Застосування методу біохемілюмінесценції в токсикологічних дослідженнях - Автореферат

Метод дослідження біохемілюмінесценції (БХЛ) середовищ організму виступає як неспецифічний скринінговий тест, що дозволяє оцінити компенсаторні можливості організму при впливі токсикантів, зокрема, хімічного походження, контролювати стан фізіологічних та метаболічних процесів, виявити показники передхвороби. Вивчення методом БХЛ функціонального стану системи вільнорадикального окислення належить до методів визначення інтегрально-кількісних оцінок токсичної дії на організм людини чинників виробничого середовища та довкілля (Стежка В.А., 1999; Фархутдинов У.Р., 1995; Шакиров Д.Ф., 1999). Недостатньо визначена роль біофізичних методів у виявленні тестових показників структурно-метаболічних порушень в організмі людини при дії токсичних хімічних чинників, що використовуються в моніторингу „Навколишнє середовище - здоровя населення”. Для досягнення цієї мети в роботі вирішувались такі задачі: Вивчити можливість застосування методу біохемілюмінесценції в оцінці ступеня важкості токсифікації організмів експериментальних тварин новими синтезованими ксенобіотиками, а також у виявленні органів, систем і функцій організму, що найбільш ушкоджуються при їхній дії. В оцінці ступеня важкості токсифікації організму експериментальних тварин, ступеня кумуляції ксенобіотиків, виявленні органів-мішеней використовувався метод БХЛ сироватки крові та гомогенатів внутрішніх органів.Для визначення взаємозвязку між ступенем кумуляції ксенобіотиків та параметрами динаміки інтенсивності біохемілюмінесценції будували динамічні криві інтенсивності БХЛ сироватки крові тварин, токсифікованих дозами 1/5 і 1/10 ДЛ50. Для виявлення алергійної дії ксенобіотиків досліджували звязок між інтенсивністю БХЛ сироватки крові експериментальних тварин та показниками імунологічних тестів: реакції специфічної агломерації лейкоцитів (РСАЛ), реакції специфічного лізису лейкоцитів (РСЛЛ), реакції специфічного ушкодження базофілів (РСУБ) (Алексєєва О.Г., Дуєва Л.А., 1978). Після токсифікації краун-ефіром 12 краун-4 інтенсивність світіння ХЛ реєстрували через 12; 24; 36; 48; 60 хвилин; неонолом АФ 9-12 - через 1; 3; 6; 9; 12 годин; метилцелозольвом (МЦ) - через 1,5; 3; 6; 9; 12; 15 годин; простим поліефіром Л-402 - через 5, 10, 15, 20, 25 годин. Причому, варто звернути особливу увагу на той факт, що при впливі певних доз досліджуваних ксенобіотиків, інтенсивність Іеф мала приблизно одне й теж значення для всіх ксенобіотиків, що дозволяє виділити цей параметр як критеріально значущий, за яким ми й визначали ступінь інтоксикації: 1) абсолютно смертельний (при одержанні дози ДЛ100) інтенсивність (Іеф) БХЛ @ фоновим значенням інтенсивності (50?100 імп/с); 2) дуже важкий (при одержанні дози ДЛ50) - інтенсивність світіння (Іеф @300 імп/с) приблизно в 2 рази менше інтенсивності світіння контрольної групи тварин (Ік); 3) важкий (при одержанні дози ? ДЛ50) інтенсивність світіння (Іеф @600 імп/с) приблизно дорівнює інтенсивності світіння Ік; 4) середній (при одержанні дози 1/5 ДЛ50) - інтенсивність світіння (Іеф @900 імп/с) більше інтенсивності Ік приблизно в 1,5 рази; 5) легкий ступінь (при одержанні дози 1/10 ДЛ50) - інтенсивність світіння (Іеф @1500 імп/с) більше Ік приблизно в 2,3 рази. Виявлено, що динамічні криві біохемілюмінесценції характеризуються послідовними трьома фазами: 1) різке наростання світіння до максимальних значень за час tm (від 0 до tm); 2) різкий спад інтенсивності біохемілюмінесценції впродовж часу тс (від tm до тс), причому, tm tc відповідає середньому ефективному часу загибелі тварин (ЕТ50); 3) повільне зменшення інтенсивності до значень інтенсивності світіння в контрольній групі протягом часу тк*.Показано, що метод біохемілюмінесценції дозволяє адекватно оцінити кумулятивні та алергійні властивості, ступінь токсичності, граничні та недіючі дози ксенобіотиків; порушення взаємодії антиоксидантної та оксидантної систем; ступінь окислення хімічних речовин та їх гідролітичну стабільність у воді водяних обєктів, а також виявити органи, системи і функції організму, які найбільш ушкоджуються при токсифікації ксенобітиками. Встановлено, що цей метод дозволяє диференціювати ступені важкості інтоксикації ксенобіотиками організму експериментальних тварин за параметрами динаміки інтенсивності світіння. Показано чітку залежність параметрів динамічних кривих біохемілюмінесценції від ступеня токсичності ксенобіотиків. При збільшенні дози кожної з речовин збільшується tg a* спадаючих ділянок динамічних кривих біохемілюмінесценції, зменшуються час досягнення контрольних значень інтенсивності (тк), коефіцієнт токсичності (к) і світлосума світіння (Sk) за час тк. Встановлено, що використання методу біохемілюмінесценції дозволяє виявити органі-мішені для кожного досліджуваного ксенобіотика, які мають характерні тільки для них хемілюмінограми.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

1. Науково обґрунтована доцільність застосування методу біохемілюмінесценції в оцінці токсичної дії нових ксенобіотиків на організми людини та експериментальних тварин. Показано, що метод біохемілюмінесценції дозволяє адекватно оцінити кумулятивні та алергійні властивості, ступінь токсичності, граничні та недіючі дози ксенобіотиків; порушення взаємодії антиоксидантної та оксидантної систем; ступінь окислення хімічних речовин та їх гідролітичну стабільність у воді водяних обєктів, а також виявити органи, системи і функції організму, які найбільш ушкоджуються при токсифікації ксенобітиками.

2. Запропоновано новий кількісний підхід до аналізу та обробки експериментальних даних, отриманих за показниками спектрів біохемілюмінесценції сироватки крові лабораторних тварин. Встановлено, що цей метод дозволяє диференціювати ступені важкості інтоксикації ксенобіотиками організму експериментальних тварин за параметрами динаміки інтенсивності світіння. Розроблена класифікація рівнів важкості токсифікації тварин (абсолютно смертельний, дуже важкий, важкий, середній і легкий) за величиною інтенсивності світіння наприкінці середньо-ефективного часу ЕТ50 загибелі тварин. Показано чітку залежність параметрів динамічних кривих біохемілюмінесценції від ступеня токсичності ксенобіотиків. При збільшенні дози кожної з речовин збільшується tg a* спадаючих ділянок динамічних кривих біохемілюмінесценції, зменшуються час досягнення контрольних значень інтенсивності (тк), коефіцієнт токсичності (к) і світлосума світіння (Sk) за час тк.

3. Встановлено, що використання методу біохемілюмінесценції дозволяє виявити органі-мішені для кожного досліджуваного ксенобіотика, які мають характерні тільки для них хемілюмінограми. Найбільшу інтенсивність світіння при запалі тварин 12 краун-4 мають гомогенати головного мозку; неонолом АФ 9-12 - гомогенати печінки й нирок; під впливом лапроксидів Лд-703 і Лд-503 - гомогенати селезінки, тимусу, лімфатичних вузлів. Ці дані були підтверджені й результатами морфологічних досліджень.

4. Уперше запропоновані нові якісні та кількісні параметри динамічних кривих інтенсивності біохемілюмінесценції, які дозволяють виявити ступені кумуляції ксенобіотиків. Розроблена класифікація ступенів кумуляції ксенобіотиків за параметрами динамічних кривих (tg?, tm tc, tm), зокрема, таким, як час досягнення інтенсивності світіння сироватки крові токсифікованих тварин контрольних значень (тк).

5. Експериментально встановлено, що інтенсивність біохемілюмінесценції виступає як оціночний показник алергійної та шкіряно-резорбтивної дії ксенобіотиків при пероральній та нашкірній пробах. Показано, що метод БХЛ у порівнянні з імунологічними тестами (РСЛЛ, РСАЛ, РСУБ) має значно більшу чутливість виявлення впливу хімічних алергенів, ефектів сенсибілізації й установлення граничних доз у підгострих і хронічних експериментах, а також при оцінці ефекту проникнення речовин через неушкоджену шкіру.

6. Встановлено кореляційний звязок між інтенсивністю хемілюмінесценції, водяних розчинів ксенобіотиків та їхньою стабільністю з коефіцієнтом кореляції Ri = - 0,998. Розчини ксенобіотиків, які мають низькі рівні інтенсивності спонтанної й індукованої Н2О2 -ХЛ, є високо стабільними. Знайдено, що ступінь стабільності має логарифмічну залежність від величини дози ДЛ50. Значення інтенсивності індукованої та спонтанної хемілюмінесценції водяних розчинів ксенобіотиків є прогностичним критерієм оцінки стабільності ксенобіотиків до гідролітичного окислення та біологічної активності хімічних речовин.

7. Показано, що використані в роботі показники біохемілюмінесценції, фосфоресценції та електрокінетичних властивостей ядер клітин букального епітелію дозволяють дати комплексну оцінку впливу чинників виробничого середовища на організм робітників, виділити групи та фактори ризику, виступати як моніторингові.

Простые и макроциклические эфиры: научные основы охраны водных объектов: Монография / Жуков В.И., Попова Л.Д., Зайцева О.В., Кратенко Р.И., Антюфеева О.И. и др. - Х.: Торнадо, 2000. - 438 с. (Особистий внесок здобувача - проведення БХЛ досліджень при оцінці стану антиоксидантної системи, дії простих і макроциклічних ефірів на організм тварин, стану ВРО робочих хімічних виробництв; розділи 5, 7).

Зайцева О.В., Антюфеева О.И. Биохемилюминесценция в контроле кожно-резорбтивного действия новых групп поверхностно-активных веществ // Вісник проблем біології і медицини. - 2001. - Вып.1. - С. 104-109.

Рогозянская Л.М., Арсеньев А.В., Антюфеева О.И. Деякі методичні аспекти статистичної обробки медичної інформації у сучасних умовах // Експериментальна і клінічна медицина. - 2000. - № 4. - С. 133-135. (Особистий внесок здобувача полягає в обґрунтуванні обчислювальних програм з використанням сучасних статистичних пакетів, зокрема, регресійного аналізу).

Зайцева О.В., Жуков В.И., Антюфеева О.И., Щербань Н.Г., Нежина М.В. Прогнозирование безвредных уровней содержания новой группы поверхностно-активных веществ на основе алкилполифосфатов в воде водоемов // Довкілля та здоровя. - 2002. - № 3 (22). - С. 30-33. (Особистий внесок здобувача складається з визначення стабільності водних розчинів ксенобіотиків).

Зайцева О.В., Жуков В.И., Щербань Н.Г., Антюфеева О.И. Гигиеническая оценка иммунотоксичности и аллергоопасности группы эпоксидсодержащих гликолей в связи с проблемой их нормирования в водных экосистемах // Проблеми екології та медицини. - 2002. - Т. 6, № 5. - С. 3-7. (Особистий внесок здобувача - участь в обробці експериментальних даних та встановленні недіючої дози лапроксидів).

Антюфеева О.И. Эколого-гигиеническая регламентация некоторых простых полиэфиров в воде водоемов // Проблеми екології та медицини. - 2003.-Т.7, № 3-4. - С. 3-5.

Зайцева О.В., Антюфеева О.И., Жукова Н.В. Щербань Н.Г. Определение степени интоксикации экспериментальных животных по показателям динамики биохемилюминесценции // Проблеми екології та медицини. - 2004. - Т. 8, № 5-6. - С. 24-28. (Особистий внесок здобувача - безпосереднє виконання частини експериментальних досліджень, розрахунки та побудова всіх графіків динамічних кривих БХЛ, участь в обговоренні результатів та висновків експерименту).

Жуков В.И., Зайцева О.В., Антюфеева О.И. Связь параметров динамики биохемилюминесценции со степенью кумуляции ксенобиотиков // Експериментальна і клінічна медицина - 2005. - № 2 - С.51-56. (Особистий внесок здобувача складається із безпосереднього виконання частини експериментальних досліджень, розрахунків та побудови всіх графіків динаміки БХЛ, обговорення результатів та визначення висновків експерименту).

Антюфеева О.И. Влияние вредных факторов производства тормозных и гидравлических жидкостей на биологический возраст рабочих // Гигиена населенных мест: Сб. научн. тр. - К.: Полимед, 2001. - Вып. 38, Т.2.--- С. 458-460.

Зайцева О.В., Жуков В.И., Щербань Н.Г, Антюфеева О.И. Экспериментальное исследование по гигиенической регламентации в воде водоемов органических смесей на основе гликолей // Гігієна населених місць: Зб. н. пр. - К.: Полімед, 2002. - Вип. 40. - С. 82-86. (Особистий внесок здобувача складається з проведення біохемілюмінесцентних досліджень при регламентації ксенобіотиків).

Зайцева О.В., Щербань Н.Г, Жуков В.И., Антюфеева О.И. Гигиеническая и токсикологическая характеристика группы олигоэфиров на основе двухатомных спиртов в связи с санитарной охраной водоемов // Гігієна населених місць: Зб. н. пр. - К.: Полімед, 2002. - Вип. 39. - С. 97-101. (Особистий внесок здобувача полягає у здійсненні експериментів по визначенню стабільності ксенобіотиків у воді та їх шкіряно-резорбтивної дії методом БХЛ)

Зайцева О.В., Жуков В.І., Антюфєєва О. І. Хемілюмінесцентні методи в донозологічній оцінці стану здоровя робітників хімічного виробництва // Гігієна населених місць: Зб. н. пр. - К.: Полімед, 2003. - Вип. 41. - С. 180-184. (Особистий внесок здобувача полягає в обробці результатів досліджень, виконанні розрахунково-графічної роботи, аналізі результатів та висновків).

Зайцева О.В., Жуков В.І., Антюфєєва О. І., Брянцев О.М. Дослідження електрокінетичних властивостей ядер клітин буккального епітелію робітників хімічного виробництва // Гігієна населених місць: Зб. н. пр. - К.: Полімед, 2003. - Вип. 42. -С.170 - 172. (Особистий внесок здобувача - проведення експерименту, обробка результатів досліджень та виконування розрахунково-графічних робіт).

Пат. ua № 9990 України, МКИ G01N33/00. Спосіб визначення ступеня інтоксикації ксенобіотиками / Жуков В.И., Зайцева О.В., Антюфеева О.И., Жукова Н.В. - № u200504362; Заявл. 10.05.05; Опубл. 17.10. 05, Бюл. № 10. -3 с. (Особистий внесок здобувача полягає в виконанні частини експериментальних досліджень, участі в аналізі результатів та висновків експерименту).

Пат. ua № 9989 України, МКИ G01N33/00. Спосіб визначення ступеня кумуляції чужорідних хімічних сполук в організмі / Жуков В.И., Зайцева О.В., Антюфеева О.И., Жукова Н.В. - № u200504359; Заявл. 10.05.05; Опубл. 17.10. 05, Бюл. № 10. - 4 с. (Особистий внесок здобувача є виконання частини експериментальних досліджень, розрахунки та побудова всіх графіків динаміки БХЛ, участь в обговоренні результатів та висновків експерименту).

Антюфеева О.И. Оценка состояния здоровья рабочих химического производства с помощью хемилюминесцентных методов // Экология и здоровье человека. Охрана водного и воздушного бассейнов. Утилизация отходов: Сб. научн. тр. IX (ежегодной) международной научно-технической конференции (9-13 июня 2001 г.). - Щелкино - Харьков: УКРВОДГЕО, 2001. - С.193-195.

Антюфеева О.И., Зайцева О.В. Изучение степени токсичности и опасности некоторых видов поверхностно-активных веществ в воде водоемов // Сучасні проблеми науки та освіти: Матеріали 4-ї Міжнародної міждисциплінарної науково-практичної конференції (1-10 травня 2003 р.) - Ялта -Харків: Українська Асоціація „Жінки в науці та освіті”, Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, 2003. - С.50.

18. Жуков В.І., Зайцева О.В., Антюфєєва О.І., Бондаренко М.А., Арсенєв О.В., Московець М.А. Параметри динаміки біохемілюмінесценції як критерій ступеню кумуляції ксенобіотиків // Экология и здоровье человека. Охрана водного и воздушного бассейнов. Утилизация отходов: Сб. научн. тр ХІІІ. международной научно-технической конференции (9-13 июня 2003 г.), г. Алушта - Харьков: УКРВОДГЕО, 2005.- С. 370-375.

19. Зайцева О.В., Антюфєєва О.І., Бондаренко М.А., Рісованна Л.М., Проценко О.В. Оцінка ступеня інтоксикації експериментальних тварин по спектрах біохемілюмінесценції // Сучасні проблеми науки та освіти: Матеріали 6-ї Міжнародної міждисциплінарної науково-практичної конференції. (1-10 травня 2005 р.). - Алушта-Харків: Українська Асоціація „Жінки в науці та освіті”, Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна - 2005. - С.86.