Застосування реакції пірилоціанінів з амінами в синтезі кон’югатів піридоціанінів з біомолекулами - Автореферат

Молекулярні зонди, що містять ковалентно приєднану молекулу ціанінового барвника, успішно застосовуються для проведення полімеразної ланцюгової реакції, детекції НК в розчинах та гелях, для локалізації рецепторів у клітинах. Хоча реакція пірилоціанінів з амінами добре відома, систематичних досліджень взаємодії пірилоціанінів з біомолекулами не проводилось. Мета роботи полягала в розробці нового синтетичного методу для конюгації пірилоціанінів з біомолекулами, в синтезі та дослідженні спектрально-люмінесцентних властивостей модельних конюгатів ціанінових барвників з олігонуклеотидами та білками. · дослідити кінетику реакції пірилоціанінів з низкою амінокислот, вивчити вплив природи амінокислоти, температури, лужності середовища та природи буфера і розчинника на перебіг реакції; · синтезувати модельні конюгати ціанінових барвників з олігонуклеотидами та білками, дослідити їхні спектрально-люмінесцентні властивості у вільному стані та при взаємодії з біомолекулами.Наведено огляд літератури про механізм реакції солей пірилію з первинними амінами, акцентовано увагу на можливих побічних реакціях. У результаті проведених досліджень було встановлено, що конюгацію з аміноакілмодифікованими олігонуклеотидами краще проводити при температурі 50°С у 0,1М ТЕАА буфері, насиченому триетиламіном (РН 12). Використання цієї реакції для конюгації ціанінових барвників з білками та пептидами вимагає більш детального вивчення взаємодії пірилоціанінів з амінокислотами. Так, у ТЕАА буфері з РН 12 реакція повністю проходить з усіма амінокислотами при кімнатній температурі менше, ніж за 24 години. Встановлено, що на реакційну здатність g-пірилієвих барвників щодо амінокислот впливають природа азотовмісного гетероциклу молекули ціаніну та стерична доступність гетероциклічного атома кисню. g-Пірилоціаніни з бензтіазольними та індоленільними ядрами можуть бути застосовані для конюгації з біомолекулами, у той час як з бензоксазольними аналогами провести реакцію у водному розчині не вдалося.У дисертації наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, що виявляється у вивченні та застосуванні реакції пірилоціанінів з амінами для флуоресцентного мічення аміноалкілолігонуклеотидів та білків. Досліджено час перебігу реакції пірилоціанінів з різними амінокислотами, вивчено вплив природи амінокислоти, температури, РН середовища та природи буфера і розчинника на перебіг реакції.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

1. У дисертації наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення наукової задачі, що виявляється у вивченні та застосуванні реакції пірилоціанінів з амінами для флуоресцентного мічення аміноалкілолігонуклеотидів та білків.

2. Досліджено час перебігу реакції пірилоціанінів з різними амінокислотами, вивчено вплив природи амінокислоти, температури, РН середовища та природи буфера і розчинника на перебіг реакції.

3. Показано, що за запропонованих умов реакції конюгації пірилоціанінів з біомолекулами не відбуваються побічні реакції з екзоциклічними аміногрупами нуклеотидних основ та бічними функціональними групами амінокислот.

4. На основі отриманих даних про вплив будови пірилоціанінів на перебіг реакції з аміногрупою біомолекул та результатів спектрально-люмінісцентних досліджень запропоновано низку пірилоціанінів для конюгації з біомолекулами.

5. Синтезовано модельні конюгати ціанінових барвників з олігонуклеотидами та білками, досліджено спектрально-люмінісцентні властивості отриманих конюгатів.

6. Запропоновано для практичного використання зручний метод конюгації пірилоціанінів з біомолекулами.

1. Yarmoluk S.M., Kostenko O.M., Kornushyna O.S., Dubey I.Y. Interaction of cyanine dyes with nucleic acids. 4. Efficient 5’-fluorescent labelling of oligonucleotides with monomehtyne pyrilium cyanine dye, Cyan 39 // Біополімери і клітина.- 1998.- 14, №1.- С.82-86.

2. Sergiy M. Yarmoluk, Alexander M. Kostenko, Igor Y. Dubey. Interaction of cyanine dyes with nucleic acids. IXX. New method for the covalent labeling of oligonucleotides with pyrylium cyanine dyes // Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters.- 2000.- 10.- Р.2201-2204.

3. Костенко О.М., Дмітрієва С.Ю., Ярмолюк С.М. Білки та ціанінові барвники. 2. Застосування реакції пірилієвих барвників з амінами для ковалентного мічення амінокислот і пептидів // Біополімери і клітина.- 2001.- 17, №1.- С. 80 - 84.

4. Костенко О.М., Дмітрієва С.Ю., Толмачов О.І., Курдюков В.В., Ярмолюк С.М. Мічення амінокислот і пептидів поліметиновими пірилієвими барвниками // Укр. хім. журнал.- 2002.- 68, № 1.- С. 39-44.

5. O.M. Kostenko, S.Y. Dmitrieva, O.I. Tolmachev, S.M. Yarmoluk. New Approach for Fluorescent Peptide Labeling with Pyrylium Cyanine Dyes // Journal of Fluorescence.- 2002.-12, No. 2.- Р. 173 - 175.

6. Ярмолюк С.М., Лосицький М.Ю., Ковальська В.Б., Томачинський С.М., Огульчанський Т.Ю., Костенко О.М., Курдюков В.В., Толмачов О.І. Взаємодія ціанінових барвників з нуклеїновими кислотами. Новий (піридо)(тіо)триметинціаніновий барвник CCYAN40 для флуоресцентного мічення олігонуклеотидів // Біополімери і клітина.- 2002.- 18, №4.- С. 340 - 346.

7. Sergiy M. Yarmoluk, Alexander M. Kostenko, Igor Y. Dubey. New approach toward oligonucleotide labeling with cyanine dyes // 8th Europ. Conf. Spectroscop. Biolog. Molec.(29 Aug. -2 Sept. 1999, Enschede, Netherlands) Р. 9 -10.

8. Kostenko O.M., Dmitrieva S.Y., Tolmachev O.I., Yarmoluk S.M. New approach for fluorescent peptide labeling with pyrylium cyanine dyes // 7th Conference on Methods and Application of Fluorescence (Amsterdam, September 16-19, 2001) Р. 99.

9. Yarmoluk S.M., Kovalska V.B., Kocheshev I.V., Kostenko O.M., Dubey I.Y. Oligonucleotides labeled with pyridinium cyanine dyes: spectral properties and integration into PCR System // Fifth International Symposium on Functional ?-Electron Systems, May 30 -June 4, 2002, Ulm/Neu-Ulm, Germany, P.119.

10. O. M. Kostenko, S. Y. Dmitrieva, S. M. Yarmoluk. New approach for fluorescent peptide labelling with cyanine dyes // In: Proc. Scientific conference “Biotechnology and Environment 2001”, Zagreb, Croatia, February 19-22, 2001, Р.51.

11. Костенко О.М., Дмітрієва С.Ю., Ярмолюк С.М. Застосування реакції пірилієвих барвників з амінами для ковалентного мічення амінокислот та пептидів // Міжнародна конференція “Хімія азотовмісних гетероциклів” (Харків, 2 - 5 жовтня 2000 р.), С.230.

12. Костенко О.М., Дмітрієва С.Ю., Ярмолюк С.М. Флуоресцентне мічення пептидів пірилієвими ціаніновими барвниками // ХІХ Українська конференція з органічної хімії (Львів, 10 -14 вересня 2001 р.), С.168.

13. Костенко О.М., Дмітрієва С.Ю. Застосування реакції триметинпірилоціанінів з амінами для ковалентного мічення амінокислот і пептидів // V Конференція молодих учених південного регіону України (Одеса, 3-4 жовтня 2002 р.), С. 33.