійлового періоду впливає або стадія захворювання, або зниження поживної і біологічної цінності кормів.
Рівень глюкози в крові піддослідних тварин. Проведені дослідження показали, що інфікування великої рогатої худоби вірусом лейкозу приводить до значного порушення обміну вуглеводів у її організмі. Так, вміст глюкози в крові тварин дослідної групи на початку стійлового періоду був в 1,75 рази менший (Р< 0,01), ніж у крові тварин контрольної групи (рис.3). Ці данні заслуговують на увагу у звязку з важливим значенням глюкози у субстратному забезпеченні енергетичних процесів у клітинах крові, центральної нервової системи, серцевого і скелетних мязів (Янович В.Г., Сологуб Л.І., 2000).
Аналогічної різниці у вмісті глюкози в крові корів дослідної групи, порівняно до корів контрольної групи, виявлені також у кінці стійлового періоду. Отже, в організмі великої рогатої худоби, інфікованої вірусом лейкозу, порушуються біохімічні механізми регуляції гомеостазу глюкози, в основі якого лежить, з одного боку, її синтез у печінці, а з іншого використання моносахаридів у тканинному метаболізмі.
Вміст вітаміну А в сироватці крові піддослідних тварин. Для виявлення змін в обміні вітаміну А в організмі інфікованої вірусом лейкозу великої рогатої худоби визначали його вміст у сироватці крові.
Проведенні дослідження показали (рис. 4), що рівень вітаміну А в сироватці крові тварин дослідної групи на початку стійлового періоду був в 1,12 рази менший, ніж у сироватці крові тварин контрольної групи (Р < 0,5 ). Наприкінці стійлового періоду вміст вітаміну А в сироватці крові тварин дослідної групи був в 1,76 рази менший, ніж у сироватці крові тварин контрольної групи (Р < 0,01), що свідчить про різке зменшення запасів вітаміну А в печінці інфікованих тварин, внаслідок чого його рівень у сироватці крові знижується. Причиною цього може бути посилення вільнорадикальних процесів в організмі тварин при прогресуванні захворювання. Ці дані заслуговують на увагу у звязку з тим, що при зменшенні рівня вітаміну А в організмі великої рогатої худоби, порушується білковий обмін (Вальдман А.Р. и др., 1993). У регуляції обміну білків в організмі тварин важливу роль відіграє ретинол-транспортуючий білок, який відноситься до альфа-глобулінової фракції.
Вміст мікроелементів у крові піддослідних тварин. Проведені дослідження показали, що вміст більшості досліджуваних мікроелементів у крові інфікованої великої рогатої худоби був значно менший, ніж у не інфікованої. Зокрема, на початку стійлового періоду вміст заліза в крові тварин дослідної групи був менший в 1,62 рази (Р<0,01), міді - в 1,77 рази (Р<0,01), кобальту - в 2,38 рази (Р<0,01), ніж у крові тварин контрольної групи (табл.2). Різниці у вмісті цинку і марганцю в крові тварин дослідної групи порівняно до тварин контрольної групи при цьому були невірогідні (Р < 0,5).
Аналогічні різниці у вмісті заліза, міді та кобальту в крові великої рогатої худоби дослідної групи порівняно з контрольними тваринами виявлені і наприкінці стійлового періоду (табл. 2). Так, наприкінці стійлового періоду вміст заліза у крові великої рогатої худоби, інфікованої вірусом лейкозу, був менший в 1,92 рази (Р < 0,01), міді - в 1,75 рази (Р < 0,01), кобальту - в 2,05 рази (Р < 0,001), ніж у тварин контрольної групи (Р < 0,001). Вміст цинку в крові тварин дослідної групи був менший, ніж у крові тварин контрольної групи в 1,5 рази (Р < 0,01). Різниці у вмісті марганцю в крові тварин дослідної групи порівняно до тварин контрольної групи не вірогідні (Р < 0,5).
Таблиця 2 - Вміст мікроелементів у цільній крові великої рогатої худоби, інфікованої вірусом лейкозу (M±m, n=10)
Мікроелемент Групи тварин
Початок стійлового періоду Кінець стійлового періоду
Контрольна група Дослідна група Контрольна група Дослідна група
З аналізу наведених у таблиці 2 даних видно, що вміст більшості досліджуваних мікроелементів в крові великої рогатої худоби дослідної групи протягом стійлового періоду зменшується: заліза - в 1,25 рази (Р < 0,05), кобальту - в 1,16 рази (Р < 0,05), цинку - в 1,17 рази (Р < 0,5). Вміст міді і марганцю в крові великої рогатої худоби протягом стійлового періоду зменшується значно менше (Р < 0,5 ).
З одержаних результатів випливає, що вміст майже всіх досліджуваних мікроелементів в крові великої рогатої худоби протягом стійлового періоду зменшується, а ступінь цього зменшення у тварин дослідної групи виражений більшою мірою, ніж у тварин контрольної групи. Ці зміни, як показали проведені нами дослідження, обумовлені зменшенням вмісту мікроелементів у раціоні тварин. Так, на початку стійлового періоду забезпеченість великої рогатої худоби досліджуваними мікроелементами становила: залізом - 88,90%, кобальтом - 56,69%, марганцем - 46,25%, міддю - 90,10%, цинком - 91,14%. Наприкінці стійлового періоду забезпеченість великої рогатої худоби становила залізом - 68,32%, кобальтом - 18,98%, марганцем - 33,46%, міддю - 73,80%, цинком - 51,23%. Загалом, як випливає з наведених результатів, забезпеченість досліджуваного поголівя мікроелементами протягом стійлового періоду зменшилася: залізом - в 1,3 рази, міддю - в 1,22, кобальтом - в 3, цинком - в 1,78, марганцем - в 1,38 рази.
Аналіз локусів MAF-50 та ВМ-315 лейкоцитів піддослідних тварин методом ПЛР. Вірусні інфекції, зокрема вірус лейкозу великої рогатої худоби, відіграють ключову роль у процесах мутагенезу, в тому числі у пухлинній трансформації клітини. Включення онкогенного вірусу в геном клітини-господаря викликає його зміни і пошкодження. Зміни генетичного апарату лімфоцитів відіграють певну роль у подальшому розвитку патологічної трансформації цих клітин у процесі розвитку захворювання при лейкозі великої рогатої худоби. Вже на початковій фазі дії вірусу лейкозу на велику рогату худобу відбувається взаємодія вірусу з ДНК лімфоцитів, що приводить до її змін і пошкоджень.
З метою подальшого вивчення ролі цих змін у патогенезі захворювання, використовуючи дані банку генів, ми підібрали специфічні праймери (GENBANK Seguences M7737 і GENBANK Seguences G18514) з нуклеотидною послідовністю окремих ділянок геному соматичних клітин великої рогатої худоби, а саме ділянки високополіморфних локусів MAF-50 і ВМ-315. При цьому ми визначили місце локалізації локусу MAF-50 в геномі соматичних клітин великої рогатої худоби на хромосомі № 4. Було встановлено, що цей локус знаходиться між локусами ВМ-1260 та RM-067 (рис. 5). Кількість алелей в локусі MAF-50 - 8, розмір алелей від 152 до 166 пар нуклеотидів (п.н.). Синоніми локусу MAF-50 - MAF-050, DU-13S3, OARMAF-50.
При проведенні ПЛР (полімеразної ланцюгової реакції) у 20 зразках лейкоцитів, одержаних від великої рогатої худоби контрольної і дослідної груп, встановлено, що спектри локусів MAF-50 і BM-315 у зразках лейкоцитів на обох етапах дослідження не відрізняються між собою. Виключення становить одна тварина, в якої у зразках лейкоцитів при повторному дослідженні виявлені зміни в алельному спектрі в порівнянні з першим дослідженням в обох локусах - MAF-50 і BM-315. Зокрема, в локусі MAF-50 встановлено появу нових алельних варіантів розміром 166 пар нуклеотидів (при встановленому розмірі алелей від 152 до 166 п.н.), у локусі BM-315 - зникнення алеля розміром 152 п.н. та появу нових алельних варіантів розміром 158 і 162 п.н.
Поява нових алельних варіантів у локусах MAF-50 і BM-315 та зникнення виявлених раніше алельних варіантів свідчить про мутаційні зміни в геномі клітин-попередників лейкоцитів. Можна припустити, що під час другого дослідження крові у великої рогатої худоби дослідної групи існувало дві популяції лейкоцитів, що відрізнялися за нуклеотидним складом вказаних локусів.
В результаті досліджень встановлено, що оцінка геному інфікованої вірусом лейкозу великої рогатої худоби за двома високополіморфними локусами, чутливими до дії мутагенних факторів, проведена на такій кількості тварин, не дозволяє повною мірою оцінити кількісну сторону мутаційного процесу в геномі соматичних клітин. Більш обєктивна оцінка може бути проведена при аналізі декількох локусів геному соматичних клітин великої рогатої худоби, що досягається RAPD-PCR аналізом, який був застосований нами у подальших дослідженнях.
Аналіз поліморфних локусів за допомогою RAPD-PCR методу. Новий метод молекулярно-генетичних досліджень - ПЛР з довільними праймерами ( RAPD-PCR) при аналізі окремих ділянок геному соматичних клітин великої рогатої худоби, інфікованої вірусом лейкозу, застосований нами вперше. RAPD-PCR метод широко застосовується в генетичних дослідженнях при клонуванні генів, встановленні спадковості, визначенні філогенетичного звязку між видами, у селекційних програмах. Цей метод не вимагає попереднього знання нуклеотидної послідовності в геномі і дозволяє дослідити велику кількість високополіморфних локусів.
При проведенні RAPD-PCR аналізу з метою стандартизації результатів досліджень геному тварин дослідної і контрольної груп був застосований маркер довжини нуклеотидних пар ?/psti (120-2556 п.н.).
У результаті проведених досліджень (початок стійлового періоду - кінець стійлового періоду) виявлені індивідуальні зміни у спектрі RAPD-фрагментів, які свідчать про зміни геному соматичних клітин великої рогатої худоби, інфікованої вірусом лейкозу. У тварин дослідної групи, інфікованої вірусом лейкозу, в порівнянні з тваринами контрольної групи кількість таких змін у RAPD-спектрі в середньому була більша (табл. 3).
Зміни в окремих ділянках геному свідчать про мутаційний процес у соматичних клітинах великої рогатої худоби, інфікованої вірусом лейкозу. До таких змін можуть належати точкові мутації, а також інерції, до яких можна віднести включення геному провірусу лейкозу в геном соматичних клітин інфікованих тварин. Нами вирахувана частка смуг, що не співпадає, у сумі всіх смуг та розташування смуг у RAPD-спектрах, визначених протягом періоду досліджень крові. Різниця між дослідною і контрольною групами тварин у частці смуг RAPD-спектрів при першому і другому дослідженні крові тварин дослідної і контрольної груп вірогідна (Р < 0,05).
Таблиця 3 - Результати RAPD-PCR-аналізу досліджуваної великої рогатої худоби
Показники № дослідних тварин
Контрольна група Дослідна група
1 2 3 1 2 3 4 5 6
Кількість смуг у RAPD спектрі при 1-му дослідженні лейкоцитів 12 13 10 14 21 5 15 7 13
Кількість смуг у RAPD спектрі при 2-му дослідженні лейкоцитів 16 13 14 16 16 12 10 8 12
Кількість смуг, що не співпадають 4 2 4 5 7 7 5 5 11
Сума смуг спектру при 1-му і 2-му дослідженнях 28 26 24 30 37 17 25 15 25
Частка смуг, що не співпадають, порівняно до суми 0,14* 0,08* 0,17* 0,17* 0,19* 0,41* 0,20* 0,33* 0,44*
Використаний нами підхід до аналізу змін в окремих ділянках геному соматичних клітин великої рогатої худоби, інфікованої вірусом лейкозу, дозволяє статистично обґрунтувати вплив певних факторів (у даному випадку лейкозної інфекції ) на геном соматичних клітин при дослідженні невеликих по кількості груп цих тварин.1. Проведено дослідження метаболічного профілю крові і структури окремих ділянок ДНК у локусах MAF-50 і BM-315 хромосом № 4 і № 5 у лейкоцитах великої рогатої худоби, інфікованої вірусом лейкозу, на різних стадіях захворювання.
2. Вміст вітаміну А в сироватці крові, глюкози і мікроелементів (міді, заліза, кобальту, цинку) у крові великої рогатої худоби, інфікованої вірусом лейкозу, значно менший (Р < 0,05 - 0,001), ніж у неінфікованих корів.
3. Вміст загального білка і гамма-глобулінів у сироватці крові інфікованої вірусом лейкозу великої рогатої худоби значно більший (Р<0,001), а вміст альбумінів - менший (Р<0,01), порівняно до їх вмісту у сироватці крові здорових тварин.
4. Відношення альбуміни/глобуліни в сироватці крові великої рогатої худоби, інфікованої вірусом лейкозом, на початку стійлового періоду було меншим в 1,40 рази (Р<0,001), а в кінці стійлового періоду - в 1,60 рази (Р<0,001), ніж у сироватці крові неінфікованих тварин.
5. У результаті застосування методу полімеразної ланцюгової реакції виявлені зміни окремих ділянок ДНК у локусах MAF-50 (хромосома № 4) та ВМ-315 (хромосома № 5) лейкоцитів великої рогатої худоби, інфікованої вірусом лейкозу.
6. RAPD-PCR аналіз у нашій модифікації більш інформативний при малих вибірках тварин у порівнянні з існуючими методами оцінки впливу мутагенних факторів.
7. У інфікованої вірусом лейкозу великої рогатої худоби частота індивідуальних змін в геномі лейкоцитів за спектрами досліджуваних RAPD-фрагментів значно вища (Р < 0,05), ніж у неінфікованих тварин.
ПРОПОЗИЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ
Під час виконання дисертаційної роботи розроблені: 1. Рекомендації для практичних лабораторій ветеринарної медицини України, науково-дослідних інститутів та інших ветеринарних закладів, які використовують в своїй роботі метод молекулярно-генетичних досліджень ПЛР: "Методичні рекомендації по організації та проведенню робіт у лабораторіях, які використовують метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР)" Розробники А.М. Головко, О.М. Дерябін, З.Р. Троценко, Р.А. Голубець, В.О. Гарматюк, В.В. Кацімон, Т.Р. Левицький. Затверджені Державним департаментом ветеринарної медицини України від 9.01.2002 р. № 15-14/1. - К.: - 2002. - 18 с.
2. Для науково-дослідних інститутів ветеринарної медицини і науково-дослідних інститутів тваринництва України "Методичні вказівки по оцінці дії вірусу лейкозу великої рогатої худоби на геном соматичних клітин тварин методом полімеразної ланцюгової реакції з довільними праймерами (RAPD-PCR)" Розробники: Р.А. Голубець; В.М. Балацький. Затверджених Державним департаментом ветеринарної медицини України від 10.07.2001 р. № 15-14/204. - К.: - 2001. - 10 с.
Список литературы
1. Голубець Р.А. Вивчення біохімічних показників крові у РІД-позитивної великої рогатої худоби // Вет. медицина: Міжвід. тематич. наук. зб. - Харків, 2000. - Вип. 77. - С. 96-99.
2. Клестова З.С., Балацький В.М., Голубець Р.А. Виявлення мутацій у великої рогатої худоби позитивно реагуючих у РІД на лейкоз // Науковий вісник Національного аграрного університету: Зб.наук.праць. - К.: НАУ. - 2001. - № 36. - С. 143-146. (Дисертант провів експериментальні дослідження, відбір контрольної та дослідної груп тварин, постановку молекулярно-генетичних реакцій ПЛР та RAPD-PCR, статистичну обробку, аналіз і узагальнення отриманих даних).
3. Голубець Р.А., Балацький В.М. Вивчення змін у генетичному апараті великої рогатої худоби, яка позитивна у РІД на лейкоз, методом полімеразної ланцюгової реакції // Ветеринарна медицина України. - 2000. - № 4. - С. 18-19. (Дисертант провів вивчення змін в геномі великої рогатої худоби, виконав експериментальні дослідження, статистичну обробку, аналіз і узагальнення отриманих даних).
4. Клестова З.С., Голубець Р.А. Молекулярні механізми дії вірусу лейкозу великої рогатої худоби // Науковий вісник Львівської державної академії ветеринарної медицини: Зб. наук. праць. - Львів. - 2003. - С. 90-94. (Дисертант провів узагальнення наукових даних про дію вірусу лейкозу на геном великої рогатої худоби, а також представив свої данні, що свідчать про зміни в алельному спектрі в локусах MAF-50 та BM-315 в великої рогатої худоби інфікованої вірусом лейкозу).
5. Методичні вказівки по оцінці дії вірусу лейкозу великої рогатої худоби на геном соматичних клітин тварин, методом полімеразної ланцюгової реакції з довільними праймерами (RAPD-PCR). // Р.А. Голубець., В.М. Балацький. (Затвердженні Головою Державного департаменту ветеринарної медицини Мінагрополітики України від 10.07.2001 р. № 15-14/204). - К.: - 2001 р. - 10 с. (Дисертант розробив основні положення, проводив експериментальні дослідження та узагальнив отримані результати).
6. Методичні рекомендації по організації та проведенню робіт у лабораторіях, які використовують метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР)./Розробники: А.М.Головко, О.М.Дерябін, З.Р.Троценко, Р.А. Голубець, В.О. Гарматюк, В.В.Кацимон, Т.Р.Левицький. (Затверджено науково-технічною радою Державного департаменту ветеринарної медицини Мінагрополітики України, протокол № 1 від 25 грудня 2001р.). - К.: - 2001 р. - 13 с. (Дисертант приймав участь у формулюванні основних положень, що випливають з результатів проведених досліджень).